姚凱 馬寅正 易國輝 王元曉 周霞 臧旭 劉禹棋 汪桐 何小穩(wěn)

摘 要：番木瓜（Carica papaya Linn.）屬十字花目番木瓜科，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，番木瓜籽揮發(fā)油的主成分為異硫氰酸芐酯（BITC），含量高達(dá)99%，具有天然、無污染、純度高等特點(diǎn)，且對(duì)多種假絲酵母菌均具有明顯的抑制作用。但由于BITC 水溶性差、易揮發(fā)、易降解等缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用。本研究采用熔融乳化超聲法制備異硫氰酸芐酯納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（BITC-NLC），并進(jìn)行形態(tài)、粒徑及Zeta 電位、包封率、載藥量等方面的表征及其抗假絲酵母菌活性研究，旨在提高BITC 的穩(wěn)定性和抑菌效果。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（NLC）的制備工藝和BITC-NLC 的處方組成，得到最佳制備工藝：初乳攪拌20 min，超聲分散15 min（振幅80%）；最佳處方組成：單硬脂酸甘油酯50 mg，辛癸酸三甘油酯50 mg，聚醚F188 400 mg，大豆卵磷脂400 mg，BITC 100 mg，蒸餾水20 mL。采用透射電子顯微鏡觀察形態(tài)，納米粒度及Zeta 電位測定儀測定粒徑及Zeta電位，高效液相色譜法測定包封率和載藥量。最終制備得到的BITC-NLC 呈類球形，平均粒徑為79.13 nm，Zeta 電位為–21.77 mV，包封率為91.52%。初步穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，BITC-NLC 在25 ℃下貯存30 d 的穩(wěn)定性良好。采用微量稀釋法測得制劑對(duì)供試白假絲酵母菌（Candida albicans）和熱帶假絲酵母菌（C. tropicalis）的最低抑菌濃度（MIC）為8～32 μg/mL，比原料藥BITC 的抑菌效果好，且對(duì)耐藥菌株也具有抑菌效果。綜上，本研究制備的番木瓜籽揮發(fā)油新劑型BITC-NLC 粒徑小，穩(wěn)定性好，包封率高，對(duì)假絲酵母菌抑制作用強(qiáng)，為大量存在且多被丟棄的番木瓜籽的合理開發(fā)和綜合應(yīng)用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：番木瓜籽；揮發(fā)油；異硫氰酸芐酯；納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體；假絲酵母菌

中圖分類號(hào)：R284；S59 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

番木瓜（Carica papaya L.）屬十字花目番木瓜科，廣泛栽培于熱帶、亞熱帶地區(qū)，在中國主要分布在海南、廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等地，海南島產(chǎn)量豐富，其果實(shí)藥食兩用，具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化等多種生物活性[1-2]。番木瓜籽是果實(shí)加工的副產(chǎn)物，研究番木瓜籽成分及活性對(duì)其合理開發(fā)利用具有重要意義[1-6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，番木瓜籽揮發(fā)油的主成分為異硫氰酸芐酯（benzyl isothiocyanate， BITC），含量高達(dá)99%，具有天然、無污染、純度高等特點(diǎn)，且對(duì)多種假絲酵母菌（包括耐藥菌）均具有明顯的抑制作用[7-8]。

近年來，以假絲酵母菌為代表的侵襲性真菌感染呈逐年上升趨勢，尤其是對(duì)免疫功能低下的患者，其發(fā)病率和死亡率高，而假絲酵母菌對(duì)常用抗真菌藥物的耐藥性日益提升，成為臨床治療失敗的重要原因[9-10]。白假絲酵母菌（Candida albicans，Ca）是引起假絲酵母菌感染的主要種群，但在熱帶及亞熱帶地區(qū)，熱帶假絲酵母菌（C. tropicalis，Ct）已成為僅次于白假絲酵母菌的第二大假絲酵母菌[11]，因此加快新型抗真菌藥物的研制和開發(fā)具有重要意義[12-14]。但由于BITC 難溶于水、易揮發(fā)、不穩(wěn)定，限制了其在醫(yī)藥、食品等各領(lǐng)域的應(yīng)用。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipidcarriers， NLC）作為一種新型的納米制劑，是以固液態(tài)混合脂質(zhì)材料為載體，可保護(hù)揮發(fā)油免受外界環(huán)境的影響， 形成的納米制劑粒徑直徑在10～1000 nm 范圍的藥物傳送系統(tǒng)，可增加其穩(wěn)定性、避免降解或泄露，具有良好的緩控釋作用及靶向性，且可提高其抗菌活性[15-18]。

