陳玉潔，關(guān)榮發(fā)，黃海智，鐘 浩，孫玉敬，張 維

（1 中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310018 2 浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 杭州 310014）

正常生理?xiàng)l件下，體內(nèi)的自由基維持在正常生理范圍內(nèi)，然而，外界因素的刺激會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化反應(yīng)不均衡，當(dāng)體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量自由基時(shí)，會(huì)損害細(xì)胞和組織[1-2]，造成細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、代謝酶類及功能蛋白等物質(zhì)活性的喪失[3]，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，產(chǎn)生炎癥[4]。腸上皮細(xì)胞因氧化應(yīng)激而產(chǎn)生的氧化損傷，會(huì)引起腸道屏障功能喪失[5]。自由基使機(jī)體的性能下降，增加各種疾病的發(fā)病率，包括癌癥、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，被認(rèn)為是導(dǎo)致機(jī)體衰老的一個(gè)重要因素[6]。安全有效的天然抗氧化劑受到越來(lái)越多的關(guān)注。

花青素是一種天然的水溶性類黃酮化合物，在許多植物的根以及谷物中廣泛存在[7-8]?；ㄇ嗨鼐哂星宄杂苫?、抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤及預(yù)防心血管疾病等多種生物活性[9-12]。然而，花青素存在穩(wěn)定性較低，易降解的問(wèn)題，容易受到如溫度、酶光等外界因素的影響而發(fā)生降解[13-16]，其應(yīng)用受限制。研究表明[17-18]，脂質(zhì)體在改善包裝材料的生物穩(wěn)定性、吸收和生物利用度方面比傳統(tǒng)配方有優(yōu)勢(shì)。脂質(zhì)體是一種人工磷脂雙層膜，具有類似細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，攜帶疏水和親水化合物，作為物理化學(xué)屏障，增加親脂化合物在水中的溶解度[19-22]。利用脂質(zhì)體作為載體，可以提高包材的溶出率和靶向性，提高脂質(zhì)體的緩釋效果，有效延緩包材的釋放。

本試驗(yàn)以脂質(zhì)體作為載體制備越橘花青素脂質(zhì)體，用過(guò)氧化氫處理人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞Caco-2細(xì)胞，制備細(xì)胞氧化損傷模型，研究越橘花青素脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

越橘花青素（≥25%），陜西清雅生物科技有限公司；人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Caco-2、MEM 培養(yǎng)基、慶大霉素-兩性霉素B 混合溶液，上海啟達(dá)生物科技有限公司；卵磷脂、膽固醇、DMSO、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖溶液PBS、試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清，上海雙洳生物科技有限公司；其它試劑為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1200 紫外分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；RV10 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA 公司；GENIOS-BASIC 型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Nano-ZS90 馬爾文粒徑儀，英國(guó)Malvern公司；JEM-2100 透射電子顯微鏡，日本株式會(huì)社；TC20 全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；i-Mark 酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；TS100 倒置生物顯微鏡，日本Nikon 尼康公司；930N 熒光分光光度計(jì)，上海儀電有限公司；Allegra X-30R 冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；YXQ-SG46-280S 蒸汽壓力滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-1C 型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 越橘花青素脂質(zhì)體的制備 越橘花青素脂質(zhì)體的制備采用薄膜分散法，稱取藥脂比1∶11，膽脂比1∶5 的花青素、大豆卵磷脂和膽固醇溶于10 mL 無(wú)水乙醇中，并置超聲儀中超聲20 min，使其完全溶解形成混合物。將混合物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，當(dāng)梨形瓶的瓶底形成均勻的脂質(zhì)薄膜后，加入預(yù)熱的PBS 洗脫脂質(zhì)薄膜，冰水浴超聲20 min，獲得脂質(zhì)體懸濁液。分別用0.45 μm 和0.22 μm 的濾膜過(guò)濾脂質(zhì)體懸濁液，置于冰箱4℃保存。

1.3.2 脂質(zhì)體的微觀表征 采用透射電子顯微鏡觀察越橘花青素脂質(zhì)體的形態(tài)，激光馬爾文粒徑儀測(cè)定其粒徑分布。取1 mL 脂質(zhì)體并加PBS 稀釋10 倍后，用移液槍吸取1 滴于透射電鏡樣品專用銅網(wǎng)（直徑3 mm，200 目）上，加入1 滴2%乙酰雙氧鈾溶液進(jìn)行負(fù)染色，在室溫放置5 min，干燥后用透射電子顯微鏡觀察。

