李松明，趙夢(mèng)蝶，劉 偉，馬美湖，金永國(guó)，黃 茜*

（1 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院蛋品加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程中心農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蛋品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢 430070 2 宜賓林竹產(chǎn)業(yè)研究院 四川宜賓 644000）

鈣是人體主要的二價(jià)陽(yáng)離子，約占人體體重的1.5%～2.2%。體內(nèi)大部分（99%）的鈣沉積在骨骼和牙齒中，然而，鈣也以離子形式存在于軟組織、細(xì)胞外液和血液中。鈣不僅是肌肉收縮和放松、神經(jīng)傳遞、免疫反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信使，而且能保持細(xì)胞增殖、血清和骨鈣含量之間的動(dòng)態(tài)平衡[1]。鈣缺乏可能導(dǎo)致代謝性骨病，如佝僂病和骨質(zhì)疏松癥。研究人員發(fā)現(xiàn)，氨基酸可與鈣結(jié)合，形成氨基酸絡(luò)合鈣，其吸收快、吸收率高，價(jià)格低，具有可同時(shí)提供氨基酸和鈣的優(yōu)點(diǎn)[2]。近年來(lái)的研究表明，相比氨基酸螯合鈣，肽螯合鈣具有更易被吸收且吸收速率更快的特點(diǎn)，這是因?yàn)槠洫?dú)特的螯合機(jī)制和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，同時(shí)多肽本身具有特殊生物活性[3-4]。因此，具有促鈣吸收生物活性功能的肽鈣復(fù)合物有很好的應(yīng)用前景和發(fā)展空間。

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為鈣僅以離子形式被吸收，它必須被溶解或從它的來(lái)源中釋放出來(lái)。然而，一些溶解的鈣會(huì)在小腸的堿性pH 值中與礦物質(zhì)或其它膳食成分如草酸和植酸形成不溶性復(fù)合物，導(dǎo)致鈣吸收和利用不足。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白磷酸肽（CPPs）能結(jié)合鈣離子形成可溶性肽-鈣復(fù)合物，促進(jìn)鈣吸收和在骨中的積累[5]。CPP 可以促進(jìn)鈣吸收的Caco-2 細(xì)胞調(diào)控的TRPV6 表達(dá)，關(guān)于鈣離子在腸道內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制主要有兩種：主動(dòng)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和被動(dòng)旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[6]。在雞蛋蛋黃中同樣存在一種高磷酸化的蛋白——卵黃高磷蛋白（PV），它是自然界中磷酸化程度最高的蛋白[7]。PV 中可以被磷酸化的絲氨酸和蘇氨酸殘基幾乎都被磷酸化，許多絲氨酸殘基排列成最多15個(gè)連續(xù)殘基。雖然目前所有的商業(yè)磷酸肽都是用酪蛋白制備的，但是PV 具有更高的磷酸化水平，是比酪蛋白更好的磷酸肽制備來(lái)源。然而，由于PV 具有很強(qiáng)的負(fù)電荷，阻礙了蛋白酶進(jìn)入裂解位點(diǎn)[8]。最近，本課題組開(kāi)發(fā)了一種高溫中壓（HTMP，121 ℃，0.1 MPa）預(yù)處理技術(shù)，在不損失PV 中磷酸基團(tuán)的情況下，提高了卵黃高磷蛋白的酶解程度，可釋放出更豐富的磷酸肽片段（PPP）[9]。

目前，關(guān)于PPP 促鈣吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的活性研究鮮有報(bào)道。本研究目的是采用復(fù)合酶解的方法處理PV 得到水溶性多肽PPP，優(yōu)化肽結(jié)合鈣的制備條件，探究肽鈣螯合物的酸堿穩(wěn)定性。采用Caco-2單層細(xì)胞模型，依據(jù)細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)量、AKP 活性和CalbindinD9K mRNA 的相對(duì)表達(dá)量來(lái)評(píng)估PPPCa 的體外促鈣吸收特性。研究結(jié)果旨在利用雞蛋中的活性肽作為功能性營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑提供參考。