本研究擬采用熔融乳化超聲分散法制備番木瓜籽提取物異硫氰酸芐酯-納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（BITC-NLC），先通過單因素試驗(yàn)考察確定影響制劑制備工藝和處方組成的主要因素，再采用正交試驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化，從而制備得到BITC-NLC，以解決BITC 在貯藏過程中對(duì)光、熱、氧的不穩(wěn)定性以及易揮發(fā)、低水溶性等缺點(diǎn)，從形態(tài)、粒徑及分布、Zeta 電位、包封率、載藥量等方面對(duì)制劑進(jìn)行初步表征和評(píng)價(jià)， 并研究比較BITC-NLC 與BITC 對(duì)假絲酵母菌Ca 和Ct 抗菌活性的差異，探討B(tài)ITC-NLC 的應(yīng)用前景，制備得到的天然抗真菌新劑型，為番木瓜籽的合理開發(fā)和綜合應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

番木瓜籽揮發(fā)油：原材料采自海南，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)楊衛(wèi)麗教授鑒定，經(jīng)本課題組提取得到淺黃色揮發(fā)油，經(jīng)GC-MS 檢測BITC 含量為99.4%，4 ℃下密封保存。

試劑：單硬脂酸甘油酯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；辛癸酸甘油酯（上海麥克林生化科技有限公司，含量≥98.0%）；大豆卵磷脂（上海羅恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；異硫氰酸芐酯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量＞98.0%）；聚醚F188（上海羅恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；司班80（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；吐溫80（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）；乙腈（色譜純，默克）；10 kDa 超濾離心管（密理博中國有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，賽默飛世爾中國有限公司）；氟康唑（上海源葉生物科技有限公司，編號(hào)：YY10480-1g，含量≥99%）；RPMI 1640（Gibco）、SDA 培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。實(shí)驗(yàn)所用水均為超純水。

供試菌株：質(zhì)控菌株Ca ATCC 10231（廣州環(huán)凱微生物科技有限公司），臨床分離菌株有Ca53、Ca 27、Ct 68、Ct 112、Ct 56，經(jīng)ITS 基因序列測定確定。

儀器與設(shè)備：Zetasizer Nano ZSE 納米粒度及電位儀（英國馬爾文儀器有限公司）；HT-7800透射電子顯微鏡（日本日立）；安捷倫1260 液相色譜儀（美國安捷倫儀器有限公司）；JY92-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RODI-160B1 超純水儀（廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限公司）；Centrifuge5430 臺(tái)式離心機(jī)（德國艾本德）；Synergy HTX多功能酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 BITC-NLC 的制備 采用熔融乳化超聲法制備BITC-NLC。分別稱取50.0 mg 辛癸酸甘油酯，50.0 mg 單硬脂酸甘油酯和100.0 mg BITC，70 ℃加熱溶解作為油相，分別稱取400.0 mg 大豆卵磷脂和400.0 mg 聚醚F188，用20 mL 水于70 ℃溶解作為水相，在恒溫磁力攪拌（800 r/min）下將水相緩慢滴入油相中，并持續(xù)攪拌20 min 形成初乳。將初乳用探頭超聲（超聲振幅80%，開5 s，停5 s）15 min 后，冰水浴冷卻固化2 min，過0.22 μm 微孔濾膜即得BITC-NLC。

1.2.2 BITC 含量測定 建立高效液相色譜法（high performanceliquid chromatography， HPLC）測定BITC-NLC 中的BITC 含量。

（1）溶液配制。精密量取BITC-NLC 50 μL于10 mL 容量瓶中加7 mL 乙腈，渦旋30 s 破乳，再加水定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得樣品溶液。精密稱取BITC 約10 mg 置于100 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成BITC 濃度為100 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