1.3.3 脂質(zhì)體儲(chǔ)藏穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 將制備的越橘花青素脂質(zhì)體于4 ℃條件下保存，在一定的時(shí)間（21 d）內(nèi)測(cè)量其粒徑和pH 值的變化，分別用馬爾文粒徑儀和pH 計(jì)測(cè)定。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有20%胎牛血清、1%雙抗的MEM 培養(yǎng)基中，置37 ℃、5% CO2（相對(duì)濕度90%）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d 更換1 次培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度80%時(shí)，用含有0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞做試驗(yàn)。

1.3.5 細(xì)胞的毒性試驗(yàn) 研究越橘花青素及其脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞的抗氧化作用，需了解其作用于Caco-2 細(xì)胞的安全濃度范圍，在此范圍進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[23]。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2 細(xì)胞按照1.0×105cells/mL 的密度接種到96 孔板中培養(yǎng)，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，在37 ℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，試驗(yàn)組中加入10 μL 不同濃度的樣品，將樣品稀釋，最終質(zhì)量濃度分別為20，50，100，150，200 μg/mL，每組設(shè)6 個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)置空白組和對(duì)照組。共培養(yǎng)12 h 后，每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)光吸收值A(chǔ)490nm。

1.3.6 越橘花青素脂質(zhì)體對(duì)氧化損傷Caco-2 細(xì)胞的保護(hù)作用 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2 細(xì)胞按照1.0×105cells/mL 的密度接種到96 孔板中培養(yǎng)，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，于37 ℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置空白組、正常組、損傷組和保護(hù)組。以200 μmol/L H2O2刺激誘導(dǎo)12 h，保護(hù)組加入不同質(zhì)量濃度（20，50，100，150，200 μg/mL）的越橘花青素脂質(zhì)體，繼續(xù)培養(yǎng)6 h 并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[24]。

1.3.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的測(cè)定 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量測(cè)定方法參照DCFH-DA 熒光探針?lè)╗23]。將對(duì)數(shù)期Caco-2 細(xì)胞以6×105cells/孔的密度接種于6 孔板，置于37 ℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。設(shè)置正常組、損傷組、保護(hù)組。以200 μmol/L H2O2刺激誘導(dǎo)12 h，保護(hù)組加入不同濃度（20，50，100，150，200 μg/mL）的花青素脂質(zhì)體溶液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。具體操作步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)各組細(xì)胞在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)528 nm 處的熒光強(qiáng)度。

1.3.8 細(xì)胞內(nèi)MDA 含量的測(cè)定 MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量可以反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度[25]。本試驗(yàn)采用丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒對(duì)Caco-2 細(xì)胞中MDA 含量進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞按前述分組處理并培養(yǎng)，加入細(xì)胞裂解液，在冰上裂解細(xì)胞，獲得樣品。根據(jù)試劑盒方法操作，根據(jù)樣品蛋白濃度計(jì)算MDA 含量。

1.3.9 細(xì)胞內(nèi)總抗氧化能力（T-AOC）的測(cè)定 TAOC 可以反映機(jī)體抗氧化能力。采用總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒對(duì)Caco-2 細(xì)胞中T-AOC 的含量進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞按前述分組處理并培養(yǎng)，收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的提取液，勻漿或超聲以充分破碎細(xì)胞并釋放其中的抗氧化物。獲得的樣品在4 ℃，10 000 r/min 條件下離心5 min，取上清液，待測(cè)。據(jù)樣品蛋白濃度計(jì)算T-AOC 含量。

1.3.10 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性的測(cè)定 細(xì)胞按前述分組處理并進(jìn)行培養(yǎng)后。收集細(xì)胞，離心后棄上清。加入提取液，超聲破碎細(xì)胞，4 ℃，8 000×g 條件下離心10 min，取上清，置冰上，待測(cè)。根據(jù)SOD和CAT 試劑盒方法操作，據(jù)樣品蛋白濃度計(jì)算各抗氧化酶含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與與分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果用均值（means）±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示，采用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 26.0 軟件進(jìn)行繪圖和結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂質(zhì)體的表征

