李惠華 吳美芳 王偉 徐夙俠

摘 要：探索枇杷（Eriobotrya japonica L.）外泌體及細(xì)胞液對(duì)體外人皮膚細(xì)胞的生物活性，為其在護(hù)膚品上的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。采用超高速離心法和機(jī)械破碎法分別獲得枇杷外泌體和細(xì)胞液，以CCK8 法檢測(cè)不同濃度枇杷葉來源外泌體、枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)來源的外泌體及其細(xì)胞液對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）存活率的影響；對(duì)HSF 細(xì)胞采用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）處理進(jìn)行炎癥造模，選取顯著促進(jìn)細(xì)胞存活率的濃度，后續(xù)開展添加外泌體或細(xì)胞液處理，進(jìn)行細(xì)胞凋亡及遷移能力檢測(cè)。對(duì)黑色素瘤細(xì)胞（A375）開展外泌體或細(xì)胞液處理，進(jìn)行黑色素含量及酪氨酸酶活性檢測(cè)。結(jié)果表明：每克枇杷葉含8.54×109 個(gè)外泌體顆粒，粒徑86.78 nm；每毫升（約1 g）枇杷懸浮細(xì)胞上清液中含8.67×108 個(gè)外泌體顆粒，粒徑80.39 nm。濃度為20 μg/mL 時(shí)，枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細(xì)胞外泌體、枇杷懸浮細(xì)胞液均顯著提高體外HSF 細(xì)胞存活率（P<0.05）。與陽性對(duì)照（LPS 處理）相比，枇杷葉外泌體濃度為20 μg/mL，枇杷懸浮細(xì)胞外泌體濃度為20 μg/mL 和枇杷懸浮細(xì)胞液濃度為10 μg/mL 時(shí)，均極顯著降低LPS 處理引起的細(xì)胞凋亡（P<0.01），均顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移（P<0.05）。濃度為5 μg/mL 的枇杷懸浮細(xì)胞外泌體和枇杷懸浮細(xì)胞液均可顯著降低體外A375 細(xì)胞黑色素含量，枇杷細(xì)胞液還顯著降低酪氨酸酶活性（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：枇杷；外泌體；懸浮細(xì)胞；細(xì)胞液；護(hù)膚功效

中圖分類號(hào)：TS209 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

枇杷（Eriobotrya japonica L.）為薔薇科枇杷屬植物，其葉及花有清肺止咳、和胃降逆、止渴之功效[1]，是傳統(tǒng)藥食同源植物。枇杷葉（果）提取物、葉原生質(zhì)體已收錄于《已使用化妝品原料目錄（2021 年版）》。由于枇杷果期（保存期）短，分布地域狹窄，導(dǎo)致果實(shí)應(yīng)用基本停留在鮮食和粗加工產(chǎn)品上，枇杷葉或花則在止咳清熱的中藥組方中長(zhǎng)期無新的突破，大大降低了枇杷的高值利用。

研究表明，枇杷的應(yīng)用還可以拓展到很多領(lǐng)域，如治療尋常型痤瘡[2-3]，卷煙加香[4]，揮發(fā)性成分可以直接吸入肺部給藥[5-6]等。目前，有必要結(jié)合新熱點(diǎn)和新技術(shù)對(duì)枇杷的應(yīng)用進(jìn)行新的拓展。

外泌體（exosome）首次發(fā)現(xiàn)于1983 年，是一種細(xì)胞內(nèi)膜衍生的納米級(jí)囊泡，存在于動(dòng)物、植物以及微生物中[7]。它具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)而高度穩(wěn)定，可保護(hù)內(nèi)含物（一般為復(fù)雜核酸和特異蛋白）免受降解并運(yùn)送至受體細(xì)胞[8-9]。其自身也具有某些生物活性，如參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[10-11]，通過細(xì)胞介質(zhì)傳遞影響其他細(xì)胞功能[12]，可作為癌癥、免疫性疾病等早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志[13]。

此外，外泌體在跨界細(xì)胞或物種間有廣泛的應(yīng)用前景[14-15]，如間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可促進(jìn)燙傷后皮膚的恢復(fù)及再生[16]；人血小板外泌體可改善面部光損傷和皮膚老化的各種臨床指標(biāo)，并具安全性和良好耐受性[17]。生姜外泌體可重塑腸道菌群、緩解結(jié)腸炎[18]；景天外泌體可抗肺纖維化[19]；牛奶、生姜外泌體可作為天然納米載體以提高藥物利用率[20-21]；外泌體可作為基因或細(xì)胞治療中理想的藥物或傳送遞質(zhì)[22]。外泌體已成為生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等研究的熱點(diǎn)。

