沈鑫婷，姜秀杰，許慶鵬，張東杰*

（1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所 黑龍江省食品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黑龍江省全谷物營(yíng)養(yǎng)食品工程技術(shù)研究中心 哈爾濱 150086 2 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 黑龍江大慶 163000）

2 型糖尿病通常被稱(chēng)為非胰島素依賴(lài)型糖尿病，是一種以持續(xù)高血糖診斷為基礎(chǔ)的代謝性疾病[1]。對(duì)于糖尿病的治療可以防止一些破壞性的并發(fā)癥，然而，通常不能恢復(fù)到正常血糖或消除所帶來(lái)的不良后果[2]。其特點(diǎn)是由慢性高血糖驅(qū)動(dòng)的胰島素抵抗，通常通過(guò)血糖診斷[3]。它與基因或一些生活方式相關(guān)，到目前為止肥胖是最常見(jiàn)的風(fēng)險(xiǎn)因素[4]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO2016 年）的數(shù)據(jù)，2 型糖尿病占病例的90%～95%，而且?guī)资陙?lái)的迅速增長(zhǎng)一直是一個(gè)國(guó)際問(wèn)題[5]。目前治療糖尿病的常用降糖藥物雖具有較好的效果，但大多具有副作用[6]。開(kāi)發(fā)一種天然安全的藥物成為當(dāng)前研究糖尿病的重點(diǎn)，而來(lái)源于食品或植物中的天然活性成分因安全、健康、作用效果溫和的特點(diǎn)而備受青睞。

豆科植物被認(rèn)為是第二重要的人類(lèi)糧食作物，僅次于谷物（禾本科豆科），因?yàn)榕c谷物相比，它們營(yíng)養(yǎng)豐富、均衡，被稱(chēng)為“窮人的肉”[7-8]。綠豆，又名青小豆、菉豆、植豆等，在所有類(lèi)型的豆類(lèi)植物中，綠豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高[9-10]。有研究表明綠豆及其提取物具有許多其它潛在的健康益處，如降血糖、降血脂作用以及抗高血壓、抗癌、抗黑素生成、保護(hù)肝臟和免疫調(diào)節(jié)特性[11-16]。本研究利用黑龍江省特色綠豆資源作為多酚富集原料。與綠豆[17-19]相比，萌發(fā)和發(fā)酵的綠豆及其提取物具有更好的肝保護(hù)作用，而且發(fā)芽后綠豆的抗氧化活性也有所提高。發(fā)芽處理作為加工手段之一，可有效提高谷物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物活性成分含量，相比之下，當(dāng)綠豆經(jīng)發(fā)芽處理后，許多的大分子物質(zhì)會(huì)降解成為各種小分子物質(zhì)，更加利于人體的吸收，發(fā)芽綠豆比未發(fā)芽的綠豆含有更多的功能性物質(zhì)[20]，其中的酚酸和類(lèi)黃酮（包括牡荊素和異牡荊素）的總含量顯著增加，分別是生綠豆種子的4.5倍和6.8 倍[21-22]。酚類(lèi)物質(zhì)是人類(lèi)日常飲食中最重要的抗氧化劑[23]，具有降血糖、降血壓等作用。發(fā)芽綠豆多酚是以綠豆為原料，經(jīng)發(fā)芽處理后，采用超聲輔助乙醇提取法得到的具有生物活性的物質(zhì)，本試驗(yàn)前期已證明發(fā)芽綠豆多酚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，并表現(xiàn)出較好的體外降糖效果。而發(fā)芽綠豆多酚在小鼠體內(nèi)的降血糖效果以及對(duì)肝臟組織形態(tài)的影響未做深入研究。