1 材料方法

1.1 材料與試劑

采用Lei[10]的方法制備卵黃高磷蛋白。人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（Caco-2 cells），由武漢普諾賽生命科技有限公司提供，堿性蛋白酶（alkaline phosphatase，AKP）活性檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；胰蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶，美國(guó)Enzyme Co.Ltd（Elgin,IL,USA）；MTT、DMEM 培養(yǎng)基、MEM 培養(yǎng)基、二甲基亞砜、PBS 緩沖液、0.25%胰酶（含0.02% EDTA）、青霉素-鏈霉素，美國(guó)Hyclone 公司；胎牛血清（FBS），澳洲GIBCO 公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

酶標(biāo)儀，聯(lián)想生物科技有限公司；JSM-6390LV 掃描電鏡，日本NTC 公司；HERAcell 1501 二氧化碳培養(yǎng)箱，德國(guó)Thermo Scientific 公司；IX71 熒光倒置顯微鏡，日本Olympus 公司；DL-CJ-2ND 超凈工作臺(tái)，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；Millicell-ERS 電阻儀，美國(guó)Millicell公司；XB-K-16 血球計(jì)數(shù)板，上海安信光學(xué)儀器公司；HH-4 數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；TDL-50B 臺(tái)式低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 卵黃高磷蛋白磷酸肽的制備 PPP 是按照J(rèn)i 等[11]的方法制備的，并進(jìn)行了一些修改。PV 進(jìn)行HPMP 預(yù)處理，預(yù)處理的溫度、壓力和時(shí)間條件為121 ℃、0.1 MPa、30 min，然后用胰蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶依次對(duì)HTMP 預(yù)處理的卵黃高磷蛋白進(jìn)一步水解，制備PPP。兩次酶解結(jié)束后都將樣品在沸水浴中保存10 min，以終止酶解得到PPP。酶解溶液凍干并保存在-20 ℃的冰箱中直到使用。

1.3.2 肽-鈣螯合物制備及其優(yōu)化 將酶解得到的PPP 溶于去離子水（10 mg/mL）中，加入CaCl2制備肽鈣螯合物。

肽鈣質(zhì)量比：設(shè)定螯合反應(yīng)條件，pH 7.0，溫度40 ℃，反應(yīng)時(shí)間30 min，設(shè)定不同肽鈣質(zhì)量比為5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1，10 ∶1，以鈣結(jié)合率確定最佳肽鈣質(zhì)量比。

反應(yīng)pH 值：設(shè)定螯合反應(yīng)條件，肽鈣比1∶1，溫度40 ℃，反應(yīng)時(shí)間30 min，設(shè)定不同pH 值，以鈣結(jié)合率為指標(biāo)確定最佳反應(yīng)pH 值。

反應(yīng)溫度：設(shè)定螯合反應(yīng)條件，肽鈣比1 ∶1，pH 7.0，反應(yīng)時(shí)間30 min，設(shè)定不同溫度為室溫，30，40，50，60 ℃，以鈣結(jié)合率為指標(biāo)確定最佳反應(yīng)溫度。

反應(yīng)時(shí)間：設(shè)定螯合反應(yīng)條件，肽鈣比1 ∶1，pH 7.0，溫度40 ℃，設(shè)定不同反應(yīng)時(shí)間為5，15，30，45，60，75 min，以鈣結(jié)合率為指標(biāo)確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.3 肽鈣螯合物的胃腸穩(wěn)定性分析 模擬消化穩(wěn)定性：胃部消化，將肽鈣復(fù)合物配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的溶液，用1 mol/L HCl 調(diào)pH 2.0，加入2%胃蛋白酶37 ℃水浴消化0.5，1，1.5，2，2.5 h后取出一部分消化液，100 ℃水浴滅酶10 min，9倍體積無(wú)水乙醇沉淀后離心，原子吸收測(cè)定上清液鈣含量，計(jì)算胃部消化后PPP 的鈣結(jié)合量。

小腸消化：胃部消化后，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 7.5，加入胰蛋白酶37 ℃水浴消化0.5，1，1.5，2，2.5 h 后取出一部分消化液，100 ℃水浴滅酶10 min，9 倍體積無(wú)水乙醇沉淀后離心，原子吸收測(cè)定上清液鈣含量，計(jì)算小腸消化后PPP 的鈣結(jié)合量。