采用枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)三萜類次生物質(zhì)，是不同于現(xiàn)有從枇杷葉提取的另一有效途徑[22-24]。項(xiàng)目組前期研究表明，通過枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)能夠產(chǎn)生幾倍至十幾倍高于枇杷原植株的五環(huán)三萜類化合物，原廢棄的細(xì)胞培養(yǎng)液中易分離制備豐富的外泌體。目前缺乏枇杷外泌體和細(xì)胞液功能的相關(guān)研究報(bào)道。本研究基于已建立的優(yōu)良的枇杷懸浮細(xì)胞系，分離外泌體及其細(xì)胞液，以鮮枇杷葉分離外泌體，探索這3 種材料對(duì)體外人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）的功效以及對(duì)黑色素含量和酪氨酸酶活性的影響，以期為枇杷細(xì)胞今后在護(hù)膚品領(lǐng)域的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

已有懸浮培養(yǎng)的枇杷細(xì)胞系（早鐘6 號(hào)），誘導(dǎo)自幼果，由福建省亞熱帶植物研究所誘導(dǎo)、優(yōu)化并長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)，具體技術(shù)參見文獻(xiàn)[25-26]。

液體培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)液附加NAA 0.5 mg/L，茉莉酸甲酯（MeJ）375 mg/L，蔗糖2%，pH 5.8，培養(yǎng)條件為：接種量8 g/100 mL，溫度25 ℃，白熾燈400 Lux，轉(zhuǎn)速130 r/min，于250 mL 三角瓶（裝液量130 mL）中。接種后10 d 收獲。

選取早鐘6 號(hào)枇杷頂端第2 對(duì)嫩葉，2021 年9 月采收于福建省亞熱帶植物研究所藥用植物資源圃。

人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）、人黑色素瘤（A375）細(xì)胞購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外泌體分離及鑒定 采用超高速離心法分離外泌體。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的枇杷懸浮細(xì)胞液250 mL，于4 ℃，5000 r/min，離心5 min，收集上清200 mL（約為200 g）；4 ℃，150 000 r/min，離心120 min，棄上清，預(yù)冷PBS 300 μL 重懸沉淀，0.45 μm 濾膜除菌，–80 ℃?zhèn)溆?。取枇杷葉片65 g，破壁機(jī)研磨獲取汁液，4 ℃，5000 r/min，離心20 min，收集上清；4 ℃，10 000 r/min，離心40 min，收集上清；4 ℃，150 000 r/min，離心120 min，棄上清，預(yù)冷PBS 300 μL 重懸沉淀，0.45 μm 濾膜除菌，–80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

利用透射電子顯微鏡Hitachi HT-7700 觀察外泌體形態(tài)；采用粒徑分析儀NanoFCM N30E 檢測(cè)外泌體的粒徑和濃度信息；利用多功能酶標(biāo)儀Thermo Varioskan LUX 采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，具體步驟如下：（1）在37 ℃中速融外泌體，并迅速加入5×RIPA 裂解液；（2）混勻后在冰上裂解30 min，期間混勻；（3）配制BCA 法測(cè)蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，并取5 μL 樣品加至BCA 混合液中，混勻；（4）37 ℃孵育30 min，酶標(biāo)儀上，在562 nm 處測(cè)吸光值并記錄；（5）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測(cè)樣品的蛋白濃度。

1.2.2 枇杷懸浮細(xì)胞液的分離鑒定 取1 g 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的枇杷懸浮細(xì)胞在超凈臺(tái)中研磨破碎，加入1 mL PBS 重懸得到細(xì)胞液，4 ℃，5000 r/min，離心5 min，收集上清獲得枇杷懸浮細(xì)胞液，0.45 μm 過濾除菌，采用BCA 法測(cè)蛋白濃度，具體方法同1.2.1，于–80 ℃保存，備用。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）、人黑色素瘤（A375）在含有1%雙抗、10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液（HSF 使用1640 培養(yǎng)基，A375 使用DMEM 培養(yǎng)基），37 ℃、5% CO2 保持飽和濕度培養(yǎng)，細(xì)胞密度約80%～90%時(shí)進(jìn)行常規(guī)傳代。