脂質(zhì)體的形態(tài)和粒徑分析采用透射電鏡和馬爾文粒徑分析儀。如圖1a 所示，透射電鏡結(jié)果顯示脂質(zhì)體呈球形分布，具有囊泡狀結(jié)構(gòu)。圖1b 為脂質(zhì)體的分布。所得脂質(zhì)體的平均粒徑為（213.2±13.4）nm，多分散性指數(shù)（PDI）為0.201±0.026。

圖1 花青素脂質(zhì)體掃描電鏡和粒徑分布圖Fig.1 The image and size distribution of anthocyanins liposomes

2.2 脂質(zhì)體的穩(wěn)定性

21 d 儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)花青素脂質(zhì)體粒徑和pH 值變化見(jiàn)圖2。隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，越橘花青素脂質(zhì)體的粒徑呈上升趨勢(shì)。0～7 d 內(nèi)粒徑緩慢增加，基本在230 nm 左右，之后持續(xù)增加，穩(wěn)定在320 nm 左右。隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，脂質(zhì)體會(huì)因氧化作用而聚集，從而導(dǎo)致其粒徑變大[26]。脂質(zhì)體的pH 值在0～15 d 處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，15 d 后逐漸增大。所以，用于試驗(yàn)的脂質(zhì)體每次均新鮮制備，以防止其特征及理化指標(biāo)發(fā)生變化，減小試驗(yàn)誤差。

圖2 時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體粒徑和pH 的影響Fig.2 Effect of time on the particle size and pH of liposomes

2.3 越橘花青素脂質(zhì)體對(duì)Caco-2 細(xì)胞的毒性情況

根據(jù)CCK-8 法評(píng)估越橘花青素及其脂質(zhì)體作用Caco-2 細(xì)胞12 h 后的細(xì)胞存活率，見(jiàn)圖3。與對(duì)照組比，20～200 μg/mL 越橘花青素及其脂質(zhì)體對(duì)Caco-2 細(xì)胞沒(méi)有毒性作用，可在此范圍做后續(xù)試驗(yàn)研究。

圖3 花青素及其脂質(zhì)體對(duì)Caco-2 細(xì)胞活性的影響Fig.3 Effects of anthocyanins and anthocyanins liposomes on the activity of Caco-2 cells

2.4 越橘花青素脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

不同濃度的越橘花青素及其脂質(zhì)體對(duì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞存活率的影響見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，損傷組的Caco-2 細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后生存率下降（P＜0.05）。經(jīng)不同濃度的越橘花青素脂質(zhì)體處理的保護(hù)組，細(xì)胞生存率呈上升趨勢(shì)。同時(shí)，越橘花青素脂質(zhì)體對(duì)氧化損傷Caco-2 細(xì)胞的保護(hù)作用存在劑量效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）。當(dāng)越橘花青素脂質(zhì)體質(zhì)量濃度為20 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率（57.34±3.86）%，當(dāng)其質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率最高（84.17±2.49）%，高于花青素組的（74.33±4.42）%。在選取范圍內(nèi)，越橘花青素脂質(zhì)體濃度越高，對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果越好。

圖4 花青素及其脂質(zhì)體對(duì)H2O2 損傷下Caco-2細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.4 Protective effect of anthocyanins and anthocyanins liposomes on Caco-2 cells under H2O2 injury

2.5 越橘花青素脂質(zhì)體對(duì)氧化損傷Caco-2 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響

ROS 的積累會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不同程度的損傷[27]。采用DCFH-DA 熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的變化。DCFH-DA 進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，而細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無(wú)熒光的DCFH 生成有熒光的DCF。檢測(cè)DCF 的熒光強(qiáng)度便可知道細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平。如圖5所示，與空白組相比，氧化損傷組的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.05），表明ROS 含量增加。經(jīng)不同質(zhì)量濃度花青素脂質(zhì)體（20，50，100，150，200 μg/mL）處理的保護(hù)組，熒光強(qiáng)度逐漸減弱，在樣品質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL 后趨于平緩。結(jié)果顯示，花青素脂質(zhì)體可以降低氧化損傷的細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。

圖5 花青素及其脂質(zhì)體處理H2O2 損傷后各組DCFH-DA 相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig.5 The relative fluorescence intensity of DCFH-DA in each group after the injury of H2O2 treated by anthocyanins and anthocyanins liposomes