本試驗(yàn)建立2 型糖尿病小鼠模型，對(duì)造模成功小鼠灌胃不同濃度的發(fā)芽綠豆多酚提取物，觀察其調(diào)控血糖的效果，并通過(guò)與T2DM 模型組小鼠空腹血糖、血脂水平、葡萄糖耐受量以及肝臟組織切片情況的對(duì)比，探究發(fā)芽綠豆多酚提取物對(duì)T2DM 小鼠降血糖的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

C57BL/6 小鼠（18～20）g，SPF 級(jí)，雄性，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司（許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001）本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理遵循黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)原則?；A(chǔ)飼料、高脂飼料，購(gòu)于南通特洛菲飼料科技有限公司。

發(fā)芽綠豆多酚，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制備；鏈脲佐菌素、鹽酸二甲雙胍，上海源葉生物科技有限公司；試劑盒，南京建成生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GA-3 血糖儀，三諾生物傳感股份有限公司；TU-1810 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；酶標(biāo)儀，中國(guó)邁瑞醫(yī)療公司；RE-2000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽綠豆多酚的制備流程 發(fā)芽綠豆多酚制備[24-27]：將綠豆進(jìn)行發(fā)芽處理（采用響應(yīng)面優(yōu)化法，確定綠豆的最優(yōu)發(fā)芽工藝為：綠豆的浸泡溫度25 ℃、浸泡時(shí)間11 h、發(fā)芽溫度28 ℃、發(fā)芽時(shí)間3 d、浸泡液CaCl2濃度2 mmol/L）→烘干→粉碎→過(guò)篩→醇提→發(fā)芽綠豆多酚粗提物→濃縮→冷凍干燥→AB-8 大孔樹(shù)脂純化→冷凍干燥→制得發(fā)芽綠豆多酚。

1.3.2 2 型糖尿病模型的建立 SPF 級(jí)C57BL/6雄性小鼠在12 h 明暗交替（8：00-20：00），室溫（23±2）℃，相對(duì)濕度40%左右且通風(fēng)良好的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)期間自由飲食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，根據(jù)體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=6）和造模組（n=30），正常組和造模組分別進(jìn)食基礎(chǔ)飼料和高脂飼料，共4 周，禁食12 h，造模組小鼠腹腔注射30 mg/kg·BW STZ，正常組注射相同體積檸檬酸緩沖液（pH=4）[28-29]。3 d 后測(cè)定小鼠空腹血糖值，在造模后第7 天檢測(cè)空腹血糖水平超過(guò)11.1 mmol/L 且伴隨表現(xiàn)出“三多一少”特征的小鼠被視為造模成功。

1.3.3 動(dòng)物分組及給藥方法 將造模成功的小鼠隨機(jī)分為5 組：模型組（DM）、陽(yáng)性對(duì)照組（MET，二甲雙胍，150 mg/kg）、高劑量組（150 mg/kg）、中劑量組（100 mg/kg）、低劑量組（50 mg/kg）。陽(yáng)性對(duì)照組以及低、中、高劑量治療組分別用二甲雙胍水溶液和發(fā)芽綠豆多酚水溶液進(jìn)行灌胃，其它組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)灌胃5 周。試驗(yàn)期間，每天觀察動(dòng)物進(jìn)食量、精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤等，每周按時(shí)稱(chēng)量小鼠體重。

1.3.4 空腹血糖值測(cè)定及口服葡萄糖耐受試驗(yàn)每周按時(shí)禁食12 h，測(cè)定空腹血糖值。在末次給藥后，小鼠禁食不禁水6 h，以2 g/kg bw 劑量灌胃25%的葡萄糖溶液，測(cè)定灌胃第0，30，60，90，120 min 的血糖值，根據(jù)公式（1）計(jì)算血糖曲線下面積（AUC），通過(guò)曲線下面積來(lái)表達(dá)葡萄糖耐受量（OGTT）的變化。

1.3.5 小鼠臟器指數(shù)的測(cè)定 解剖后，摘取小鼠肝臟、腎臟、胰腺等組織，用生理鹽水沖洗組織，用濾紙吸干水分，稱(chēng)重，并根據(jù)公式（2）計(jì)算臟器指數(shù)。

