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連接肽對β-木糖苷酶HJ14GH43 熱適應(yīng)性的影響

2023-08-17 02:46:24曹麗娟黃遵錫周峻沛
中國食品學(xué)報 2023年6期
關(guān)鍵詞:聚糖糖苷酶緩沖液

曹麗娟,李 娜,劉 鈺,張 蕊,2,3,4,黃遵錫,2,3,4,周峻沛,2,3,4*

(1 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 昆明 650500 2 云南師范大學(xué)生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心 昆明 650500 3 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室 昆明 650500 4 云南師范大學(xué)云南省高校高原特色食品酶重點實驗室 昆明 650500)

木聚糖是陸地植物細(xì)胞壁中半纖維素的主要成分,同時也廣泛存在于海藻的細(xì)胞壁中[1]。木聚糖分子由β-1,4-連接(或β-1,3-連接)的木糖主鏈和包括L-阿拉伯呋喃糖、葡萄糖醛酸,O-乙?;桶⑽核岬仍趦?nèi)的不同的取代基組成[2]。由于木聚糖的復(fù)雜性和異質(zhì)性,因此其完全水解需要一系列協(xié)同作用的水解酶[2]。其中,β-木糖苷酶(βxylosidase)是木聚糖水解過程中的關(guān)鍵酶之一,其主要作用是協(xié)同內(nèi)切木聚糖酶水解木聚糖生成木糖[3-4]。木糖為自然界中第二豐富的糖,可被應(yīng)用于食品、飼料、生物燃料以及化學(xué)品生產(chǎn)等領(lǐng)域,具有良好的應(yīng)用價值[5-8]。此外,木糖在降低血脂、改善腸道菌群以及調(diào)節(jié)血糖等方面均具有重要意義[9-11]。廣義上,將包含β-木糖苷酶在內(nèi)的能水解木聚糖的一類酶稱為木聚糖酶,近年來不少關(guān)于木聚糖酶的研究聚焦于獲得具有低溫、耐熱、耐鹽、耐酸、耐堿、耐乙醇、耐木糖等獨特性質(zhì)的酶[2,12-14]。

通常,連接肽被定義為連接模塊化蛋白質(zhì)中兩個相鄰結(jié)構(gòu)域的柔性區(qū)域[15]。天然多域蛋白質(zhì)由通過連接肽區(qū)域連接的兩個或多個結(jié)構(gòu)域組成[16]。連接肽不僅是靈活的連接器,而且已被廣泛證明影響蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、溶解性和生化特征等性質(zhì)[17-23]。例如,Li 等[20]研究表明連接肽的刪除使木聚糖酶XynAS27 的pH 值穩(wěn)定性以及對不溶性底物的活性降低;Srisodsuk 等[21]研究表明連接肽的縮短和刪除降低了外切纖維素酶I(1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase I,CBHI)的催化活性;Sonan 等[22]研究表明連接肽的順序縮短導(dǎo)致纖維素酶Cel5G 對大分子底物的比活性有規(guī)律地降低;Tsutsumi 等[23]研究表明用長度相等或更長的不帶電荷的連接肽替換分子伴侶熱休克蛋白90(Heat shock protein 90,Hsp90)中的帶負(fù)電荷的連接肽,導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞,從而降低三磷酸腺苷酶(ATPase)的活性。

目前,有研究報道了連接肽對內(nèi)切木聚糖酶熱適應(yīng)性的影響(表1),其中,連接肽的刪除可使酶的最適溫度和/或熱穩(wěn)定性降低:Liu 等[24]研究表明連接肽的刪除使酶在50 ℃下處理180 min 后的剩余活性降低約10%;Miao 等[25]研究表明連接肽的刪除使酶的最適溫度降低5 ℃,并使酶在60 ℃下處理360 min 后的剩余活性降低20%;Li 等[20]研究表明連接肽的刪除使酶的最適溫度降低5℃,并使酶在65 ℃下完全失活的時間由50 min 減至5 min(表1)。此外,Meng 等[26]研究表明將連接肽替換后同樣導(dǎo)致內(nèi)切木聚糖酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性降低。這些研究表明連接肽對于內(nèi)切木聚糖酶熱適應(yīng)性的重要性,然而,其對β-木糖苷酶熱適應(yīng)性的影響機(jī)制還不清楚。