（ 2 ）HPLC 條件。色譜柱Aglient C18 柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），柱溫30 ℃；流動(dòng)相乙腈∶水（70∶30， V/V）；流速1.0 mL/min；檢測波長245 nm；進(jìn)樣量10 μL。

（3）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。取制備的空白制劑NLC 和BITC-NLC，按1.2.2-（1）方法制備樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2-（2）方法進(jìn)樣檢測并記錄色譜圖。

（4）線性關(guān)系考察。分別精密量取1.2.2-（1）中制備的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 mL 于5 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻作為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2.2-（2）方法進(jìn)樣檢測，以BITC 峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。

（5）計(jì)算最低定量限和檢測限。取線性溶液最低點(diǎn)對(duì)照品溶液稀釋，按1.2.2-（2）方法進(jìn)樣檢測，分別按照信噪比S/N=10 及S/N=3，計(jì)算BITC 的最低定量限和檢測限。

（ 6 ） 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)。取制備的BITC-NLC，按1.2.2-（1）方法處理6 份樣品溶液，分別按1.2.2-（2）方法進(jìn)樣檢測，計(jì)算BITC含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（ RSD ）。取制備的BITC-NLC，按1.2.2-（1）方法處理樣品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣檢測，計(jì)算BITC含量的RSD 值。

（7）加樣回收率試驗(yàn)。制備含量相當(dāng)于處方含量的80%、100%、120%的BITC 對(duì)照品溶液，將其加入已知BITC 含量的NLC 樣品溶液中，每個(gè)濃度3 份，進(jìn)樣檢測，計(jì)算得加樣回收率及RSD 值。

1.2.3 NLC 制備工藝的優(yōu)化 采用熔融超聲乳化法制備NLC，預(yù)設(shè)定處方后先摸索制備溫度、初乳形成的滴加速度等條件，并采用單因素試驗(yàn)考察確定影響制備工藝的因素，最終采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化NLC 最佳制備工藝。

1.2.4 BITC-NLC 處方篩選 首先選擇BITCNLC處方中脂質(zhì)及表面活性劑，并采用單因素試驗(yàn)考察確定影響制備處方的因素，最終采用正交試驗(yàn)優(yōu)化BITC-NLC 的最佳處方組成。

1.2.5 BITC-NLC 的形態(tài)觀察 將制備的BITCNLC用超純水稀釋后滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，靜置20 min，用濾紙吸干混懸液，用2%磷鎢酸溶液（pH 6.5）負(fù)染1 min，風(fēng)干后置于透射電子顯微鏡下觀察BITC-NLC 的形態(tài)并拍照。

1.2.6 BITC-NLC 的粒徑分布及Zeta 電位測定將制備的BITC-NLC 用超純水稀釋后，采用納米粒度及電位分析儀檢測其粒徑分布及Zeta 電位，平行測定3 次，取平均值。

1.2.7 BITC-NLC 包封率和載藥量測定 精密量取50 μL 制備的BITC-NLC 于10 mL 容量瓶中，加7 mL 乙腈，渦旋30 s 破乳，再加水定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后，按1.2.2-（2）方法進(jìn)樣檢測，并計(jì)算藥物濃度及相應(yīng)體積的質(zhì)量，平行測定3 次；精密吸取1 mL 制備的BITCNLC于超濾離心管中，8000 r/min 離心20 min 后，在外管中精密量取50 μL 游離藥物溶液于10 mL容量瓶，加7 mL 乙腈再加水定容，按1.2.2-（2）方法進(jìn)樣檢測，并計(jì)算游離藥物濃度及相應(yīng)體積的質(zhì)量，平行測定3 次，按以下公式計(jì)算包封率（encapsulation efficiency， EE）和載藥量（drugloading， DL）：EE=系統(tǒng)中包封的藥量/總藥量×100%DL=系統(tǒng)中包封的藥量/總重量×100%1.2.8 BITC-NLC 穩(wěn)定性考察 將BITC-NLC 置于室溫（25 ℃）下貯存30 d，在不同時(shí)間（0、5、10、15、20、25、30 d）觀察其外觀，測定粒徑、Zeta 電位及包封率，評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。