1.3.6 血清指標(biāo)測(cè)定 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠禁食12 h，乙醚麻醉，摘眼球取血，室溫下靜置30 min，低溫3 500 r/min 離心10 min，取血清，備用。

1.3.7 肝臟組織病理學(xué)觀察 取部分固定于4%多聚甲醛溶液中的新鮮肝臟組織，將其石蠟包埋、切片、染色、封片處理，于電子顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)形態(tài)觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用ANOVA 及多重比較進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。用Origin 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般狀況及體重變化

試驗(yàn)期間，觀察發(fā)現(xiàn)正常組小鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光滑，試驗(yàn)前后的進(jìn)食量、飲水量比較穩(wěn)定，體重逐漸增長(zhǎng)。糖尿病模型組小鼠精神比較萎靡，毛發(fā)暗淡無(wú)光澤，與試驗(yàn)前對(duì)比出現(xiàn)了“三多一少”癥狀。陽(yáng)性對(duì)照組和各劑量干預(yù)組的小鼠體重下降趨勢(shì)減緩，精神狀態(tài)也有所好轉(zhuǎn)。如表1 所示，造模成功后，模型組小鼠體重和正常組小鼠相比，出現(xiàn)極顯著下降（P＜0.01）；試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與模型組對(duì)比，灌胃發(fā)芽綠豆多酚溶液中劑量組小鼠體重顯著增加（P＜0.05），高劑量組和灌胃二甲雙胍的陽(yáng)性對(duì)照組小鼠體重極顯著增加（P＜0.01）。

表1 發(fā)芽綠豆多酚對(duì)小鼠體重的影響（，n=6）Table 1 Effect of germinated mung bean polyphenols on body weight of mice（，n=6）

表1 發(fā)芽綠豆多酚對(duì)小鼠體重的影響（，n=6）Table 1 Effect of germinated mung bean polyphenols on body weight of mice（，n=6）

注：## 表示模型組與正常組比較差異極顯著（P＜0.01）；* 表示各組與模型組比較差異顯著（P＜0.05）；** 表示各組與模型組比較差異極顯著（P＜0.01），下同。

2.2 發(fā)芽綠豆多酚對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

通過(guò)臟器指數(shù)可以看出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的狀態(tài)以及病變情況。由表2 顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠的肝臟指數(shù)顯著升高了49.26%（P＜0.01）；與模型組比較，中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的肝臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。表明糖尿病小鼠會(huì)出現(xiàn)明顯的肝臟、腎臟腫脹現(xiàn)象，而二甲雙胍陽(yáng)性藥物和各劑量組治療后會(huì)在一定程度上減輕臟器腫脹；也表明發(fā)芽綠豆多酚具有改善Ⅱ型糖尿病小鼠臟器指數(shù)的作用。

表2 發(fā)芽綠豆多酚對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響（n=6）Table 2 Effect of germinated mung bean polyphenols on organ index of mice（n=6）

2.3 發(fā)芽綠豆多酚對(duì)小鼠空腹血糖及糖耐量的影響

由表3 可知，正常組小鼠空腹血糖濃度比較穩(wěn)定，模型組小鼠的空腹血糖濃度在造模成功后呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)；與模型組相比，在治療第4 周時(shí)，中、高劑量組空腹血糖均極顯著低于模型組；在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，低、中、高劑量組的空腹血糖濃度表現(xiàn)出極顯著低于模型組（P＜0.01）?？崭寡堑臏y(cè)定結(jié)果表明發(fā)芽綠豆多酚溶液可以改善Ⅱ型糖尿病小鼠干預(yù)期間的血糖水平，治療組中以高劑量組的多酚溶液效果最佳。

表3 發(fā)芽綠豆多酚對(duì)小鼠血糖的影響（，n=6）Table 3 Effect of germinated mung bean polyphenols on blood glucose in mice（，n=6）