表1 連接肽對內(nèi)切木聚糖酶熱適應(yīng)性的影響Table 1 Effects of linkers on thermal adaptability of endo-xylanases

本實驗室研究人員在前期研究中從芽孢桿菌屬菌株HJ14 中克隆和表達(dá)了一個糖苷水解酶(Glycoside Hydrolase,GH)第43 家族的冷活性β-木糖苷酶HJ14GH43,并解析其晶體結(jié)構(gòu)[28]。通過基因和蛋白質(zhì)序列分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于GH43家族中的第11 亞家族[29],擁有該亞家族序列的典型結(jié)構(gòu)域特征,即HJ14GH43 由兩個結(jié)構(gòu)域組成,包括GH43 結(jié)構(gòu)域(K2 到A315;Pfam 蛋白家族:PF04616)與一個功能未知的DUF1349 結(jié)構(gòu)域(V330 到E535;PF07081),它們之間通過一個連接肽(P316 到T329;PKIEEKVFAPTYHT)相連(圖1),且Ontanon 等[30]和本實驗室前期的研究均表明,該亞家族序列是雙結(jié)構(gòu)域必需酶,突變失去DUF1349 域,突變酶不能正常折疊及催化。目前,連接肽對于β-木糖苷酶HJ14GH43 的作用尚不清楚。本研究通過對β-木糖苷酶HJ14GH43 的連接肽序列進(jìn)行替換獲得突變子MutLK10,并對突變體MutLK10 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化、酶學(xué)性質(zhì)測定和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析,旨在揭示連接肽對β-木糖苷酶熱適應(yīng)性的影響機(jī)制,從而為該酶及其它類型酶的熱適應(yīng)性改性研究提供理論參考。

圖1 野生酶HJ14GH43 的三維結(jié)構(gòu)Fig.1 3-D structure of wild-type enzyme HJ14GH43

1 試驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和試劑 重組菌株BL21(DE3)/hJ14GH43 由實驗室保存。大腸桿菌BL21(DE3)和表達(dá)載體pEasy-E1 均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 酶類及其它生化試劑 對硝基苯酚pNP 和對硝基苯基-β-D-木糖苷pNPX 均購自Sigma 公司,其它都為國產(chǎn)分析純試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl 10 g,加蒸餾水至1 000 mL,pH 自然(約為7)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加20 g/L 瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 野生型HJ14GH43 連接肽替換序列的分析 通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對 已表征過的GH43 家族第11 亞家族的β-木糖苷酶進(jìn)行搜索。搜獲后獲得的β-木糖苷酶與野生型HJ14GH43 的多序列比對通過DNAMAN(V6,中文版)分析獲得。

1.2.2 突變酶表達(dá)菌株的構(gòu)建 替換序列由蘇州泓迅生物科技股份有限公司進(jìn)行合成,然后經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnI 和EcoRI 酶切后連接到pEasy-E1 載體上。將突變體基因和酶分別命名為mutlk10 和MutLK10。將突變完成后返回的pEasy-E1-mutlk10 凍干質(zhì)粒在12 000 r/min 下離心2 min 后加入適量無菌水。通過熱激法將pEasy-E1-mutlk10 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)PCR 驗證后,挑取陽性克隆子送至上海生工公司進(jìn)行核酸測序驗證。