1.2.4 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 HSF 細(xì)胞按照5000 個(gè)/ 孔鋪于96 孔板， 待細(xì)胞貼壁后用10 μg/mL 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）處理HSF 細(xì)胞20 h 進(jìn)行炎癥造模，添加含或不含外泌體或細(xì)胞液的完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞48 h。模型細(xì)胞作陽性對(duì)照，正常未處理細(xì)胞為陰性對(duì)照，設(shè)置6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。處理48 h 后，加入CCK8 試劑進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，2 h 內(nèi)讀取OD450 值。HSF細(xì)胞按照3×105 個(gè)/孔鋪板至6 cm 板，待細(xì)胞貼壁后使用。

1.2.5 流式雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的E606336-0020Annexin V 凋亡檢測(cè)試劑盒，F(xiàn)ITC/PI 雙染法，胰酶消化細(xì)胞，1200 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞，PBS洗滌2 次；195 μL 1×Binding buffer 懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC ， 4 ℃ 避光孵育10～15 min；加入200 μL 1×Binding buffer 洗滌細(xì)胞、1200 r/min 離心5 min，棄上清；190 μL 1×Bindingbuffer 懸浮細(xì)胞，加10 μL PI 混勻后上機(jī)檢測(cè)。

設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 （1）取消化HSF 細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基洗3 次，計(jì)數(shù)，配成濃度為5×105 個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液；上室每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液。（2）下室中加入500 μL 含10%血清及工作濃度為10 μg/mL 的LPS 完全培養(yǎng)基。（3）37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20 h 后，去除下室培養(yǎng)基，添加含5 μg/mL 外泌體進(jìn)行處理，48 h后，檢測(cè)穿過的細(xì)胞數(shù)。取上室，以棉簽拭去小室濾膜上的細(xì)胞。用PBS 洗后將小室置于4%多聚甲醇固定20 min，棄固定液，用1%結(jié)晶紫乙醇溶液孵育30 min 進(jìn)行染色，用1×PBS 洗后倒置于普通顯微鏡下隨機(jī)拍照。設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.7 黑色素含量檢測(cè) 將人黑色素瘤（A375）細(xì)胞按照2×107 個(gè)/孔鋪板至15 cm 板，待細(xì)胞貼壁后添加含/不含外泌體或細(xì)胞液的完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞72 h。將所有樣本蛋白濃度調(diào)整為5.77 μg/μL，取100 μL 用于測(cè)定OD470。設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.8 酪氨酸酶活性檢測(cè) 在總體積3.0 mL 的酶活反應(yīng)體系中，加入200 μL 含577 μg 蛋白樣本和0.5 mmol/L 左旋多巴底物溶液2.8 mL，充分混勻，37 ℃水浴保溫10 min 后，于波長(zhǎng)475 nm處測(cè)得樣品吸光度值（A）。設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

相對(duì)酪氨酸酶活性=加藥處理組A475/空白對(duì)照組A475。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，利用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析2.1 外泌體形態(tài)及大小由鮮枇杷嫩葉分離的外泌體（E-leaf-exo）和枇杷懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液上清分離獲得的外泌體，即枇杷懸浮細(xì)胞外泌體（E-suspension-exo）具體形態(tài)見圖1，從圖1 可看出二者外部形態(tài)類似，均呈現(xiàn)典型的茶托狀外泌體。利用粒徑分析儀檢測(cè)外泌體的粒徑和顆粒數(shù)（圖2），結(jié)合方法1.2.1中起始樣本量，枇杷葉外泌體和枇杷懸浮細(xì)胞外泌體粒徑分別為86.78、80.39 nm；每克枇杷葉含8.54×109 個(gè)外泌體顆粒；每毫升（約1 g）枇杷懸浮細(xì)胞上清中含8.67×108 個(gè)外泌體顆粒。利用該方法獲得的枇杷葉外泌體平均粒徑大于枇杷懸浮細(xì)胞外泌體平均粒徑。每克枇杷葉中外泌體的顆粒含量約是每毫升（約1 g）枇杷懸浮細(xì)胞上清液外泌體含量的10 倍?；谛螒B(tài)上的完整性判斷，以上2 種材料提取的外泌體均可用于后續(xù)研究。

2.2 蛋白指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，結(jié)果表明，枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細(xì)胞外泌體、枇杷懸浮細(xì)胞液蛋白濃度分別為0.683、2.766、0.212 μg/μL，并根據(jù)此數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)定量實(shí)驗(yàn)。結(jié)合以上蛋白濃度和樣本的起始量可知，每克枇杷細(xì)胞中含蛋白2.766×103 μg，每克枇杷葉外泌體中含蛋白3.152 μg，每毫升（約1 g）枇杷懸浮細(xì)胞上清液提取的外泌體中含蛋白0.318 μg，單位質(zhì)量的枇杷葉和枇杷懸浮細(xì)胞上清液的外泌體蛋白含量相差約10 倍。