1.2.9 BITC-NLC 抗假絲酵母菌活性研究 采用微量稀釋法（M38-A2）[19]測定BITC-NLC 和BITC對(duì)Ca 和Ct 的最低抑菌濃度（minimum inhibitoryconcentration， MIC）和最低殺菌濃度（minimumfungicidal concentration， MFC）。將Ca 和Ct 接種、活化，取無菌96 孔平底微量培養(yǎng)板，配制不同濃度的BITC-NLC 和BITC 溶液并加菌懸液后，培養(yǎng)板置于35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。每次同時(shí)制備1 個(gè)質(zhì)控菌藥敏板（以Ca ATCC 10231為質(zhì)控菌），若質(zhì)控菌藥敏板中氟康唑（fluconazole，F(xiàn)LZ） 的MIC 值位于規(guī)定的范圍， 即0.25～1.0 μg/mL，則認(rèn)為此次試驗(yàn)操作有效。判讀MIC值方法：與培養(yǎng)48 h 的無藥對(duì)照孔比較抑制率達(dá)到50%的最低藥物濃度。設(shè)置3 次重復(fù)，MIC 值取平均值。MFC 的測定以培養(yǎng)72 h 后，于清晰透明的微量試驗(yàn)孔和無藥對(duì)照孔中各吸取20 μL 菌懸液，傾注在SDA 平板上，培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，小于3 CFU 的最低藥物濃度即MFC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 制劑含量分析方法的建立

2.1.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 由BITC 標(biāo)準(zhǔn)溶液、BITC-NLC 和空白制劑NLC 的HPLC 色譜圖（圖1）可知，在設(shè)定的色譜條件下，BITC 出峰時(shí)間為7.2 min，與其他成分的分離良好，空白樣品無干擾。

2.1.2 線性試驗(yàn) 以BITC 峰面積（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C， μg/mL） 為橫坐標(biāo)， 得回歸方程：A=5.076×C+0.052（r=0.9997）。結(jié)果表明，BITC在2.0～64.0 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 最低定量限和檢測限 按S/N=10 計(jì)，BITC 的最低定量限為0.2 μg/mL；按S/N=3 計(jì)，BITC 的最低檢測限為0.08 μg/mL。

2.1.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn) 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，BITC 含量的RSD 值為1.29%，表明該方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，BITC 含量的RSD 值為1.80%，表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 相當(dāng)于處方含量80%、100%、120%的高、中、低3 種濃度的平均加樣回收率分別為98.83%、100.34%、100.47%，RSD值分別為1.15%、1.63%、1.73%。

2.2 NLC 制備工藝的影響因素考察采用熔融超聲乳化法制備NLC，預(yù)設(shè)定處方為辛癸酸甘油酯100 mg ， 單硬脂酸甘油酯100 mg，大豆卵磷脂200 mg，聚醚F188 400 mg，20 mL 水進(jìn)行制備工藝考察。

2.2.1 制備溫度的選擇 制備溫度應(yīng)在脂質(zhì)熔點(diǎn)以上，以保證藥物和脂質(zhì)在制備過程中保持熔融狀態(tài)，但溫度過高藥物易損失，經(jīng)試驗(yàn)觀察，確定溫度為70 ℃。

2.2.2 初乳形成的滴加速度 在初乳形成過程中，滴加速度過快，脂質(zhì)相和水相不能充分混合，難以得到均勻的分散液，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定20 mL 水相滴加時(shí)間為5 min。