穩(wěn)定性用鈣儲(chǔ)留率表示：

式中：Ca后——消化后的鈣含量；Ca前——消化前的鈣含量。

1.3.4 Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)及單層模型制備 Caco-2 細(xì)胞復(fù)蘇是將細(xì)胞凍存管迅速?gòu)囊旱拗修D(zhuǎn)移至37 ℃水浴鍋中，融化后用吸管吸出細(xì)胞懸液加適量完全培養(yǎng)基，混勻后離心（1 000 r/min，3 min）。棄去上清液，加入含有20% FBS 的完全DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基。

待培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞融合到80%以上，用PBS清洗3 遍細(xì)胞，胰酶消化5～8 min，添加適量培養(yǎng)基終止消化，離心（1 000 r/min，3 min）得到細(xì)胞，添加新鮮完全培養(yǎng)基（89% DMEM、10% 胎牛血清、1%雙抗）并吹打均勻，按照1∶2 或者1∶3 的比例傳代培養(yǎng)，隔天換液，3～4 d 進(jìn)行傳代，復(fù)蘇以后的細(xì)胞傳代3 次后細(xì)胞活力上升，調(diào)整細(xì)胞密度約 1×105cells/mL，每孔0.5 mL 接種于TranswellTM 12 板上室（AP 側(cè)），下室（BL 側(cè)）添加1.5 mL 完全培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種細(xì)胞后前1周，每隔1 d 更換新鮮培養(yǎng)液，之后每天換液。培養(yǎng)到約21 d，細(xì)胞分化成致密單層細(xì)胞，可以用于科學(xué)試驗(yàn)。

1.3.5 不同濃度多肽及肽鈣螯合物對(duì)Caco-2 細(xì)胞毒性的影響 試驗(yàn)分為6 組：①空白組：培養(yǎng)液+MTT 溶液；②對(duì)照組：培養(yǎng)液+MTT 溶液+細(xì)胞；③給藥組1：PV+培養(yǎng)液+MTT 溶液+細(xì)胞；④給藥組2：HTMP-PV+培養(yǎng)液+MTT 溶液+細(xì)胞；⑤給藥組3：PPP+培養(yǎng)液+MTT 溶液+細(xì)胞；⑥給藥組4：PPP-CaCl2+培養(yǎng)液+MTT 溶液+細(xì)胞。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3×104～5×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸濁液100 μL 放入96 孔培養(yǎng)板中培育24 h，細(xì)胞貼壁后換液，分別加入含有不同質(zhì)量濃度的樣品（0，50，100，200，300，400，500 μg/mL）的培養(yǎng)基100 μL。培養(yǎng)24 h 結(jié)束后，每孔加入含有0.5 mg/mL 的MTT 的無(wú)血清培養(yǎng)液MEM 200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，每孔加入150 μL DMSO，室溫下?lián)u床振蕩10 min，充分混勻并溶解藍(lán)紫色的甲臜顆粒。在酶標(biāo)儀上選擇570 nm 波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸光度值。試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。按以下公式計(jì)算：

式中：As——試驗(yàn)組吸光度值；Ac——對(duì)照組吸光度值；Ab——空白組吸光度值。

1.3.6 Caco-2 細(xì)胞單層模型的建立 鈣轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)采用單層細(xì)胞模型[12]。將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Caco-2 細(xì)胞消化后，以1×105個(gè)/mL 的密度接種到12 孔TranswellTM 培養(yǎng)板上。TranswellTM 培養(yǎng)板上室（AP 側(cè)）添加0.5 mL 細(xì)胞培養(yǎng)基，隨后在下室（BL 側(cè)）加入1.5 mL 完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)平行。細(xì)胞接種后隔天換液，7 d 后每天換液，培養(yǎng)至21～27 d，細(xì)胞形成致密單層可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.7 Caco-2 細(xì)胞單層跨上皮電阻 Caco-2 細(xì)胞單層模型建立的整個(gè)過(guò)程都需要監(jiān)控TEER 值的變化情況，為研究藥物滲透性提供依據(jù)。將MilicellERS-2 型細(xì)胞電阻儀的電極兩端分別放置于TranswellTM 培養(yǎng)板中AP 側(cè)小室和BL 側(cè)小室測(cè)定電阻值。其計(jì)算公式為：