2.3 CCK8 法檢測(cè)

細(xì)胞存活率采用CCK8 法檢測(cè)不同濃度外泌體或細(xì)胞液對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）存活率的影響，結(jié)果如表1 所示，與空白對(duì)照（0 μg/mL）相比，20 μg/mL 的枇杷葉外泌體和枇杷懸浮細(xì)胞外泌體能夠顯著提高HSF 細(xì)胞存活率（P<0.05），10 μg/mL 枇杷懸浮細(xì)胞液能夠顯著提高HSF 細(xì)胞存活率（P<0.05）。20 μg/mL 的枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細(xì)胞外泌體、枇杷懸浮細(xì)胞液均顯著提高體外HSF 細(xì)胞存活率（P<0.05）。枇杷懸浮細(xì)胞液10、20 μg/mL 濃度水平組間的HSF 細(xì)胞存活率無顯著差異，未呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)。

根據(jù)以上結(jié)果，選取對(duì)細(xì)胞存活率有顯著影響的濃度：20 μg/mL 枇杷葉外泌體、20 μg/mL 枇杷懸浮細(xì)胞外泌體和10 μg/mL 枇杷懸浮細(xì)胞液作為后續(xù)研究。后續(xù)將采用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）處理HSF 細(xì)胞進(jìn)行炎癥造模，添加外泌體或細(xì)胞液處理，進(jìn)行細(xì)胞凋亡及遷移能力檢測(cè)。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖3 所示，LPS 處理后，右下象限的凋亡細(xì)胞比例增加。對(duì)HSF 細(xì)胞進(jìn)行炎癥造模，再加入枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細(xì)胞外泌體以及枇杷細(xì)胞液處理后，與LPS處理組比較，右下象限的凋亡細(xì)胞比例減少。表明HSF 細(xì)胞經(jīng)過LPS 處理后，細(xì)胞凋亡水平顯著上調(diào)；繼而進(jìn)行藥劑干預(yù)，細(xì)胞凋亡均顯著降低，其中，枇杷葉外泌體對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制程度顯著優(yōu)于枇杷懸浮細(xì)胞外泌體和枇杷細(xì)胞液，而枇杷懸浮細(xì)胞外泌體和枇杷細(xì)胞液組間無顯著性差異（表2）。

2.5 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)

在Transwell 檢測(cè)人皮膚成纖維細(xì)胞LPS 炎癥模型中，外泌體或細(xì)胞液共孵育48 h 后，細(xì)胞遷移能力發(fā)生變化，結(jié)果如圖4 所示，與對(duì)照相比，LPS 處理后細(xì)胞遷移的數(shù)量明顯減少，外泌體和細(xì)胞液處理有恢復(fù)炎癥模型中細(xì)胞遷移數(shù)量的趨勢(shì)。研究表明，LPS 處理顯著降低了遷移細(xì)胞數(shù)量，枇杷葉外泌體干預(yù)與LPS 炎癥處理（陽性對(duì)照）呈差異顯著，恢復(fù)遷移細(xì)胞數(shù)量至與對(duì)照（0 μg/mL，陰性對(duì)照）無顯著差異；枇杷懸浮細(xì)胞外泌體和枇杷懸浮細(xì)胞液處理均與LPS 炎癥處理呈顯著性差異，能夠恢復(fù)遷移細(xì)胞數(shù)量但顯著低于陰性對(duì)照，且枇杷懸浮細(xì)胞外泌體和枇杷懸浮細(xì)胞液組間無顯著性差異（表2）。

2.6 黑色素含量檢測(cè)

分別采用5 μg/mL 枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細(xì)胞外泌體和枇杷懸浮細(xì)胞液處理A375 細(xì)胞細(xì)胞72 h 后，各處理細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)均良好（圖5）。

通過測(cè)定細(xì)胞黑色素含量和酪氨酸酶（黑色素合成限速酶）活性，由表3 可知，枇杷葉外泌體對(duì)黑色素含量無顯著影響。枇杷懸浮細(xì)胞外泌體和枇杷懸浮細(xì)胞液均可顯著降低體外A375 細(xì)胞黑色素含量，且組間存在差異顯著，枇杷懸浮細(xì)胞外泌體的效果優(yōu)于枇杷懸浮細(xì)胞液。而枇杷葉外泌體和枇杷懸浮細(xì)胞外泌體對(duì)酪氨酸酶活性無顯著影響，枇杷懸浮細(xì)胞液可顯著降低酪氨酸酶活性，枇杷懸浮細(xì)胞外泌體有降低酪氨酸酶活性的趨勢(shì)但未達(dá)到顯著水平。