2.2.3 制備工藝的正交試驗(yàn) 采用預(yù)設(shè)處方，制備溫度在70 ℃，初乳滴加時(shí)間5 min，選擇超聲時(shí)間、超聲振幅、攪拌速率、攪拌時(shí)間4 個(gè)因素進(jìn)行單因素考察制備工藝，結(jié)果顯示，攪拌速率對(duì)NLC 的粒徑及穩(wěn)定性影響最小，因攪拌速度快時(shí)錐形瓶易傾倒，綜合考慮粒徑大小及操作等因素，攪拌速度定為800 r/min，選擇影響制備工藝的其他因素進(jìn)行L933 的正交試驗(yàn)，其中A 攪拌時(shí)間（10、20、30 min）、B 超聲振幅（60%、80%、100%）、C 超聲時(shí)間（5、10、15 min），以平均粒徑為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正交試驗(yàn)分析結(jié)果見表1。由表1 的方差結(jié)果可以看出，因素C（超聲時(shí)間）對(duì)制劑的粒徑影響最顯著，其次是因素B（超聲振幅）、因素A（攪拌時(shí)間），最優(yōu)組合為A3B2C3，因攪拌時(shí)間對(duì)制劑的粒徑影響無顯著差異，且攪拌20 min 和30 min 時(shí)平均粒徑基本相同，考慮到節(jié)省制備時(shí)間，最終選擇攪拌時(shí)間為20 min。因此最佳制備工藝為：初乳攪拌速率800 r/min，攪拌時(shí)間20 min，超聲破碎振幅80%，超聲時(shí)間15 min。按照最佳制備工藝平行制備3 批NLC，檢測其平均粒徑及分布，平均粒徑為（75.48±0.68）nm，PDI 為0.248±0.012。

2.3 BITC-NLC 處方篩選

2.3.1 脂質(zhì)的選擇 固態(tài)脂質(zhì)是納米制劑的重要組成，不僅能使納米粒保持穩(wěn)定，還可為其提供形態(tài)支撐，使其具有更好的緩釋效果，而合適的液態(tài)脂質(zhì)不僅能夠提高制劑的載藥量和包封率，還能使其更加穩(wěn)定。通過查閱文獻(xiàn)[17-18]，最終選擇單硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯的固液混合脂質(zhì)。

2.3.2 表面活性劑的選擇 一般用親水親油平衡值（hydrophilelipophile balance， HLB）衡量表面活性劑分子的親水和親油程度。通常，HLB 值在3～6 范圍內(nèi)適于W/O 型乳液，在8～18 范圍內(nèi)適于O/W 型乳液，研究發(fā)現(xiàn)將高HLB 值的表面活性劑和低HLB 值的表面活性劑復(fù)合使用制備得到的NLC 效果最好。因此，本研究選用復(fù)合乳化劑（按m/m 1∶1 混合）大豆卵磷脂（HLB=10）與吐溫80（HLB=15）、大豆卵磷脂（HLB=10）與聚醚F188（HLB=16）、司班80（HLB=4.3）與吐溫80（HLB=15）、司班80（HLB=4.3）與聚醚F188（HLB=16）相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選用大豆卵磷脂（HLB=10）與聚醚F188（HLB=16）作為混合乳化劑所制得的制劑為澄清透明溶液，其他為半透明或乳白色混懸液，因此選擇大豆卵磷脂與聚醚F188 作為混合乳化劑。

2.3.3 處方組成的正交試驗(yàn) 按照2.2.3 優(yōu)化得到的最佳制備工藝，選擇脂質(zhì)總量、固液脂質(zhì)（單硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯）比例、復(fù)合乳化劑總量、復(fù)合乳化劑（大豆卵磷脂與聚醚F188）的比例、揮發(fā)油用量共5 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果顯示，固液脂質(zhì)比例對(duì)制劑的平均粒徑、Zeta電位、包封率等影響均較小，因此以固液比例1∶1（m/m），選擇其他4 個(gè)影響處方工藝的因素進(jìn)行L934 的正交試驗(yàn)，以平均粒徑、Zeta 電位、包封率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表2 為正交因素水平，表3 為正交試驗(yàn)及試驗(yàn)結(jié)果，表4 為正交試驗(yàn)分析結(jié)果。