1.2.3 突變酶的表達(dá)和純化 將30 μL(0.1%接種量)含mutlk10 的表達(dá)菌株接種于含有30 μL氨芐青霉素(質(zhì)量濃度為100 μg/mL)的30 mL LB液體培養(yǎng)基中,在37 ℃下過夜培養(yǎng)(12~16 h)。然后,將活化后的菌液以1%的接種量分別接種于含有100 μg/mL 氨芐青霉素的新鮮LB 液體培養(yǎng)基中,于37 ℃振蕩培養(yǎng)約2~3 h(OD600達(dá)到0.6~1.0)后,加入終濃度0.1 mmol/L 的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo),于20 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20 h。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后,在4 ℃下以6 500 r/min 離心8 min 收集菌體,然后以適量的pH 7.0 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液懸浮菌體,最后在冰浴環(huán)境下超聲波破碎菌體。在4 ℃下12 000 r/min 離心10 min 后獲得上清粗酶液。將上清液上樣到預(yù)先平衡好的Ni2+-NTA 樹脂凝膠柱中,用含不同濃度咪唑(0~500 mmol/L)的試劑梯度純化重組酶。純化后的重組蛋白經(jīng)SDSPAGE 分析確定純度和分子質(zhì)量。

1.2.4 酶的特性分析 采用pNP 法測定純化的突變酶MutLK10 的活性,具體如下:將pNPX 溶于緩沖液(pH 7.0)中,使其終濃度為2 mmol/L;反應(yīng)體系含50 μL 適量酶液,450 μL 的2 mmol/L 底物;底物在反應(yīng)溫度下預(yù)熱5 min 后,加入酶液反應(yīng)10 min,然后迅速加入2 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng);待反應(yīng)溶液冷卻至室溫后在405 nm 波長下測定釋放出的pNP。1 個單位的β-木糖苷酶活性(U)被定義為每分鐘分解底物產(chǎn)生1 μmol pNP所需的酶量。

pH 6.0~8.5 緩沖液采用檸檬酸/磷酸氫二鈉緩沖液,pH 9.0 緩沖液采用甘氨酸/氫氧化鈉緩沖液。

最適反應(yīng)pH 值測定:在20 ℃條件下,將酶液置于pH 6.0~9.0 的緩沖液中進(jìn)行酶促反應(yīng),以終濃度為2 mmol/L 的pNPX 為底物,反應(yīng)10 min 后測定酶活力。

pH 穩(wěn)定性測定:將MutLK10 酶液置于pH 6.0~9.0 的緩沖液中處理1 h,然后在pH 7.0 及20℃下進(jìn)行酶促反應(yīng),以未處理的酶液作為對照,以終濃度為2 mmol/L 的pNPX 為底物,反應(yīng)10 min后測定酶活力。

最適反應(yīng)溫度測定:在pH 7.0 的緩沖液中,于0~40 ℃下進(jìn)行酶促反應(yīng),以終濃度為2 mmol/L的pNPX 為底物,反應(yīng)10 min 后測定酶活力。

溫度穩(wěn)定性測定:將酶液分別置于10 ℃和20℃處理0~60 min 后,在pH 7.0 及20 ℃下進(jìn)行酶促反應(yīng),以未處理的酶液作為對照,以終濃度為2 mmol/L 的pNPX 為底物,反應(yīng)10 min 測定酶活力。

1.2.5 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的比較分析 本實驗室研究表明HJ14GH43 的晶體結(jié)構(gòu)在自然狀態(tài)下是二聚體[28],因此,以β-木糖苷酶HJ14GH43 的晶體結(jié)構(gòu)(PDB IDS:6IFE)為模板,采用軟件HOMCOS(HOmology Modeling of Complex Structure;http://homcos.pdbj.org)建立突變體MutLK10 的三維(3-D)結(jié)構(gòu)模型[31-32]。已有研究表明該軟件生成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)模型更適合多聚體蛋白的結(jié)構(gòu)建模。所建立的模型質(zhì)量進(jìn)一步利用SAVES v6.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)中的ERRAT、拉曼圖和VERIFY 3D 進(jìn)行評估;使用PyMOL 查看蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),觀察蛋白質(zhì)表面電勢;使用UCSF Chimera 觀察蛋白質(zhì)的表面親疏水性[33]。