3 討論

3.1 枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細(xì)胞外泌體、枇杷懸浮細(xì)胞液在體外水平的護(hù)膚功效

已有研究表明，外泌體在化妝品領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景，如，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可以促進(jìn)傷口愈合還可以顯著促進(jìn)燙傷后皮膚的恢復(fù)及再生[27]；毛囊乳頭細(xì)胞球來源的外泌體可促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)[28]。本研究中枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細(xì)胞外泌體、枇杷懸浮細(xì)胞液也表現(xiàn)出在護(hù)膚領(lǐng)域有益的方面：均為水溶性；枇杷葉外泌體在人皮膚成纖維細(xì)胞LPS 炎癥模型中抑制細(xì)胞凋亡以及恢復(fù)細(xì)胞遷移方面較為突出，適合研發(fā)抗炎和促修復(fù)功能護(hù)膚品；枇杷懸浮細(xì)胞液在顯著提高細(xì)胞存活率、抑制酪氨酸酶活性方面較為突出，適合研發(fā)美白功能護(hù)膚品；枇杷懸浮細(xì)胞外泌體在所有處理中均與對(duì)照有顯著差異，適合研發(fā)復(fù)合以上功能的護(hù)膚產(chǎn)品。

另外，本研究中枇杷葉外泌體并未減少黑色素含量、抑制酪氨酸酶活性，而枇杷懸浮細(xì)胞液和枇杷懸浮細(xì)胞外泌體卻具有這方面的功能。已有研究表明，枇杷葉酸性成分能夠抑制酪氨酸酶活性且呈現(xiàn)劑量依賴性[29]；枇杷葉中熊果酸能清除自由基、抑制酪氨酸酶活性具有美白功能[30]。

表明枇杷葉的美白歸因于熊果酸等成分。已有研究表明枇杷懸浮細(xì)胞中熊果酸等五環(huán)三萜類化合物是原植株的幾倍到十幾倍[23-24]，并且轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表明熊果酸等三萜類的代謝增強(qiáng)[31]。而生姜外泌體優(yōu)異的抗炎作用很大程度歸因于外泌體內(nèi)含物中含有大量6-姜酚等生物活性成分[23]。推測(cè)其原因可能是：①枇杷葉外泌體處理達(dá)到顯著性差異的濃度應(yīng)大于5 μg/mL；②原植株枇杷葉中熊果酸等物質(zhì)含量少，所以其外泌體內(nèi)不含熊果酸等物質(zhì)；③而經(jīng)過懸浮培養(yǎng)之后，枇杷細(xì)胞代謝途徑發(fā)生變化，胞內(nèi)富含熊果酸等三萜類物質(zhì)，推測(cè)枇杷懸浮細(xì)胞外泌體和枇杷懸浮細(xì)胞液可能含熊果酸等物質(zhì)而具有美白功能。今后可以開展枇杷葉及懸浮細(xì)胞來源外泌體組成研究。

3.2 枇杷懸浮細(xì)胞外泌體的特性

外泌體作為活性成分成為研究熱點(diǎn)有以下原因：它不僅能激活細(xì)胞表面受體，還能將活性物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)部，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)；最重要的是它含有miRNA 等核酸成分，microRNA 被磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)包裹免受降解，能在核酸層面調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[21， 32-33]。而且動(dòng)物或微生物來源、藥食同源植物來源的外泌體在跨界調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的安全性上具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[34-35]。本研究中枇杷葉外泌體和枇杷懸浮細(xì)胞外泌體的平均粒徑約為80 nm，有利于皮膚吸收用，均顯著提高HSF 的細(xì)胞存活率，更重要的是其外泌體中包含豐富的microRNA（數(shù)據(jù)未發(fā)表），可能會(huì)對(duì)皮膚進(jìn)行基因?qū)用娴恼{(diào)控，這一點(diǎn)也是今后的研究方向。另外，本研究首次采用枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)獲得外泌體，區(qū)別于以往研究中多采用新鮮植物分離外泌體的方法。本研究表明，從外泌體濃度以及外泌體中蛋白含量角度，每克枇杷葉中的顆粒含量是每毫升（約1 g）枇杷懸浮細(xì)胞上清含量的約10 倍。但源自枇杷懸浮細(xì)胞的外泌體仍具有其特有的優(yōu)勢(shì)，即枇杷懸浮細(xì)胞外泌體可以周年生產(chǎn)；可以通過生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)[23， 36]；且由原廢棄的培養(yǎng)液中提取（枇杷懸浮培養(yǎng)后細(xì)胞內(nèi)富含五環(huán)三萜類次生物質(zhì)，原方法只收獲細(xì)胞），增加了枇杷懸浮細(xì)胞的使用場(chǎng)景和使用率。

