劉 倩，晉文慧 ，矯浩田，謝全靈，張怡評，洪 專，趙元暉

（1.自然資源部第三海洋研究所，海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心，福建廈門 361005；2.中國海洋大學三亞海洋研究院，海南三亞 572024；3.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學院，福建廈門 361000）

自然界植物藻類中半纖維素是第二大豐富的多聚糖，僅次于纖維素，含量約占20%～30%，其主要成分是木聚糖[1-2]。木聚糖可分為β-1,4-木聚糖和β-1,3-木聚糖[3]。β-1,4-木聚糖主要發(fā)現(xiàn)在陸生植物細胞壁的半纖維素中，而β-1,3-木聚糖主要存在于海藻的細胞壁多糖中[4-5]。一些紅藻和綠藻細胞壁中完全不含纖維素，取而代之的是β-1,3-木聚糖[6-8]。功能性海藻如紅藻和綠藻的細胞壁含有較多的β-1,3-木聚糖[9-10]，如紅藻中的紫菜屬（porphyra）[11]、紅皮藻屬紅皮藻屬（Rhodymenia）[12]，綠藻中的石莼屬（Ulva）[13]、蕨藻屬（Caulerpa）[14]、松藻屬（Codium）[15]。其中有兩種蕨藻較為常見，一種是目前已經(jīng)人工養(yǎng)殖的可食用長莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）[16]，另一種是高度入侵物種杉葉蕨藻（Caulerpa taxifolia）[17-18]。長莖葡萄蕨藻又名海葡萄，含有多糖、粗纖維、多種氨基酸與維生素，呈味氨基酸含量較高[19]，總脂肪含量較低，不含膽固醇，還富多種微量元素，與其他海藻相比，是潛在的高營養(yǎng)價值保健食品[20-22]。多糖作為長莖葡萄蕨藻主要的活性成分，近十年來成為學者們首要研究的重點[23]，目前一些報道揭示了β-1,3-木聚糖具有抗氧化、抗炎、抗病毒和抗癌等活性[24]。

海藻多糖的提取方法主要有醇提法[25-26]、熱水提取法[27]、微波輔助提取法[28-29]、超聲波輔助提取法[30-31]等，β-1,3-木聚糖在長莖葡萄蕨藻中的提取得率明顯高于其他藻類[32]，又因其營養(yǎng)價值較高，被廣泛應(yīng)用于藥品、食品與保健品中，故多糖的成分組成分析對其應(yīng)用有重要意義，因此對其單糖組分進行研究分析可對后續(xù)β-1,3-木聚糖的應(yīng)用提供參考。單糖組成分析的方法有很多，多數(shù)分析方法需要先對多糖進行降解，本研究采用堿提法來提取β-1,3-木聚糖并采用特異性酶解法對其進行鑒定，β-1,3-木聚糖酶Xyl3088 從太平洋火色桿菌Flammeovirga pacifica菌株WPAGA1 的編碼基因中翻譯而來，它是降解β-1,3-木聚糖以得到短鏈β-1,3-低聚木糖和木糖的水解酶，可確定其單糖組成成分[33]。本研究通過對常見經(jīng)濟藻類進行篩選，并利用單因素實驗和正交試驗優(yōu)選β-1,3-木聚糖的最佳提取工藝，以期為β-1,3-木聚糖功效物質(zhì)的制備及后續(xù)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長莖葡萄蕨藻 杭州牧海食品經(jīng)營有限公司；紫菜（Porphyra）、南極冰筍（Durvillaea antarctica）、紅皮藻（Palmaria palmata）、海帶（Laminaria japonica）、石蒓（Ulva lactuca）、滸苔（Enteromorpha proliferaMuller J. Agardh）、羊棲菜（Sargassum fusiforme） 自然資源部第三海洋研究所藻類保藏庫；極品肉湯、氨芐青霉素鈉、甘油、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG） 北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨、酵母粉 OXIOD 公司；瓊脂粉 廣東環(huán)凱微生物科技公司；SDS-PAGE 凝膠試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；4×Laemmli Sample Buffer、10×Tris-Glycine-SDS 電泳緩沖液 BIO-RAD 公司；Fast Blue蛋白快速染色液 Biosharp 公司；磷酸緩沖液 西隴科學股份有限公司；三氟乙酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、乙酸、氯化鈉、無水乙醇、高氯酸鈉、Tris 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；β-1,4-D-（+）-木糖 標準品，上海源葉生物科技有限公司；所有菌株和質(zhì)粒均由自然資源部第三海洋研究所構(gòu)建保存；菌株：宿主菌為大腸桿菌Escherichia coliBL21（DE3） 生工生物工程（上海）股份有限公司提供；質(zhì)粒：pET-22b（+） 氨芐抗性，由蘇州金唯智生物科技有限公司提供。