2 試驗結(jié)果

2.1 野生型HJ14GH43 連接肽序列的替換

通過NCBI 搜索共找到10 個已表征酶學(xué)性質(zhì)的GH43 家族第11 亞家族β-木糖苷酶(表2)。野生酶HJ14GH43 與各β-木糖苷酶的多序列比對結(jié)果如圖2 所示。從圖中可以看出來自于嗜熱脂肪地芽胞桿菌T-6 的XynB3 連接肽序列中酸性氨基酸高達(dá)42.9%,是已統(tǒng)計GH43 家族第11亞家族β-木糖苷酶中酸性氨基酸含量最高的連接肽。同時,與統(tǒng)計的其它10 個β-木糖苷酶相比,XynB3 具有最高的最適溫度,且報導(dǎo)了在最高溫度(60 ℃)下的熱穩(wěn)定性(表2)。此外,由圖2 可見XynB3 與HJ14GH43 連接肽序列的氨基酸數(shù)目相同。

圖2 野生酶HJ14GH43 與GH43 家族第11 亞家族β-木糖苷酶的部分氨基酸序列比對Fig.2 Partial amino acid sequences alignment of wild-type enzyme HJ14GH43 and other subfamily 11 of GH43 β-xylosidases

表2 野生酶HJ14GH43 與其它GH43 家族第11 亞家族β-木糖苷酶的特征Table 2 Characteristics of wide-type enzyme HJ14GH43 and other subfamily 11 of GH43 β-xylosidases

2.2 突變酶的表達(dá)和純化

mutlk10 成功轉(zhuǎn)化,并成功在大腸桿菌BL21(DE3)中得到了誘導(dǎo)表達(dá)。親和層析純化后,根據(jù)SDS-PAGE 結(jié)果,突變酶MutLK10 的蛋白質(zhì)純度達(dá)到電泳純,產(chǎn)物為大小約為61.5 ku 的單一條帶,與其535 個氨基酸計算得到的理論分子質(zhì)量相符,并和野生酶的分子質(zhì)量大小相似(圖3)。

圖3 純化的野生酶HJ14GH43 和突變酶MutLK10 的SDS-PAGE 分析結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified wild-type enzyme HJ14GH43 and its mutant MutLK10

2.3 重組酶的生化特性測定

以pNPX 為底物,野生酶HJ14GH43 和突變酶MutLK10 在pH 6.0~9.0 之間具有活性,且均在pH 7.0 下具有最佳活性(圖4a)。但在偏堿性條件下(pH 7.5~9.0),MutLK10 的相對活性小于HJ14GH43。pH 對野生酶HJ14GH43 和突變酶MutLK10 的穩(wěn)定性影響試驗的結(jié)果表明,二者在pH 7.0~8.0 的緩沖液中保持穩(wěn)定,即在pH 7.0~8.0 緩沖液中處理1 h 后均保持80%以上的相對酶活(圖4b)。

圖4 野生酶HJ14GH43 及其突變體MutLK10 的酶學(xué)性質(zhì)Fig.4 Enzymatic properties of wild-type enzyme HJ14GH43 and its mutant MutLK10

在0~40 ℃間測定溫度對野生酶HJ14GH43和突變酶MutLK10 活性的影響。由圖4c 可知,二者在0~40 ℃間都具有活性,其中野生酶HJ14GH43 的最適溫度為25 ℃,突變酶MutLK10的最適溫度為20 ℃。在25~40 ℃間MutLK10 的相對活性小于HJ14GH43。酶的熱穩(wěn)定性試驗表明野生酶HJ14GH43 在20 ℃和10 ℃下處理60 min后分別保持約70%和88%的相對酶活;突變酶MutLK10 在20 ℃和10 ℃下處理60 min 后分別保持約28%和69%的相對酶活(圖4d)。由此可見,突變酶MutLK10 的最適溫度和熱穩(wěn)定性與野生酶HJ14GH43 相比均降低。同時表明MutLK10 是一個典型的低溫活性酶。