其中12 孔TranswellTM 培養(yǎng)板中支持膜面積為1.12 cm2。

1.3.8 堿性磷酸酶活性試驗(yàn) 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）是腸上皮細(xì)胞刷狀緣的標(biāo)志酶，能反映腸上皮細(xì)胞分化程度及其功能狀態(tài)。細(xì)胞TEER 值大于200 Ω·cm2后，每隔2 d 分別取AP 側(cè)與BL 側(cè)中培養(yǎng)基，根據(jù)堿性磷酸酶試劑盒的方法測(cè)定AKP 活性。

1.3.9 Caco-2 細(xì)胞單層通透性驗(yàn)證 熒光黃標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：用熒光分光光度計(jì)測(cè)定不同質(zhì)量濃度（0.5，0.75，1，1.25，1.5，1.75 μg/mL），以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

向AP 側(cè)加入0.5 mL 熒光黃溶液（5 μg/mL），BL 側(cè)加1.5 mL HBSS，將培養(yǎng)板放置在37 ℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)0，30，60，90，120 min，分別從BL 側(cè)取0.5 mL 樣品液，再向BL 側(cè)加入0.5 mL 預(yù)熱HBSS。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用熒光光度計(jì)測(cè)定樣品液熒光強(qiáng)度，依據(jù)以下公式計(jì)算表觀滲透系數(shù)Papp。

式中：dQ/dt——單位時(shí)間熒光黃轉(zhuǎn)運(yùn)量，mg/s；A——轉(zhuǎn)運(yùn)膜表面積；C0——培養(yǎng)液中熒光黃原始質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.3.10 Caco-2 細(xì)胞單層形態(tài)觀察 將Caco-2細(xì)胞接種在12 孔TransWellTM 培養(yǎng)板中培養(yǎng)21 d，細(xì)胞用PBS 清洗后用戊二醛固定，脫水處理后臨界點(diǎn)干燥噴金，生物掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3.11 鈣轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn) 鈣離子不同濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)：配制不同濃度的CaCl2溶液（0.5，1，2，4 mg/mL），溶于HBSS 緩沖溶液中后37 ℃水?。?。Caco-2 單層模型建立21 d 后，將12 孔TransWellTM 板上下室清洗3 遍后，下室加1.5 mL 預(yù)熱的HBSS（無(wú)鈣），上室加入0.5 mL 的CaCl2溶液，3 h 后取下室溶液，原子吸收光譜法測(cè)定其鈣含量。

肽鈣復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)：操作如鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)，清洗后，下室加入1.5 mL 預(yù)熱的HBSS，上室加入0.5 mL 的肽鈣復(fù)合物，3 h 后取下室溶液，原子吸收光譜法測(cè)定其鈣含量。

1.3.12 TRPV6 鈣離子通路中CalbindinD9K m RNA 相對(duì)表達(dá)量 在建模21 d 后，用含有（PV、HTMP、PPP、PPP-Ca）的完全培養(yǎng)基處理24 h 后，HBSS 清洗3 遍。用裂解液收集細(xì)胞，RT-PCR 測(cè)定CalbindinD9K m RNA 的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷酸肽螯合鈣制備條件優(yōu)化

肽與鈣的質(zhì)量比是影響多肽與金屬離子螯合的最主要因素。肽與鈣的比率過(guò)高會(huì)導(dǎo)致肽利用率降低，過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)形成的絡(luò)合物穩(wěn)定性差[13]。Wu 等[14]發(fā)現(xiàn)豬骨膠原肽與鈣的質(zhì)量比為4.5∶1 時(shí)，鈣結(jié)合率為78.38%。