DFT-200A 200g 手提式高速粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；RXH-8 熱風循環(huán)烘箱 南京鑾豪機械設(shè)備有限公司；FNLY-2 冷凍干燥機 上海翡諾醫(yī)藥設(shè)備有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；ZD-9950轉(zhuǎn)移搖床 其林貝爾公司；JY92-IIN 超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；ZQTY-90S 振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺 蘇凈基團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Ni NTA Beads 6FF 重力柱 常州天地人和生物科技有限公司；GIS-2008 成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；DB-I 不銹鋼電熱板 上海梅香儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 木糖標準曲線的制備

1.2.1.1 苯酚-硫酸法測多糖含量標準曲線 分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 和1.0 mL 現(xiàn)配的0.1 mg·mL-1的D-木糖溶液，每一管用去離子水補加至1 mL，在冰浴條件下加入0.5 mL 5%的苯酚溶液，混勻后緩慢加入3 mL 濃硫酸，待其處于不放熱狀態(tài)時，冷卻后于490 nm 處測吸光度[33]。以吸光度Y 為縱坐標，D-木糖濃度X（mg·mL-1）為橫坐標，繪制木糖標準曲線。線性方程為y=2.3806x-0.0145，R2=0.9993。

1.2.1.2 DNS 法測還原糖含量標準曲線 分別吸取0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2、0.24、0.28、0.32 和0.4 mL 現(xiàn)配的1 mg·mL-1的D-木糖溶液，每一管用去離子水補加至為1 mL，再加入0.4 mL DNS 試劑，沸水浴5 min，冷卻后加入2.6 mL 蒸餾水，于540 nm處測吸光度[34]。以吸光度Y 為縱坐標，D-木糖濃度X（mg·mL-1）為橫坐標，繪制木糖標準曲線。線性方程為y=1.1484x-0.0051，R2=0.9992。