2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的比較分析

以β-木糖苷酶HJ14GH43 的晶體結(jié)構(gòu)(PDB IDS:6IFE)為模板構(gòu)建了MutLK10 的同源模型。對MutLK10 同源模型的質(zhì)量評估顯示該模型的ERRAT 得分為93.238,拉氏圖顯示99.2%的殘基在允許區(qū)內(nèi),且98.13%的殘基擁有大于0.2 的3D/1D 值。綜上判斷該模型的可信度高。蛋白質(zhì)突變前后的表面電勢分析表明,MutLK10 的表面負(fù)電勢面積大于野生酶HJ14GH43(圖5)。蛋白質(zhì)突變前后的表面親疏水性分析表明,MutLK10 的表面親水性面積大于野生酶(圖6)。

圖5 野生酶HJ14GH43 及其突變體MutLK10 的表面電勢分布Fig.5 Charge distribution on the structural surfaces of wild-type enzyme HJ14GH43 and its mutant MutLK10

圖6 野生酶HJ14GH43 及其突變體MutLK10 的表面親疏水性Fig.6 Surface hydrophilicity and hydrophobicity of wild-type enzyme HJ14GH43 and its mutant MutLK10

3 討論

連接肽對于多結(jié)構(gòu)域酶的組裝、表達(dá)以及在各種環(huán)境下的適應(yīng)性起重要作用[26]。目前,連接肽影響木聚糖酶熱適應(yīng)性的機(jī)制尚未確定。此外,尚無報導(dǎo)研究β-木糖苷酶中連接肽對酶熱適應(yīng)性的影響。通過分析11 個GH43 家族β-木糖苷酶的連接肽(包含HJ14GH43),發(fā)現(xiàn)連接肽中酸性氨基酸比例最高的XynB3 具有最高的最適溫度且報導(dǎo)了在最高溫度下的熱穩(wěn)定性。Ding 等[41]的研究發(fā)現(xiàn)來自于海洋噬糖菌屬模式菌株2-40T的淀粉酶SdG5A 在連接肽區(qū)域同樣具有高比例的酸性氨基酸,然而,該酶是冷適應(yīng)性淀粉酶;SdG5A 連接肽區(qū)域中高比例的酸性氨基酸所帶來的靜電排斥作用和穩(wěn)定的水化層驅(qū)使SdG5A 適應(yīng)低溫環(huán)境。由此可見,連接肽區(qū)域中酸性氨基酸比例對酶熱穩(wěn)定性的影響具有不確定性。本研究通過將HJ14GH43 的連接肽序列替換成XynB3的連接肽序列,揭示了連接肽中的酸性氨基酸比例對β-木糖苷酶HJ14GH43 熱適應(yīng)性的影響,即高比例的酸性氨基酸連接肽序列使突變酶Mut-LK10 的最適溫度和熱穩(wěn)定性均低于野生酶。

先前的研究表明,典型的低溫活性酶在低于30 ℃的溫度下顯示出最大活性,且在高于40 ℃的溫度下穩(wěn)定性差[42]。由此可見,MutLK10 是一個典型的GH43 家族低溫活性β-木糖苷酶。酶的低溫適應(yīng)性引起了人們極大的關(guān)注和興趣,例如,張明慧等[43]獲得了GH43 家族低溫木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷酶AX543,與MutLK10 不同的是,AX543 是單結(jié)構(gòu)域的GH43 家族酶。低溫酶在食品、精細(xì)化工品、醫(yī)藥等工業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力,對節(jié)約能源,降低生產(chǎn)成本,防止微生物污染和防止產(chǎn)品營養(yǎng)價值及風(fēng)味降低具有重要作用[44-45],原因在于一方面,低溫環(huán)境覆蓋了80%以上的地球生物圈(例如,90%的海水≤5 ℃),包括永久寒冷的深海、阿爾卑斯山等山脈、極地等[46],適應(yīng)低溫(低于25℃)的酶具有加熱成本低和反應(yīng)環(huán)境方便的優(yōu)點[47];另一方面,低溫活性越高的酶往往具有更高的熱敏性,該特性使酶的催化反應(yīng)更容易得到控制并使酶的使用更具安全性[44-45,48]。