由表4 的方差結(jié)果可以看出，4 個(gè)因素對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)中平均粒徑的影響均為極顯著，影響程度順序?yàn)锳>C>D>B，因素C、D、A 對(duì)Zeta電位的影響均為極顯著，因素B 對(duì)Zeta 電位則無顯著差異，其影響程度順序?yàn)镃>D>A>B，因素A、B、D 對(duì)包封率的影響均為極顯著，因素C 對(duì)其影響顯著，影響程度順序?yàn)锳>B>D>C。因素A（脂質(zhì)總量）對(duì)平均粒徑和包封率的影響均最大，且均為極顯著差異，對(duì)平均粒徑的影響雖為極顯著但相比其他2 個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響較小，脂質(zhì)總量越小，平均粒徑越小，但包封率越小，而脂質(zhì)總量增大對(duì)Zeta 電位的影響是先增大后減小，綜合考慮粒徑和包封率，脂質(zhì)總量選擇A2；其次因素B（復(fù)合乳化劑總量）對(duì)平均粒徑和包封率影響均較大，且復(fù)合乳化劑總量越大，粒徑越小，包封率越大，因此選擇B3；因素C（大豆卵磷脂與聚醚F188 的比例）對(duì)平均粒徑和Zeta 電位影響大且為極顯著差異，對(duì)包封率影響顯著，綜合考慮選擇C1；因素D（揮發(fā)油用量）對(duì)3 個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響均較大，因此綜合考慮選擇D2。最終的處方為：固液混合脂質(zhì)單硬脂酸甘油酯50.0 mg 和辛癸酸甘油酯50.0 mg，大豆卵磷脂400.0 mg，聚醚F188 400.0 mg，揮發(fā)油100.0 mg，水20.0 mL。

2.4 BITC-NLC 的形態(tài)表征

在透射電子顯微鏡下觀察BITC-NLC 的形態(tài)（圖2），由圖2 可知納米粒呈類球形，分布均勻，無明顯顆粒聚集現(xiàn)象。

2.5 BITC-NLC 的粒徑分布及Zeta 電位

按照最佳處方和工藝平行制備3 批BITC-NLC，檢測其粒徑分布（圖3）及Zeta 電位（圖4），BITC-NLC 粒度呈正態(tài)分布，納米粒徑為（79.13±1.41）nm，PDI 為0.248±0.011，粒度大小均勻一致，Zeta 電位為（–21.77±1.16）mV，說明該方法制備得到的BITC-NLC 粒度分布均勻，重現(xiàn)性好，體系較穩(wěn)定。

2.6 BITC-NLC 的包封率和載藥量

采用HPLC 測定3 批BITC-NLC 的包封率為91.52%±0.60%，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)（不低于80%）[20]，載藥量為9.15%±0.06%。

2.7 BITC-NLC 穩(wěn)定性

將BITC-NLC 置于室溫（25 ℃）下貯存30 d，在不同時(shí)間觀察其外觀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BITC-NLC 的外觀在30 d 時(shí)未發(fā)生明顯變化，粒徑、Zeta 電位及包封率結(jié)果見表5。BITC-NLC 的平均粒徑稍有增大，包封率雖有下降但在藥典要求范圍內(nèi)，說明該方法制備的制劑短期穩(wěn)定性尚可。

2.8 BITC-NLC 抗假絲酵母菌活性

采用微量稀釋法測定BITC-NLC 和BITC 對(duì)6 株Ca 和Ct 的MIC 和MFC，結(jié)果見表6。其中BITC-NLC 對(duì)供試菌株的MIC 范圍為8.0～32.0 μg/mL，BITC 對(duì)供試菌株的MIC 范圍為32.0～64.0 μg/mL，BITC-NLC 對(duì)供試菌株的MIC和MFC 均低于BITC，這說明制備的新制劑BITC-NLC 能增強(qiáng)BITC 的抗假絲酵母菌的效果，且其對(duì)耐藥菌株Ca 27 和Ct 56 也具有抑制作用，效果優(yōu)于對(duì)照藥物氟康唑（FLZ）。