表3 發(fā)芽綠豆多酚對(duì)小鼠血糖的影響（，n=6）Table 3 Effect of germinated mung bean polyphenols on blood glucose in mice（，n=6）

糖耐量是指對(duì)葡萄糖的耐受能力，可以根據(jù)機(jī)體耐受葡萄糖的程度來(lái)判斷給藥后胰島β 細(xì)胞對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力。血糖曲線下面積可以用來(lái)表示人體利用和清除葡萄糖的程度，如果數(shù)值增大，說(shuō)明機(jī)體糖耐量能力下降，反之則能力升高。如表4 所示，正常組小鼠的血糖濃度隨著時(shí)間變化趨勢(shì)平緩，而模型組小鼠血糖在前30 min 快速升高，并達(dá)到峰值后又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但血糖值一直較高。各劑量治療組的血糖值在60 min 后緩慢下降，但均未恢復(fù)到初始血糖值。由表4 可知，模型組的AUC 顯著高于正常組（P＜0.01），各劑量治療組和陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比呈現(xiàn)顯著性降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，發(fā)芽綠豆多酚溶液可以在一定程度上提高Ⅱ型糖尿病小鼠的糖耐量，且從恢復(fù)程度上看，高劑量效果較好。

表4 發(fā)芽綠豆多酚對(duì)小鼠糖耐量的影響Table 4 Effects of germinated mung bean polyphenols on glucose tolerance in mice

2.4 發(fā)芽綠豆多酚對(duì)小鼠血清含量的影響

糖尿病與血脂水平密切相關(guān)，降低血脂水平會(huì)有助于改善糖尿病。由圖1 可知，與正常組相比，模型組小鼠的TC、TG、LDL-C 濃度均極顯著升高，HDL-C 濃度下降，這表明糖尿病小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了脂代謝紊亂的情況。與模型組對(duì)比，陽(yáng)性對(duì)照組和低、中、高劑量組的TC 濃度分別降低了36.07%，16.86%，24.31%，27.84%（P＜0.01），LDL-C濃度也呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(shì)，陽(yáng)性對(duì)照組和中劑量組的TG 濃度也分別降低了25.17%，20.49%（P＜0.05），說(shuō)明發(fā)芽綠豆多酚提取物對(duì)T2DM 小鼠脂代謝紊亂有較好的調(diào)節(jié)作用。

圖1 發(fā)芽綠豆多酚對(duì)小鼠血脂的影響Fig.1 Effect of germinated mung bean polyphenols on blood lipid in mice

2.5 發(fā)芽綠豆多酚對(duì)小鼠肝損傷的影響

ALT 和AST 酶活力的高低，是反映肝臟組織功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，而通過(guò)肝臟病理能夠更直觀的判斷組織的受損情況。由圖2 可知，模型組小鼠的ALT 活力與正常組比增加了86.40%，AST 活力增加了83.39%，而各劑量組小鼠的ALT、AST活力呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)，與模型組對(duì)比，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠ALT 活力降低了19.54%，34.33%，AST 活力降低了30.58%，33.47%。說(shuō)明發(fā)芽綠豆多酚溶液低、中、高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組能很好的降低小鼠血清ALT、AST 的活力。

圖2 發(fā)芽綠豆多酚對(duì)小鼠ALT 和AST 活力的影響Fig.2 Effect of germinated mung bean polyphenols on ALT and AST activity in mice

觀察灌胃發(fā)芽綠豆多酚的各組動(dòng)物解剖組織切片結(jié)果，和模型組對(duì)比，動(dòng)物內(nèi)臟均未出現(xiàn)較為嚴(yán)重的損傷情況，說(shuō)明發(fā)芽綠豆多酚灌胃的劑量對(duì)動(dòng)物是安全的。如圖3 所示，正常組的肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)飽滿。與正常組相比，模型組的小鼠肝組織可見(jiàn)部分肝細(xì)胞明顯壞死，細(xì)胞核固縮溶解消失，肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象。陽(yáng)性對(duì)照組和各劑量組小鼠肝損傷情況與模型組比有明顯改善，低、中劑量組的肝組織可見(jiàn)部分肝細(xì)胞仍有輕微水腫，而高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)基本正常。