1.2.2 不同海藻中粗木聚糖的提取 由于β-1,3-木聚糖沒有商業(yè)銷售，參考Iriki 等[11]的方法通過以下步驟獲得純度較高的粗木聚糖。

如圖1 所示，將長莖葡萄蕨藻、海帶、紫菜、紅皮藻、石蒓、南極冰筍、滸苔和羊棲菜分別進行清洗干凈，于60 ℃烘箱內(nèi)烘干后用研磨機碾成粉末，待用。

圖1 提取工藝流程圖Fig.1 Extraction process flow chart

分別稱取20 g 長莖葡萄蕨藻、紅皮藻、石蒓、滸苔、南極冰筍、羊棲菜粉末，依次加入1000 mL 0.3 mol·L-1的NaOH 溶液，加熱煮沸30 min，待其冷卻至室溫，6 ℃條件下離心（10000 r·min-1）20 min，棄上清液，并用去離子水洗滌沉淀兩遍；將沉淀轉(zhuǎn)入1000 mL 0.25 mol·L-1硫酸溶液中重復上一步操作；向沉淀中加入1600 mL 2% NaClO4溶液，于25 ℃下攪拌脫色2 h 除去雜質(zhì)，再用去離子水洗滌離心沉淀3 次；向脫色后的沉淀中加入800 mL 2.5 mol·L-1NaOH 溶液，冰浴攪拌1.5 h 后于6 ℃離心（10000 r·min-1）20 min，棄沉淀，收集上清；在燒杯中加入4 倍體積無水乙醇，再沿壁緩緩倒入上清，靜置冷藏庫4 ℃過夜；取醇沉后得到的沉淀，6 ℃離心（10000 r·min-1）20 min 收集沉淀，于1200 mL 的5.7 mol·L-1無水乙酸溶液中和洗滌，再用去離子水洗滌離心三遍去除殘留乙酸；將上述沉淀即粗木聚糖轉(zhuǎn)移至凍干機真空干燥，取出并碾成粉末，待用。

1.2.3 長莖葡萄蕨藻粗木聚糖提取單因素條件優(yōu)化

1.2.3.1 NaOH 濃度對粗木聚糖得率的影響 步驟同1.2.2 除去酸堿雜質(zhì)后，料液比1:40 g·mL-1，選取1.0、2.0、2.5、3.0 和4.0 mol·L-1不同濃度NaOH 作為提取劑，在冰浴條件下提取1.5 h，再經(jīng)NaClO4脫色，醇沉后凍干，計算粗木聚糖得率。

1.2.3.2 提取時間對粗木聚糖得率的影響 步驟同1.2.2 除去酸堿雜質(zhì)后，料液比1:40 g·mL-1，以濃度為2.5 mol·L-1NaOH 水溶液為提取劑，在冰浴條件下分別提取1、1.5、2、3 和5 h，再經(jīng)NaClO4脫色，醇沉后凍干，計算粗木聚糖得率。

1.2.3.3 料液比對粗木聚糖產(chǎn)量的影響 步驟同1.2.2 除去酸堿雜質(zhì)后，以濃度為2.5 mol·L-1NaOH水溶液為提取劑，選取1:20、1:40、1:60、1:80、1:100 和1:120 g·mL-1不同料液比條件，在冰浴條件下提取1.5 h，再經(jīng)NaClO4脫色，醇沉后凍干，計算粗木聚糖得率。

1.2.4 正交試驗 根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇合適的NaOH 濃度（A）、提取時間（B）和料液比（C）為參考因素，以粗木聚糖得率為指標，選擇單因素試驗影響較大的堿量、提取時間和料液比3 個因素，進行三因素三水平正交試驗，確定粗木聚糖提取工藝條件的最優(yōu)組合。

1.2.5 特異性β-1,3-木聚糖酶（Xyl3088）制備與純化由蘇州金唯智公司合成并驗證了Xyl3088 的基因序列，構(gòu)建了pET-His-Xyl3088-SpyTag 表達載體，并將上述質(zhì)粒成功地導入宿主菌E.coliBL21（DE3）中進行表達[33]。于200 mL LB 培養(yǎng)基內(nèi)依次加入0.2 mL 0.1 g·mL-1氨芐青霉素鈉溶液和250 μL 甘油菌，于搖床37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)12 h 活化；在400 mL TB 培養(yǎng)基內(nèi)依次加入0.2 mL 0.1 g·mL-1氨芐青霉素鈉溶和2 mL 活化后的菌液，于搖床37 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)3～4 h，待菌體處于對數(shù)生長期時，加入1 mL 0.1 mol·L-1IPTG 溶液，于搖床20 ℃，180 r·min-1培養(yǎng)24 h 進行誘導表達；將誘導表達后的菌液于4 ℃，10000 r·min-1條件下離心20 min 后棄掉上清，將菌體細胞與PBS 緩沖液（pH=7.0）混合（1：20，v/v），重復上述離心操作；菌體細胞于冰浴條件下進行細胞破碎，超聲功率300 W（50%），超聲開時間2 s，超聲關(guān)時間4 s，工作時間20 min；細胞經(jīng)超聲破碎后于4 ℃，11000 r·min-1條件下離心20 min，上清液經(jīng)0.45 μm 的濾膜過濾后即為酶液粗提物。經(jīng)鎳柱進行分離純化，使用濃度從低到高的咪唑緩沖液洗脫目標蛋白以確定最佳的咪唑洗脫濃度，聯(lián)合SDS-PAGE 分析鎳柱吸附目的蛋白質(zhì)的情況，最后收集各流出液通過SDS-PAGE 電泳鑒定目的蛋白。