3.3 枇杷懸浮細(xì)胞液的特性

采用枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)熊果酸等三萜類次生物質(zhì)，是不同于現(xiàn)有從枇杷葉提取的另一有效途徑。已有研究及項(xiàng)目組前期工作表明，通過枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)能夠產(chǎn)生幾倍至十幾倍高于枇杷原植株的五環(huán)三萜類化合物[23-24]，并且通過此途徑產(chǎn)生的五環(huán)三萜類化合物已證實(shí)具有消炎[37]、抑制高血糖高血脂[38]、體外抗肝癌細(xì)胞[24]等功能。如，其主要成分委陵菜酸含量約是枇杷葉片中含量的18.40 倍，且為培養(yǎng)細(xì)胞干重的6%以上[24]。從相對(duì)含量和絕對(duì)含量角度，值得今后以枇杷細(xì)胞懸浮系為研究體系進(jìn)行理論研究和應(yīng)用研究。但熊果酸屬非水溶性，生物利用率低，限制了其應(yīng)用[39]?？赡苓@也是市面上鮮見相關(guān)產(chǎn)品的原因?；诒狙芯浚凌藨腋〖?xì)胞液和枇杷懸浮細(xì)胞外泌體無菌、水溶性、不含色素、具有良好的益膚功能，適合進(jìn)一步用于研發(fā)護(hù)膚品，今后還可以通過枇杷懸浮培養(yǎng)，分離制備外泌體和熊果酸等，以其外泌體為載體裝載其熊果酸等成分或microRNA，以進(jìn)一步增強(qiáng)其功效。

3.4 枇杷作為藥食同源植物的高值應(yīng)用

植物藥是中藥的主要組成部分，由于中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，許多中藥的有效成分及作用機(jī)制仍未得到有效闡釋[40]。枇杷作為藥食同源植物，在以往中醫(yī)藥利用中多為組方[1-3]，組方成分或協(xié)同或拮抗，功效模糊，很大程度制約了枇杷的利用。本研究將枇杷外泌體或細(xì)胞液以蛋白含量進(jìn)行科學(xué)量化，功效明確，成份簡(jiǎn)單，低劑量，不僅可以用作組方還可以單方使用，為枇杷作為中藥藥方在更廣泛領(lǐng)域的利用提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究分離了枇杷葉外泌體、枇杷懸浮細(xì)胞來源的外泌體和細(xì)胞液。枇杷外泌體和細(xì)胞液能夠促進(jìn)體外HSF 細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞遷移，適合研發(fā)抗炎和促修復(fù)功能護(hù)膚品；懸浮細(xì)胞來源的枇杷外泌體和細(xì)胞液可以降低體外A375 細(xì)胞黑色素含量，細(xì)胞液同時(shí)還抑制酪氨酸酶活性，適合研發(fā)美白功能護(hù)膚品。研究結(jié)果對(duì)今后這3 種材料在護(hù)膚品上的應(yīng)用具有參考意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 朱兆云， 趙毅. 滇南本草（第3 卷）[M]. 昆明： 云南科學(xué)技術(shù)出版社， 2010.

[2] 王建湘， 朱明芳， 邊鮮麗. 金土沖劑內(nèi)服方用于治療尋常型痤瘡120 例臨床觀[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2006， 12（9）： 44-45.

[3] 熊潔勤. 枇杷清肺飲加減治療尋常性痤瘡的臨床研究[D].南京： 南京中醫(yī)藥大學(xué)， 2006.

[4] 倪躍新， 梁儷恩， 孫勝南， 黃艷， 周仲良. 枇杷葉中致香成分的提取分離及其在卷煙加香中的應(yīng)用[J]. 香料香精化妝品， 2012， 2： 17-19.

[5] 宋艷麗， 于慧斌， 姬志強(qiáng)， 康文藝. 枇杷花揮發(fā)性成分分析[J]. 河南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2009， 28（2）： 104-106.

[6] 林朝展， 柴玲， 祝晨蔯， 趙鐘祥， 張翠仙. 枇杷葉紫珠葉揮發(fā)油化學(xué)成分的研究[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥， 2010， 21（9）：2275-2277.