低溫會嚴(yán)重影響酶和周圍水的性質(zhì)和結(jié)構(gòu),因為隨著環(huán)境中溫度的降低,蛋白質(zhì)表面周圍的水分子變得更有序,從而與蛋白質(zhì)的結(jié)合更少,最終將系統(tǒng)平衡推向展開或變性狀態(tài)[49-50]。因此,冷活性酶需要通過一些結(jié)構(gòu)適應(yīng)性來增加蛋白質(zhì)表面與溶劑的相互作用,例如增加蛋白質(zhì)表面的負(fù)電勢[51]。不少研究論證了蛋白質(zhì)表面靜電相互作用與酶熱適應(yīng)性之間的關(guān)系。例如,Karan 等[51]表明極端酶可通過增大表面負(fù)電勢來競爭水合作用,從而增加酶與溶劑的相互作用并使酶在低溫下也能保持活性。Sriprang 等[52]、Turunen 等[53]的研究表明通過在木聚糖酶的Ser/Thr 平面引入帶正電的精氨酸后,由于精氨酸的胍基促進(jìn)了電荷間交互作用的進(jìn)行,因而該酶的熱穩(wěn)定性提高。此外,一個來自于殺鮭異弧菌的冷活性鐵超氧化物歧化酶的晶體結(jié)構(gòu)展現(xiàn)了蛋白質(zhì)表面凈負(fù)電荷的增加[54]。在本研究中,用酸性氨基酸含量高的連接肽替換野生酶HJ14GH43 的連接肽,導(dǎo)致突變體MutLK10 的連接肽區(qū)域負(fù)電勢面積增加,親水性面積增加。酸性氨基酸帶來的負(fù)電勢能與鹽離子競爭水而發(fā)生水合作用,同時,由于酸性氨基酸中的羧基比其它基團(tuán)更親水,因而酸性氨基酸具有較強(qiáng)的水結(jié)合能力[55]。蛋白質(zhì)表面親水性的增加促進(jìn)了酶與溶劑的相互作用并幫助蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的水化層[51],最終使酶能適應(yīng)低溫環(huán)境。

4 結(jié)論

本研究通過對β-木糖苷酶HJ14GH43 中的連接肽進(jìn)行替換,并對序列替換后所得突變體進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)、純化、酶學(xué)性質(zhì)測定和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析,從而研究連接肽對HJ14GH43 熱適應(yīng)性的影響。連接肽序列替換后的突變體MutLK10 的最適溫度和熱穩(wěn)定性與野生酶HJ14GH43 相比均降低;同時,與野生酶HJ14GH43 相比,突變酶Mut-LK10 連接肽區(qū)域的負(fù)電勢面積增大,親水性面積增加,其機(jī)理為增大連接肽中的酸性氨基酸比例能使β-木糖苷酶通過增大表面負(fù)電勢來競爭水合作用,從而增加酶在低溫下與溶劑的相互作用,使酶在低溫下仍然能形成穩(wěn)定的水化層,維持酶的活性結(jié)構(gòu),并最終使酶能適應(yīng)低溫環(huán)境。本研究可為理解酶的溫度適應(yīng)性機(jī)理和為酶的改性研究提供理論基礎(chǔ),為研究連接肽的作用提供參考。

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