1.2.6 粗木聚糖單糖組成成分的鑒定

1.2.6.1 不同海藻粗木聚糖的制備、酶解及酶解前后還原糖含量測定 分別將長莖葡萄蕨藻、紅皮藻、石蒓、滸苔、羊棲菜、南極冰筍、海帶和紫菜在提取時間3 h、NaOH 濃度2.5 mol·L-1、料液比1:100 g·mL-1的條件下制得粗木聚糖，精密稱取0.1 g 溶于Tris-HCl 溶液（pH=7.0）配制成1%粗木聚糖溶液。取400 μL 的1%的粗木聚糖溶液于離心管中，加入50 μL Xyl3088（酶活為49 U/mg），37 ℃的水浴鍋中反應(yīng)24 h，再于100 ℃煮沸5 min 使酶滅活，離心收集上清即為1%β-1,3-木寡糖溶液，為酶解實驗組。將Xyl3088 替換為去離子水，重復上述操作，為空白對照組。通過DNS 法測定了空白對照組與酶解實驗組的還原糖含量，在540 nm 處測定吸光度，并根據(jù)標準曲線計算還原糖含量。

1.2.6.2 長莖葡萄蕨藻粗木聚糖的酶解產(chǎn)物的薄層鑒別 稱取粗木聚糖1.0 g，加入20 mL 濃度為1 mol·L-1的三氟乙酸，利用三氟乙酸的強酸性，對β-1,3-木聚糖充分水解，在70 ℃孵育2 h 和12 h 后分別取少量木寡糖溶液離心，上清液用1 mol·L-1的NaOH 進行中和至pH=7.0，便可作為薄層層析色譜標準品使用[35]。將上述溶液分別在薄層板上點樣展開，由于極性的不同，各成分隨著展開劑不斷上升，當距離硅膠頂端5 cm 處，取出，均勻噴灑顯色劑，放置250 ℃電爐加熱10 min 顯色拍照。

展開劑：正丁醇:冰醋酸:去離子水=10:5:3。

顯色劑：2.0 g 二苯胺、2 mL 苯胺、10 mL 磷酸、100 mL 丙酮配制而成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)重復進行3 次，結(jié)果以平均值±標準偏差來表示。實驗數(shù)據(jù)整理采用Excel 2019；數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 24.0 軟件，并進行顯著性分析；繪圖采用Origin Pro 2021 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻中粗木聚糖提取結(jié)果對比

通過堿提法對長莖葡萄蕨藻、紫菜、南極冰筍、紅皮藻、海帶、石蒓、滸苔和羊棲菜進行初步篩選，計算粗木聚糖得率（見圖2），長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率最高，可達到13.67%±0.25%，其他幾種藻類的得率較低，均在5%以下。研究表明，董喆[36]采用水提醇沉法，以超純水為溶劑，在提取時間3 h，提取溫度80 ℃，料液比為1:30 g·mL-1的條件下對長莖葡萄蕨藻多糖進行提取，最終得率約為5.04%。與水提醇沉法和超聲波輔助法的結(jié)果[36-37]相比，堿提法的粗木聚糖得率最高，且長莖葡萄蕨藻的粗木聚糖得率遠高于其它經(jīng)濟藻類，故選取長莖葡萄蕨藻作為對象，進行下一步研究。