[7] PAN B T， JOHNSTONE R M. Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro： selective externalization of the receptor[J]. Cell， 1983， 33（3）：967-978.

[8] THERY C， ZITUOGEL L， AMIGORENA S. Exosomes：composition， biogenesis and function[J]. Nature Reviews Immunology， 2002， 2： 569-579.

[9] RAPOSO G， STOORVOGE W. Extracellular vesicles： exosomes， microvesicles， and friends[J]. Journal of Cell Biology，2013， 200（4）： 373-383.

[10] PREKER P， NIELSEN J， KAMMLER S， LYKKEANDERSENS， CHRISTENSEN M S， MAPENDANO C K，SCHIERUP M H， JENSEN T H. RNA exosomedepletion reveals transcription upstream of active human promoters[J]. Science， 2008， 322： 1851-1854.

[11] HUGHES P W. Exosome-deficient mutants reveal rare promoter upstream transcripts （PROMPTs） in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2020， 32（6）： 1775-1776.

[12] KAHLERT C， KALLURI R. Exosomes in tumor microenvironment influence cancer progression and metastasis[J]. Journal of Molecular Medicine， 2013， 91（4）： 431-437.

[13] GOWDA R， ROBERTSON B M， IYER S， BARRY J，DINAVAHI S S， ROBERTSON G P. The role of exosomes in metastasis and progression of melanoma[J]. Cancer Treatment Reviews， 2020， 85： 101975.

[14] MAN F， WANG J， LU R. Techniques and applications of animal-and plant-derived exosome-based drug delivery system[J]. Journal of Biomedical Nanotechnology， 2020， 16（11）：1543-1569.

[15] SUHARTA S， BARLIAN A， HIDAJAH A C， NOTOBROTO H B， ANA I D， INDARIANI S， WUNGU T D K， WIJAYA C H. Plant-derived exosome-like nanoparticles： a concise review on its extraction methods， content， bioactivities， and potential as functional food ingredient[J]. Journal of Food Science， 2021， 86（7）： 2838-2850.

[16] ZHANG B， WU X， ZHANG X， SUN Y， YAN Y， SHI H，ZHU Y， WU L， PAN Z， ZHU W， QIAN H， XU W. Human umbilical cord mesenchymal stem cell exosomes enhance angiogenesis through the Wnt4//β-catenin pathway[J]. Stem Cells Translational Medicine， 2015， 4（5）： 513-522.

[17] PROFFER S L， PARADISE C R， DEGRAZIA E， HALAAS Y， DURAIRAJ K K， SOMENEK M， SIVLY A， BOON A J，BEHFAR A， WYLES S P. Effieacy and tolerability of topical platelet exosomes for skin rejuvenation： six-week results[J]. Aesthetic Surgery Journal， 2022， 42（10）： 1185-1193.

[18] ZHANG M， VIENNOIS E， PRASAD M ， ZHANG Y，WANG L， ZHANG Z， HAN M K， XIAO B， XU C，SRINIVASAN S， MERLIN D. Edible ginger-derived nanoparticles： a novel therapeutic approach for the prevention and treatment of inflammatory bowel disease and colitis-associated cancer[J]. Biomaterials， 2016， 101： 321-340.

[19] DU J， LIANG Z， XU J， ZHAO Y， LI X， ZHANG Y， ZHAO D， CHEN R， LIU Y， JOSHI T， CHANG J， WANG Z，ZHANG Y， ZHU J， LIU Q， XU D， JIANG C. Plant-derived phosphocholine facilitates cellular up take of anti-pulmonary fibrotic HJT-sRNA-m7[J]. Science China-Life Sciences，2019， 62（3）： 309-320.

[20] AGRAWAL A K， AQIL F， JEYABALAN J， SPENCER W A， BECK J， GACHUKI B W， ALHAKEEM S S， OBEN K， MUNAGALA R， BONDADA S， GUPTA R C. Milk-derived exosomes for oral delivery of paclitaxel[J]. Nanomedicine，2017， 13（5）： 1627-1636.

[21] AQIL F， JEYABALAN J， AGRAWAL A K，KYAKULAGA A H， MUNAGALA R， PARKER L，GUPTA R C. Exosomal delivery of berry anthocyanidins for the management of ovarian cancer[J]. Food & Function， 2017， 8（11）： 4100-4107.

[22] SHAO J， ZARO J， SHEN Y. Advances in exosome-based drug delivery and tumor targeting： from tissue distribution to intracellular fate[J]. International Journal of Nanomedicine，2020， 15： 9355-9371.