3 討論

近年來，以假絲酵母菌為代表的侵襲性真菌感染呈逐年上升趨勢，尤其是對(duì)某些嚴(yán)重的免疫缺陷患者如艾滋病、中性白細(xì)胞減少等，以及惡性腫瘤患者、器官移植受者等，其發(fā)病率和死亡率高，給臨床治療帶來很大困難。白假絲酵母菌（Ca）是引起假絲酵母菌感染的主要種群，但在熱帶及亞熱帶地區(qū)，熱帶假絲酵母菌（Ct）已成為僅次于Ca 的第二大假絲酵母菌。目前，由于以氟康唑?yàn)榇淼倪蝾惪拐婢幬镌谂R床上的廣泛使用，使真菌耐藥性大大增加，例如WU 等[11]研究了海南的211 例頭頸癌患者中假絲酵母菌的感染情況，其中Ct 的感染率僅次于Ca，為22.6%，其中氟康唑耐藥率高達(dá)14.3%。這種臨床真菌的耐藥性常常導(dǎo)致治療失敗，尤其是對(duì)免疫功能低下的患者容易導(dǎo)致深部真菌感染而成為患者死亡的主要原因之一[9-10]，因此，針對(duì)抗真菌藥物的耐藥性問題，目前的研究一方面要探討抗真菌藥物產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制，采用2 種或多種藥物聯(lián)合應(yīng)用來解決真菌耐藥性的問題，另一方面是加快新型抗真菌藥物的研制和開發(fā)[12-14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，番木瓜籽揮發(fā)油的主成分為異硫氰酸芐酯（BITC），含量高達(dá)99%，具有天然、無污染、純度高等特點(diǎn)，且對(duì)多種假絲酵母菌均具有明顯的抑制作用[7-8]。但由于BITC 水溶性差、易揮發(fā)、易降解等缺點(diǎn)，限制了其應(yīng)用。

針對(duì)BITC 的上述缺點(diǎn)，在以往研究中大多采用飽和水溶液法以環(huán)糊精為壁材對(duì)BITC 進(jìn)行包合，如LI 等[21]采用β-環(huán)糊精對(duì)BITC 進(jìn)行包合，以增加其溶解度，提高熱穩(wěn)定性，減緩釋放速率，從而達(dá)到延長其防腐抑菌的效果和目的，該課題組[22]采用相同方法以β-環(huán)糊精的衍生物羥丙基-β-環(huán)糊精為壁材對(duì)BITC 進(jìn)行包埋也達(dá)到了延長抑菌效果的作用。王家平[23]也采用羥丙基-β-環(huán)糊精將BITC 進(jìn)行包合得到包封率達(dá)到78%的包合物后，再以羥丙甲纖維素為主的凝膠骨架材料將包合物進(jìn)行壓片制成胃懸浮片，該研究的主要目的是掩蓋BITC 的刺激性氣味，延長其半衰期，減少給藥次數(shù)，提高癌癥患者的順應(yīng)性。LIU 等[24]采用飽和水溶液法將3 種異硫氰酸酯（包括BITC）與γ-環(huán)糊精形成的包合物，其中BITC 與γ-環(huán)糊精形成的包合物延長了BITC 對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌作用，經(jīng)包合物處理的金黃色葡萄球菌的毒力基因的表達(dá)顯著下調(diào)，并通過模型預(yù)測了該包合物在熟雞胸肉中抑制金黃色葡萄球菌的情況。該課題組[25]使用α-環(huán)糊精并加入殼聚糖對(duì)BITC 進(jìn)行包合，延長了抗菌能力，增強(qiáng)了抗氧化活性，該包合物可作為食品包裝材料特別是在牛肉保鮮方面具有開發(fā)應(yīng)用的潛力。

以上采用環(huán)糊精對(duì)BITC 包合的研究大多關(guān)注于BITC 在食品抑菌包裝材料方面的開發(fā)應(yīng)用，其存在制備時(shí)間長（攪拌時(shí)間為3～7 h），且使用有機(jī)溶劑乙醇，包封率低等問題。UPPAL 等[26]改進(jìn)以上方法，采用超聲波均質(zhì)機(jī)超聲900 s 制備β-環(huán)糊精及羥丙基-β-環(huán)糊精的BITC 包合物，大大縮短了制備時(shí)間，但仍需使用有機(jī)溶劑。田甜等[27]以大豆分離蛋白-磷脂酰膽堿作為表面活性劑，以BITC 與大豆油混合物作為油相，采用射流空化技術(shù)制備納米乳液，目的為擴(kuò)大BITC在食品行業(yè)抗菌中的應(yīng)用。該方法得到的納米乳的平均粒徑為252 nm，Zeta 電位為-27.2 mV，通過射流空化提高了乳液體系的凍融穩(wěn)定性，但該方法對(duì)設(shè)備要求較高。