圖1a 顯示，隨著PPP 與Ca2+的質(zhì)量比的增大，鈣螯合率顯著增加（P＜0.05），在質(zhì)量比為7 ∶1時(shí)，鈣螯合率達(dá)到97%，質(zhì)量比繼續(xù)增大鈣螯合率穩(wěn)定。pH 值對(duì)鈣螯合率的影響如圖1b 所示。由圖可知，隨著反應(yīng)體系pH 值的增大，鈣螯合率變化明顯。當(dāng)?shù)孜锏膒H 值從5.5 增加到9.5 時(shí)，鈣螯合率顯著增加（P＜0.05）。鈣結(jié)合率顯著上升可能是因?yàn)榉磻?yīng)體系中的氫離子減少，因此有更少的氫離子與鈣離子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磷酸基團(tuán)，有利于鈣結(jié)合到磷酸肽表面。因此，螯合反應(yīng)的最佳pH 值為9.5。已有研究發(fā)現(xiàn)，卵黃高磷蛋白的金屬結(jié)合速率較快，在較短時(shí)間內(nèi)就可以結(jié)合金屬離子[15]。圖1c、1d 結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度和螯合時(shí)間對(duì)肽鈣結(jié)合率沒(méi)有顯著影響。

圖1 螯合條件對(duì)鈣螯合率的影響Fig.1 The effect of chelating conditions on the calcium chelating rate

2.2 模擬胃腸道消化穩(wěn)定性

膳食成分被機(jī)體吸收利用需要經(jīng)胃消化后在腸道被吸收，因此依據(jù)物質(zhì)對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶的耐受性可模擬評(píng)價(jià)其在消化過(guò)程中的穩(wěn)定性[16]。食物在體內(nèi)的消化過(guò)程中，一般經(jīng)過(guò)胃的時(shí)間是0.5～3.0 h，經(jīng)過(guò)腸道的時(shí)間是2.0～2.75 h。如圖2 所示，肽鈣復(fù)合物經(jīng)胃蛋白酶作用時(shí)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，其鈣解離率增大。當(dāng)胃蛋白酶酶解2.5 h時(shí)，其鈣解離率為36.31%。這可能是因?yàn)槟M胃部消化體系的pH 值為2.0，結(jié)合pH 值對(duì)PPP-Ca穩(wěn)定性結(jié)果可知，酸性條件下肽鈣復(fù)合物的穩(wěn)定性降低，解離出鈣離子，因此鈣解離率較高[17]。復(fù)合物的最終鈣保留率為63.69%，說(shuō)明胃蛋白酶對(duì)PPP-Ca 的作用不大，僅對(duì)pH 值較為敏感。加入胰蛋白酶調(diào)節(jié)pH 值到7.5，模擬腸液消化2.5 h 時(shí)，肽鈣復(fù)合物的鈣解離率為7.25%。鈣保留率為92.75%。結(jié)果表明，肽鈣復(fù)合物對(duì)胰蛋白酶的消化不敏感，在胰蛋白酶酶解過(guò)程中，反應(yīng)體系pH 值為中性，由肽鈣復(fù)合物的酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果可得，肽鈣復(fù)合物可在此pH 值條件下保持穩(wěn)定[18]。

圖2 模擬胃腸道消化對(duì)肽鈣復(fù)合物穩(wěn)定性的影響Fig.2 The effects of simulated gastrointestinal digestion on the stability of peptide-calcium complexes

2.3 Caco-2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

采用MTT 法測(cè)定PV、HTMP-PV、PPP 和PPP-Ca 對(duì)于Caco-2 細(xì)胞的毒性作用，試驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示，PV、HTMP-PV、PPP、PPP-Ca 的濃度在0～400 μg/mL 范圍內(nèi)，Caco-2 細(xì)胞經(jīng)樣品處理24 h 后，細(xì)胞活性均能保持在80%以上。說(shuō)明4 種樣品對(duì)Caco-2 細(xì)胞均不具有較大的毒性作用，可做后續(xù)試驗(yàn)[19]。

圖3 不同濃度PV（a）、HTMP-PV（b）、PPP（c）和PPP-Ca（d）對(duì)Caco-2 細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用Fig.3 Cytotoxic effects of PV（a），HTMP-PV（b），PPP（c）and PPP-Ca（d）at different concentrations on cultured Caco-2 cells