圖6 花青素及其脂質(zhì)體處理H2O2 損傷后各組MDA 含量Fig.6 The MDA content in each group after the injury of H2O2 treated by anthocyanins and anthocyanins liposomes

2.6 越橘花青素脂質(zhì)體對(duì)氧化損傷Caco-2 細(xì)胞內(nèi)MDA 含量的影響

MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其含量可間接反映細(xì)胞受活性氧自由基攻擊的程度[28]。經(jīng)H2O2處理后，Caco-2 細(xì)胞中MDA 含量升高（P＜0.05）。經(jīng)不同質(zhì)量濃度花青素脂質(zhì)體（20，50，100，150，200 μg/mL）處理后，氧化損傷細(xì)胞內(nèi)MDA 含量呈遞減趨勢(shì)。相對(duì)于損傷組，花青素和花青素脂質(zhì)體在最大濃度組分別下降了43.44%，53.66%。結(jié)果顯示，花青素脂質(zhì)體可以降低氧化損傷的細(xì)胞內(nèi)MDA 水平。

2.7 越橘花青素脂質(zhì)體對(duì)氧化損傷Caco-2 細(xì)胞內(nèi)T-AOC 含量的影響

總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7。經(jīng)不同質(zhì)量濃度花青素脂質(zhì)體（20，50，100，150，200 μg/mL）處理后，相對(duì)于損傷組，處理組的抗氧化能力顯著提高（P＜0.05），200 μg/mL 組花青素和花青素脂質(zhì)體分別提高了3.42，8.89 倍。以上結(jié)果顯示，花青素脂質(zhì)體可以降低氧化損傷Caco-2 細(xì)胞內(nèi)自由基水平，抑制氧化應(yīng)激所致細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，提高細(xì)胞總抗氧化能力。

圖7 花青素脂質(zhì)體處理H2O2 損傷后各組T-AOC 含量Fig.7 The T-AOC content in each group after the injury of H2O2 treated by anthocyanins and anthocyanins liposomes

圖8 花青素脂質(zhì)體對(duì)H2O2 損傷后各組抗氧化酶活性影響Fig.8 The activity of antioxidant enzymes in each group after the injury of H2O2 treated by anthocyanins and anthocyanins liposomes

2.8 越橘花青素脂質(zhì)體對(duì)氧化損傷Caco-2 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的影響

細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化酶是氧化應(yīng)激過(guò)程中的重要角色[29-30]。經(jīng)H2O2處理后，Caco-2 細(xì)胞中SOD和CAT 的酶活性顯著降低（P＜0.05）。經(jīng)不同濃度紫菜薹乙醇提取物處理后，氧化損傷細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT 酶的活性增高。與損傷組比，200 μg/mL花青素與花青素脂質(zhì)體組的SOD 酶活性分別提高了5.76%，8.79%；CAT 酶活性分別提高了9.21%，12.26%。花青素脂質(zhì)體可以提高受損Caco-2 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活力。

3 結(jié)論

花青素具有多種生物活性[31-32]，然而，容易受到外界作用而發(fā)生降解。以脂質(zhì)體作為載體，通過(guò)囊泡狀脂質(zhì)體的包封和運(yùn)載，可以增加花青素的穩(wěn)定性和生物利用度[33-34]。本研究以脂質(zhì)體為載體制備越橘花青素脂質(zhì)體，利用H2O2作用于Caco-2細(xì)胞，獲得氧化損傷模型，研究越橘花青素脂質(zhì)體對(duì)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞的抗氧化作用。結(jié)果表明，越橘花青素經(jīng)脂質(zhì)體包裹后抗氧化活性有所提高，可顯著提升受損細(xì)胞的生存率，抑制氧化損傷引發(fā)的細(xì)胞死亡。此外，越橘花青素經(jīng)脂質(zhì)體包裹后可進(jìn)一步抑制氧化損傷細(xì)胞內(nèi)ROS 和MDA 的生成，提高細(xì)胞中內(nèi)源性抗氧化物酶系的活力和細(xì)胞總抗氧化能力，可以通過(guò)多種途徑保護(hù)細(xì)胞[24，35]。本結(jié)果為提高花青素利用率提供試驗(yàn)依據(jù)。