圖2 不同海藻中粗木聚糖得率Fig.2 Yield of crude xylan in different algae

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 NaOH 濃度對粗木聚糖得率的影響 在料液比1:40 g·mL-1，提取時間為1.5 h 的條件下，以粗木聚糖得率為考察指標，考察NaOH 濃度對粗木聚糖產(chǎn)量的影響。由于木聚糖難溶于水，易溶于堿溶液，所以堿液濃度是提取的重要參數(shù)。木聚糖作為細胞壁中的一類結(jié)構(gòu)性多糖，它與纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和多糖等形成較為復雜的共價鍵，有非常復雜的物理交纏關(guān)系，在水提法和稀堿條件下，提取困難[38]。由圖3 可知，當NaOH 濃度為1 mol·L-1時，粗木聚糖得率較低，僅為3.6%±0.1%，表明較低NaOH 濃度的處理作用較弱，不能完全透過長莖葡萄蕨藻細胞壁，從而導致提取率低，只能溶解出與木質(zhì)素、纖維素等其他木聚糖成分結(jié)合程度較低的部分，而不足以完全破壞長莖葡萄蕨藻的結(jié)構(gòu)，以溶解出較多的木聚糖[39]。當NaOH 濃度到2.5 mol·L-1時，得率趨于平緩，達到21.4%±0.2%；隨著NaOH 溶液濃度增加，NaOH 溶液濃度為4 mol·L-1時，可能導致糖的降解，故引起木聚糖得率略有降低至20.0%±0.2%。因此，在兼顧得率和經(jīng)濟性的同時，選擇濃度為2.5 mol·L-1NaOH 溶液作為最佳提取液條件。

圖3 NaOH 濃度對長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率的影響Fig.3 Effect of NaOH concentration on yield of crude xylan from Caulerpa lentillifera

2.2.2 提取時間對粗木聚糖得率的影響 在料液比1:40 g·mL-1，以濃度為2.5 mol·L-1NaOH 水溶液為提取劑的條件下，以粗木聚糖得率為考察指標，考察不同提取時間對粗木聚糖產(chǎn)量的影響。由圖4 可知，當提取時間從1 h 增大到3 h 時，粗木聚糖得率隨著水解時間的增大而逐漸升高，由18.6%±0.1%提高至24.1%±0.2%，結(jié)果表明適當延長水解時間有助于提高粗木聚糖的得率。在提取時間較短的情況下，提取液和多糖的接觸不完全，混合不徹底，長莖葡萄蕨藻組織原料的多糖組分隨著時間增加逐漸降低，多糖物質(zhì)的濃度梯度繼續(xù)降低，不斷溶解并擴散到提取液中使得溶劑中多糖含量逐漸增加[40]。當提取時間為大于3 h 時，粗木聚糖得率增加變得緩慢，趨于穩(wěn)定。由增加提取時間帶來的收益并不顯著，過度增加提取時間并沒有太大的意義，出于節(jié)約時間及能源的考慮，選擇提取時間為3 h 最佳預處理條件。

圖4 提取時間對長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of crude xylan from Caulerpa lentillifera

2.2.3 料液比對粗木聚糖得率的影響 以濃度為2.5 mol·L-1NaOH 水溶液為提取劑，提取時間為1.5 h條件下，以粗木聚糖得率為考察指標，考察不同料液比對粗木聚糖得率的影響。由圖5 可知，當料液比為1:20 g·mL-1時，粗木聚糖得率較低，僅為8.2%±0.1%，可能是由于樣品濃度過高，溶劑的量較少，物質(zhì)的溶解擴散緩慢，不利于細胞壁中木聚糖的溶解溶出，從而得率較低。隨著料液比的降低，提取物和提取劑的接觸面積也在不斷增大，傳遞速率也隨之增高，粗木聚糖得率也隨之迅速升高，可達21.1%±0.3%。當料液比小于1:100 g·mL-1時，粗木聚糖得率有所減少，降至19.7±0.4%，這是因為在提取物有限的表面積的基礎(chǔ)上，溶劑量增大導致多糖濃度降低，有利于多糖的傳質(zhì)。當溶劑量大于一定程度后，在制備及收集過程中，原料的損耗也隨之增加，后續(xù)濃縮過程耗能和時間會隨之增加[27]。于是隨著料液比的減少，長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率會出現(xiàn)小幅降低的趨勢。因此，選擇料液比1:100 g·mL-1為最佳預處理條件。