本研究采用融熔乳化超聲法[15]制備得到納米制劑BITC-NLC，該方法具有操作步驟簡單、制備時(shí)間短、不使用有機(jī)溶劑、對(duì)試驗(yàn)設(shè)備要求不高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn)。研究先確定了制備溫度及初乳形成的滴加速度，選擇超聲時(shí)間、超聲振幅、攪拌速率、攪拌時(shí)間4 個(gè)因素進(jìn)行單因素影響試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝，最終選擇3 個(gè)主要因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到最佳制備工藝：制備溫度70 ℃，初乳攪拌速率800 r/min，攪拌時(shí)間20 min，超聲破碎振幅80%，超聲時(shí)間15 min。

采用同樣方法優(yōu)化BITC-NLC 的處方組成，首先對(duì)脂質(zhì)及表面活性劑進(jìn)行篩選，選擇脂質(zhì)總量、固液脂質(zhì)（單硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯）比例、復(fù)合乳化劑總量、復(fù)合乳化劑（大豆卵磷脂與聚醚F188）的比例、揮發(fā)油用量5 個(gè)因素進(jìn)行單因素影響試驗(yàn)后，選擇4 個(gè)主要因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，最終處方組成為：辛癸酸甘油酯50.0 mg，單硬脂酸甘油酯50.0 mg，異硫氰酸芐酯100.0 mg，大豆卵磷脂400.0 mg，聚醚F188 400.0 mg，蒸餾水20.0 mL。對(duì)該制劑從外觀、形態(tài)、粒徑、Zeta電位、包封率、載藥量等方面進(jìn)行表征和評(píng)價(jià)，該制劑形態(tài)呈類球形，分布均勻，粒徑小，平均粒徑為79.13 nm，Zeta 電位為–21.77 mV，體系穩(wěn)定，包封率高，為91.52%，30 d 短期穩(wěn)定性良好。

本研究在制備得到新的制劑BITC-NLC 后，采用微量稀釋法研究了BITC-NLC 和BITC 對(duì)假絲酵母菌中具代表性的Ca 和Ct 的抑制作用，結(jié)果表明BITC-NLC 的抗假絲酵母菌的活性強(qiáng)于BITC，這可能是因?yàn)樾轮苿〣ITC-NLC 將BITC保護(hù)起來增強(qiáng)了穩(wěn)定性，且具有緩控釋作用，因此增強(qiáng)了BITC 的抑菌效果。更重要的是BITC-NLC 對(duì)Ca 和Ct 的耐藥菌株也具有抑制作用，且效果優(yōu)于對(duì)照藥物氟康唑（FLZ）。這為日益嚴(yán)峻的假絲酵母菌對(duì)常用抗真菌藥物的耐藥問題提供了新的解決方案，也為番木瓜籽的合理開發(fā)和綜合應(yīng)用提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究在單因素影響試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化法采用熔融乳化超聲分散法制備得到番木瓜籽揮發(fā)油納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，具體制備流程和處方如下：辛癸酸甘油酯50.0 mg，單硬脂酸甘油酯50.0 mg，異硫氰酸芐酯100.0 mg，在70 ℃加熱溶解作為油相，大豆卵磷脂400.0 mg 和聚醚F188 400.0 mg 加水至20.0 mL 于同溫度下溶解作為水相，在800 r/min 攪拌下將水相緩慢滴入油相中，并持續(xù)攪拌20 min 形成初乳，用探頭超聲（超聲振幅80%）15 min 后冰水浴固化過濾即得。該制劑經(jīng)表征和評(píng)價(jià)后，粒徑小，穩(wěn)定性好，包封率高，對(duì)假絲酵母菌尤其是耐藥菌株的抑制作用強(qiáng)。本研究不僅得到了天然抗真菌的新劑型，更為產(chǎn)量高且多被丟棄的番木瓜籽的合理開發(fā)和利用提供了依據(jù)。

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