圖3 發(fā)芽綠豆多酚對(duì)小鼠肝組織的影響Fig.3 Effect of germinated mung bean polyphenols on liver tissue of mice

3 討論

2 型糖尿病大多是由基因遺傳和環(huán)境因素共同引發(fā)的，其主要危險(xiǎn)因素是家族史、不良生活習(xí)慣、肥胖、血脂異常、糖耐量異常等，其癥狀體現(xiàn)為血糖水平升高，并在一定程度上會(huì)導(dǎo)致機(jī)體糖代謝紊亂[30]。本研究采用高脂飼料聯(lián)合STZ 誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠模型，在發(fā)芽綠豆多酚提取物干預(yù)第5 周后，試驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠體重顯著升高；低、中、高劑量組的空腹血糖濃度顯著降低（P＜0.01），表明一定劑量的發(fā)芽綠豆多酚提取物可以改善T2DM小鼠的"三多一少"癥狀，降低糖尿病小鼠干預(yù)期間的血糖濃度并在一定程度上增強(qiáng)其糖耐受程度。本試驗(yàn)抑制血糖水平結(jié)論與邢莎莎等[31]、劉芷君等[29]研究結(jié)果一致。T2DM 是以糖脂代謝紊亂為主的代謝性疾病，進(jìn)而導(dǎo)致組織、器官以及消化系統(tǒng)等病變[32]。本試驗(yàn)中，與模型組比較，發(fā)芽綠豆多酚提取物劑量組的TC、TG、HDL-C、LDL-C 的水平均有顯著變化，與馬永強(qiáng)等[33]的研究結(jié)果一致。表明發(fā)芽綠豆多酚提取物可以在一定程度上調(diào)節(jié)糖尿病小鼠的血脂水平，其調(diào)節(jié)機(jī)制還有待于進(jìn)一步探究。

肝臟作為調(diào)節(jié)血糖濃度的主要器官，參與糖的代謝過(guò)程，器官損傷與糖尿病密切相關(guān)。本試驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照組和發(fā)芽綠豆多酚提取物劑量組干預(yù)后，顯著降低了臟器指數(shù)，推測(cè)可能具有改善2型糖尿病小鼠臟器功能的作用。研究表明，如果肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷時(shí)，ALT 和AST 會(huì)被釋放到血液中，則血液中ALT 和AST 水平會(huì)出現(xiàn)升高，表明血液中ALT 和AST 水平與肝組織的損傷情況密切相關(guān)[34]。本試驗(yàn)中，高劑量組小鼠ALT 和AST活力顯著降低了19.54%，30.58%，推測(cè)可能說(shuō)明發(fā)芽綠豆多酚溶液一定劑量范圍內(nèi)能很好的降低小鼠血清ALT、AST 的活力，同時(shí)能修復(fù)小鼠肝細(xì)胞溶解現(xiàn)象，使肝損傷情況得到改善，該機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。有研究證明全綠豆和發(fā)芽的綠豆是一種有效的肝保護(hù)劑，能夠以劑量依賴(lài)的方式降低肝酶活性和肝組織病理學(xué)[35]。

綜上所述，發(fā)芽綠豆多酚提取物可以顯著改善T2DM 小鼠的血糖、血脂水平，同時(shí)對(duì)肝損傷起到一定程度的修復(fù)作用。表明了發(fā)芽綠豆多酚是一種具有開(kāi)發(fā)潛力和研究?jī)r(jià)值的天然降糖物質(zhì)，在糖尿病治療中的應(yīng)用具有廣闊的前景。