2.4 Caco-2 細(xì)胞單層模型TEER 值

在接種Caco-2 細(xì)胞于TransWellTW 板上后，每2 d 測(cè)定細(xì)胞單層跨膜電阻值（Transepithelial electrical resistance,TEER）。由圖4 可知，TEER值在建模7 d 內(nèi)增加稍緩，這是由于Caco-2 細(xì)胞剛開(kāi)始貼壁，細(xì)胞分裂尚未達(dá)到融合[20]。而當(dāng)Caco-2 細(xì)胞開(kāi)始融合，從第10 天起TEER 值開(kāi)始急劇增加，在第14 天達(dá)到860 Ω·cm-2，此后保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)TEER 值大于250 Ω·cm-2時(shí)，表明Caco-2 細(xì)胞形成了致密的單層膜結(jié)構(gòu)，可以用于藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)研究[21]。

圖4 Caco-2 細(xì)胞單層模型的跨膜電阻（TEER）與建模時(shí)間的關(guān)系Fig.4 The transepithelial electrical resistance（TEER）of Caco-2 cells monolayer model in relation to modeling time

2.5 Caco-2 細(xì)胞單層模型堿性磷酸酶（AKP）活性

堿性磷酸酶是Caco-2 細(xì)胞單層模型建立過(guò)程中分泌的標(biāo)志性酶。主要在細(xì)胞單層的刷狀緣部位表達(dá)，并反映細(xì)胞單層膜的極化狀況[21]。若AP 側(cè)AKP 活性顯著高于BL 側(cè)，則說(shuō)明Caco-2細(xì)胞單層膜極化情況較好。如表1 所示，在第10天時(shí)，AP 側(cè)和BL 側(cè)AKP 活力比為1.06，說(shuō)明細(xì)胞極化程度還未達(dá)到要求，此時(shí)的TEER 值也較低（圖4）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，AKP 活性呈上升趨勢(shì)，在第21 天時(shí)，AP/BL 酶活力比達(dá)到3.39，表明Caco-2 細(xì)胞單層模型極化基本完成，可以用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間Caco-2 細(xì)胞單層膜兩側(cè)堿性磷酸酶活性變化情況Table 1 The changes of alkaline phosphatase activity on both sides of the monolayer of Caco-2 cells at different culture times

2.6 Caco-2 細(xì)胞單層模型通透性試驗(yàn)

如表2，在培養(yǎng)21 d 后，測(cè)定Caco-2 細(xì)胞單層膜熒光黃通透性。根據(jù)公式計(jì)算出添加熒光黃溶液于上室后，每30 min 后取下室溶液測(cè)定熒光黃熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，Caco-2 細(xì)胞在TranswellTM 板中培養(yǎng)21 d 后，熒光黃的滲透率在120 min 能達(dá)到（7.79±0.12）×10-6cm/s，表明已經(jīng)形成了完整的單細(xì)胞層[22]。

表2 不同處理時(shí)間Caco-2 細(xì)胞單層模型的熒光黃通透性Table 2 Fluorescence yellow permeability of Caco-2 cell monolayer model at different treatment times

2.7 Caco-2 細(xì)胞單層模型形態(tài)

在Caco-2 細(xì)胞接種于TranswellTM 板上培養(yǎng)21 d 后，用戊二醛進(jìn)行固定，臨界點(diǎn)噴金干燥后在生物掃描電鏡下觀察。結(jié)果如圖5 所示，可以觀察到清晰致密的微絨毛結(jié)構(gòu)，這說(shuō)明Caco-2 細(xì)胞已經(jīng)形成了單層膜，并且分化出了單層膜的形態(tài)學(xué)特征，可用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。

圖5 培養(yǎng)21 d 后Caco-2 細(xì)胞單層細(xì)胞的SEM 圖Fig.5 SEM image of monolayer cells of Caco-2 cells after 21 days of culture

2.8 鈣轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)