[23] HO H Y， LIANG K Y， LIN W C， KITANAKA S， WU J B.Regulation and improvement of triterpene formation in plant cultured cells of Eriobotrya japonica Lindl[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2010， 110（5）： 588-592.

[24] LI H H， SU M H， YAO D H， ZENG B Y， CHANG Q， WANG W， XU J. Anti-hepatocellular carcinoma activity of tormentic acid derived from suspension cells of Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2017， 130（2）： 427-433.

[25] GEORGIEV M I， WEBE J， MACIUK A. Bioprocessing of plant cell cultures for mass production of targeted compounds[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2009，83： 809-823.

[26] 李惠華， 劉小英， 常強(qiáng)， 王偉， 姚德恒， 蘇明華. 枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)熊果酸的調(diào)控[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2015，36（7）： 1247-1253.

[27] LI Q， SHAO Y， ZHANG X， ZHENG T， MIAO M， QIN L，WANG B， YE G， XIAO B， GUO J. Plasma long noncoding RNA protected by exosomes as a potential stable biomarker for gastric cancer[J]. Tumor Biology， 2015， 36（3）： 2007-2012.

[28] HU S Q， LI Z H， LUTZ H， HUANG K， SU T， CORES J， DINH P C， CHENG K. Dermal exosomes containing miR-218-5p promote hair regeneration by regulating β-catenin signaling[J]. Science Advances， 2020， 6（30）： eaba1685.

[29] 張理平， 張海燕， 李孝棟， 王英豪. 28 味中藥酸性成分提取物影響黑素合成的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2009，24（11）： 1443-1445.

[30] 劉亞男， 許有瑞. 熊果酸美白功能性研究進(jìn)展[J]. 廣州化工， 2021， 49（19）： 31-34.

[31] 李惠華， 常強(qiáng)， 王偉， 曾碧玉， 徐劍， 蘇明華. 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的枇杷五環(huán)三萜合成途徑差異基因的分析[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2018， 26（2）： 222-233.

[32] 王磊， 曹蕾， 顧永， 范衛(wèi)新. 外泌體與皮膚科相關(guān)疾病的研究進(jìn)展[J]. 臨床皮膚科雜志， 2017， 46（5）： 375-377.

[33] POTESTA M， ROGLIA V， FANILLI M， PIETROBONO E， GISMONDI A， VUMBACA S， NGUEDIA TSANGUEU RG， CANINI A， COLIZZI V， GRELLII S， MINUTOLO A，MONTESANO C. Effect of microvesicles from Moringa oleifera containing miRNA on proliferation and apoptosis in tumor cell lines[J]. Cell Death Discovery， 2020， 6： 43.

[34] DAD H A， GU T W， ZHU A Q， HUANG LQ， PENG L H.Plant exosome-like nanovesicles： emerging therapeutics and drug delivery nanoplatforms[J]. Molecular Therapy， 2021，29（1）： 13-31.

[35] XU X H， YUAN T J， DAD H A， SHI M Y， HUANG Y Y，JIANG Z H， PENG L H. Plant exosomes as novel nanoplatforms for microRNA transfer stimulate neural differentiation of stem cells in vitro and in vivo[J]. Nano Letters， 2021，21（19）： 8151-8159.

[36] 李惠華， 姚德恒， 徐劍， 王偉， 常強(qiáng)， 蘇明華. 波浪式WAVE 生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)枇杷細(xì)胞生產(chǎn)熊果酸的研究[J]. 中國雜志， 2015， 40（9）： 1693-1698.

[37] CHANG C T， HUANG S S， LIN S S， AMAGAYA S， HO HY， HOU W C， SHIE P H， WU J B， HUANG G J.Anti-inflammatory activities of tormentic acid from suspension cells of Eriobotrya japonicaex ex vivo and in vivo[J]. Food Chemistry， 2011，127 （3）： 1131-1137.

[38] SHIH C C， CIOU J L， LIN C H， WU J B， HO H Y. Cell suspension culture of Eriobotrya japonica regulates the diabetic and hyperlipidemic signs of high-fat-fed mice[J]. Molecules，2013， 18（3）： 2726-2753.

[39] 劉改枝， 李金鑫， 史禮君， 劉萌芽， 蔡邦榮. 熊果酸的結(jié)構(gòu)修飾與生物活性研究進(jìn)展[J]. 有機(jī)化學(xué)， 2021， 41（8）：2974-2989.

[40] XIE W， WENG A， MELZIG M F. Micrornas as new bioactive components in medicinal plants[J]. Planta Medica， 2016， 82（13）： 1153-1162.