圖5 料液比對長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率的影響Fig.5 Effect of feed-liquid ratio on yield of crude xylan from Caulerpa lentillifera

2.3 正交試驗結(jié)果

2.3.1 正交試驗設(shè)計結(jié)果及驗證 在單因素實驗基礎(chǔ)上，選擇NaOH 濃度（A）、提取時間（B）和料液比（C）三個因素，進行三因素三水平正交試驗。各因素水平見表1，提取粗木聚糖的正交試驗結(jié)果見表2。

表1 長莖葡萄蕨藻粗多糖提取正交試驗Table 1 Orthogonal experiment of crude xylan extraction from Caulerpa lentillifera

表2 長莖葡萄蕨藻粗木聚糖提取正交試驗結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal test for crude xylan extraction from Caulerpa lentillifera

由表2 可知，試驗號5 號的粗木聚糖得率最高，為27.2%。不同提取條件對長莖葡萄蕨藻粗木聚糖的影響程度不同，R 值越大，表明該因素對粗木聚糖得率的影響越大[41]，因此影響提取因素順序為提取時間（B）＞料液比（C）＞NaOH 濃度（A），即提取時間對粗木聚糖得率影響最大，其次是料液比和NaOH濃度。通過比較K 值可知，3 個因素的最佳水平為A2B2C3，即提取時間3 h、NaOH 濃度2.5 mol·L-1、料液比1:100 g·mL-1。

2.3.2 方差分析及驗證最優(yōu)工藝試驗 正交試驗方差分析結(jié)果見表3，由表可知，三個因素對長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率的影響順序為提取時間（B）＞料液比（C）＞NaOH 濃度（A），與極差分析結(jié)果一致。由P值可知，三個因素中提取時間對粗木聚糖得率有顯著影響。為進一步驗證最優(yōu)工藝可靠性，在最佳提取條件下，重復三次，測得長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率為28.1%±0.6%，高于正交試驗結(jié)果，表明該條件穩(wěn)定可行。

表3 長莖葡萄蕨藻粗木聚糖得率回歸模型方差分析Table 3 Regression model ANOVA for crude xylan yield of Caulerpa lentillifera

2.4 β-1,3-木聚糖酶的表達與鑒定結(jié)果

SDS-PAGE 分析如圖6 所示，在第1 泳道可看見在分子量40～55 kDa 中間有明顯的條帶，分子量與由ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）計算出的相應(yīng)理論值48.2 kDa 相吻合，說明含有重組蛋白Xyl3088[33]，用Image J 軟件進行灰度分析得到目標蛋白的純度，結(jié)果表明純度可達90%以上，說明已經(jīng)成功地將Xyl3088 的基因在大腸桿菌中表達，可用于后續(xù)木聚糖的酶解。

圖6 Xyl3088 鎳柱純化后電泳圖Fig.6 SDS-PAGE of Xyl3088

2.5 不同海藻中β-1,3-木聚糖的鑒定結(jié)果

到目前為止，根據(jù)碳水化合物活性酶（CAZy）數(shù)據(jù)庫可知，所有發(fā)現(xiàn)的β-1,3-木聚糖酶都屬于糖苷水解酶（GH）家族26。特異性水解酶β-1,3-木聚糖酶（Xyl3088）可以酶解β-1,3-木聚糖中的β-1,3-木糖基，以得到短鏈β-1,3-木寡糖，產(chǎn)物主要以β-1,3-木二糖和β-1,3-木三糖為主[8]。由圖7 說明，長莖葡萄蕨藻中粗木聚糖溶液酶解后產(chǎn)生大量還原糖，說明該粗木聚糖為β-1,3-木聚糖，且其酶解產(chǎn)物中還原糖含量為12.23%±0.41%，而海帶、紫菜、南極冰筍、紅皮藻、羊棲菜、滸苔和石莼等酶解結(jié)果表明，其β-1,3-木聚糖含量相對較低，并沒有明顯的顯色反應(yīng)，說明這幾種經(jīng)濟藻類中并不含β-1,3-木聚糖或含量很低。