由圖6 可知，在建模21 d 后，在上室中加入不同濃度的CaCl2溶液0.5 mL，3 h 后測(cè)定下室中的鈣離子含量，發(fā)現(xiàn)隨著鈣離子濃度的增大，下室中鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)量增大，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。說(shuō)明Caco-2 單層細(xì)胞模型建立成功，具有轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的能力。進(jìn)一步由圖7 發(fā)現(xiàn)，在上室加入鈣離子100 μg 的CaCl2、PV+CaCl2、HTMP-PV+CaCl2和PPP-CaCl2，3 h 后測(cè)定下室鈣含量，CaCl2的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)量為3.06 μg，PV+CaCl2、HTMP-PV+CaCl2和PPP-CaCl2的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)量分別為4.09 μg、5.33 μg 和5.66 μg。結(jié)果表明PPP-CaCl2可明顯提高鈣轉(zhuǎn)運(yùn)量，且高于無(wú)機(jī)鈣CaCl2組。這也與有些文獻(xiàn)結(jié)果一致，例如，13 ku 葵花籽肽（SSP4）和10 ku 花生肽（PP1）的鈣復(fù)合物組分在Caco-2 細(xì)胞單層膜中的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著高于CaCl2組[23]。

圖6 不同鈣離子濃度的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)量Fig.6 Calcium transports at different calcium ion concentrations

2.9 TRPV6 鈣離子通路相關(guān)蛋白mRNA 的表達(dá)

鈣離子在腸道內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制主要有兩種，主動(dòng)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制（如TRPV6 鈣離子通道、Cav3.1 鈣離子通道等）和被動(dòng)旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。Caco-2 主要表達(dá)的是TRPV6 鈣離子通道，通過(guò)測(cè)定TRPV6 鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)通路中的CalbindinD9K 蛋白基因表達(dá)情況可以得出其鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力。由圖8 發(fā)現(xiàn)用PPP-CaCl2處理24 h 后，PV-CaCl2組的CalbindinD9K m RNA 表達(dá)量與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。HTMP-PV 和PPP-Ca 組的CalbindinD9K m RNA 的相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)（P＜0.05），其中PPP-Ca 組達(dá)到2.22，是對(duì)照組的2 倍多。表明肽鈣復(fù)合物可通過(guò)上調(diào)CalbindinD9K m RNA 的表達(dá)，增加鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)量[24]。

圖8 PV-Ca、HTMP-PV-Ca、PPP-Ca 和CaCl2對(duì)Caco-2 單層細(xì)胞TRPV6 鈣離子通路基因CalbindinD9K 表達(dá)水平RT-PCR 分析Fig.8 RT-PCR analysis of PV-Ca,HTMP-PV-Ca，PPP-Ca and CaCl2 on the calbindinD9K of TRPV6 Ca2+ pathway genes expression level of Caco-2 monolayer cells

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首先優(yōu)化了PPP-Ca 螯合的最佳條件，結(jié)果顯示在pH 值為9.5，多肽與鈣質(zhì)量比7∶1的條件下，鈣螯合率達(dá)到97%，PPP-Ca 在模擬胃腸道消化中顯示了極高的穩(wěn)定性。在Caco-2 細(xì)胞單層模型中，用MTT 法驗(yàn)證了PV、HTMP-PV、PPP-Ca 對(duì)Caco-2 細(xì)胞的無(wú)毒性作用，在建模21 d 后檢測(cè)細(xì)胞的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)量，結(jié)果表明：PV+CaCl2、HTMP-PV+CaCl2和PPP-Ca 均可以增加鈣轉(zhuǎn)運(yùn)量與CaCl2組相比，其中PPP-Ca 組的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)量最高，達(dá)到（5.66±0.62）μg。同樣在Caco-2 細(xì)胞單層試驗(yàn)中，在探究CalbindinD9K mRNA 表達(dá)情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)PPP-Ca 可以上調(diào)CalbindinD9K mRNA 的表達(dá)，從而增加鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)量。

本試驗(yàn)對(duì)PPP 的跨Caco-2 細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)吸收機(jī)制進(jìn)行研究，便于篩選出生物利用度高的促鈣吸收肽和其結(jié)構(gòu)特征，為這些肽提高生物利用度并起到更好補(bǔ)鈣的作用提供可能。但是PPP 在Caco-2 細(xì)胞單層膜中的具體轉(zhuǎn)運(yùn)通路機(jī)制可能需要通過(guò)抑制通路表達(dá)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。