圖7 不同海藻粗木聚糖酶解前后還原糖含量Fig.7 Content of reducing sugars before and after enzymatic hydrolysis of crude xylan from different algae

2.6 長莖葡萄蕨藻粗木聚糖單糖組成成分的鑒定

β-1,3-木聚糖酶（EC 3.2.1.32）能特異性水解β-1,3-木聚糖中1,3-糖苷鍵，產(chǎn)物為具還原性的β-1,3-D-木糖，三氟乙酸同樣可以通過其強酸性將β-1,3-木聚糖斷裂成不同程度的寡糖或單糖成分，但β-1,3-木聚糖酶為特異性裂解酶可以更準確識別酶切位點，以獲得所需的目的產(chǎn)物，從而特異性地鑒定粗木聚糖單糖組成成分。利用自制的Xyl3088 酶解粗木聚糖得到寡糖溶液，對其進行薄層層析分析（見圖8）以確定酶解產(chǎn)物。因市面無β-1,3-木聚糖和β-1,3-木寡糖標準品[42]，故利用三氟乙酸的強酸性，對β-1,3-木聚糖充分水解，將1 mol·L-1的TFA 于70 ℃下降解β-1,3-木聚糖，在2 h 和12 h 分別取少量寡糖溶液離心，上清液用1 mol·L-1的NaOH 進行中和后進行薄層層析。在水解2 h 時，β-1,3-木聚糖并未完全降解，所得產(chǎn)物與Xyl3088 的酶解產(chǎn)物類型一致；在水解12 h 時，β-1,3-木聚糖幾乎完全被酸解，得到單一組分，推測與β-1,4-D-木糖標準品同屬于單糖成分[42]。Xyl3088 顯示出一定的酶解活性，產(chǎn)生一系列包括木糖、木二糖、木三糖和木四糖在內(nèi)的β-1,3-木寡糖，水解產(chǎn)物主要為二糖，初步證明從長莖葡萄蕨藻中提取的粗木聚糖為β-1,3-木聚糖。本研究僅采用薄層色譜法對β-1,3-木聚糖的單糖組成進行了定性分析，而未進行定量分析，后續(xù)可通過進一步的檢測分析確定單糖組分及酶解產(chǎn)物種各寡糖含量。

圖8 水解木聚糖產(chǎn)物的薄層色譜圖Fig.8 TLC of hydrolysis products of xylan

3 結(jié)論

本研究通過對常見經(jīng)濟藻類進行篩選，發(fā)現(xiàn)長莖葡萄蕨藻中β-1,3-木聚糖含量遠遠高于其他經(jīng)濟藻類，故確定了將長莖葡萄蕨藻作為提取β-1,3-木聚糖主要原料。采用堿提方法，在提取時間3 h、NaOH濃度為2.5 mol·L-1、料液比1:100 g·mL-1的條件下，粗木聚糖的得率可達28.1%±0.6%，優(yōu)于其他傳統(tǒng)提取方法。同時，經(jīng)β-1,3-木聚糖酶特異性酶Xyl3088酶解，結(jié)合薄層色譜鑒定酶解產(chǎn)物，表明該堿溶性粗多糖為β-1,3-木聚糖。綜上所述，本研究優(yōu)化了β-1,3-木聚糖的提取工藝并明確了β-1,3-木聚糖的單糖組成，為進一步開展β-1,3-木聚糖的純化、結(jié)構(gòu)解析與寡糖功能研究奠定了基礎(chǔ)，對β-1,3-木聚糖的深入研究具有指導意義。