吳新惠，杜金杰，劉曉純，廖楷濱，覃玉娜，梁煒杰，邱瑞瑾，張靈枝,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642；2.梧州市六堡茶研究院，廣西梧州 543003）

六堡茶是廣西特有的歷史名茶，早在清嘉慶年間就以“紅、濃、陳、醇”及其獨特的檳榔香味而入選中國名茶之一[1]。六堡茶耐于久藏，且越陳越香[2]，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗菌、保護肝臟、抗腫瘤等保健功效[3-4]。發(fā)酵食品的品質(zhì)風(fēng)味受眾多因素影響，而發(fā)酵過程中的微生物是影響發(fā)酵食品品質(zhì)風(fēng)味最重要的因素[5-6]。六堡茶作為一種典型的后發(fā)酵茶，其微生物多樣性及各種微生物對茶葉品質(zhì)風(fēng)味的影響一直以來都是黑茶研究的熱點[7]。渥堆過程大量微生物以茶葉為養(yǎng)料自發(fā)性的生長并分泌多種胞外酶。茶葉在濕熱作用和胞外酶作用下，內(nèi)部發(fā)生了茶多酚類物質(zhì)的氧化聚合，蛋白質(zhì)、纖維素等大分子物質(zhì)水解，各種產(chǎn)物進一步產(chǎn)生聚合、裂解、甲基化、糖基化、脫羧、脫氨等一系列反應(yīng)[8]，從而形成六堡茶獨特的感官品質(zhì)。因此，探明六堡茶渥堆過程微生物的多樣性及其分布規(guī)律，對進一步探究不同微生物對六堡茶感官品質(zhì)和保健功效的影響以及改善六堡茶加工工藝具有重要意義。

溫志杰等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌是六堡茶渥堆過程中的優(yōu)勢種群，而其中的優(yōu)勢酵母菌Arxula adeninivorans能夠參與多種糖的同化作用，對茶葉成分轉(zhuǎn)化、風(fēng)味形成起著重要作用。黃紫衡等[11]從不同渥堆階段的六堡茶中分離到真菌13 個屬23 個種，其中有9 種真菌是首次在六堡茶中分離并報道的微生物，發(fā)現(xiàn)黑曲霉、塔賓曲霉、Blastobotrys adeninivorans在整個渥堆過程中都有檢出，渥堆前期優(yōu)勢真菌主要為酵母、曲霉、青霉和根毛霉。毛彥等[12]從成品六堡茶中分離到一株金花菌，名為Eurotium niveoglaucum（雪黃散囊菌）。歐惠算[13]對12 種不同年份、不同茶廠的六堡茶茶樣進行研究，分離到8 個屬22 種微生物，發(fā)現(xiàn)不同茶廠茶樣的微生物雖然差異很大，但都以曲霉屬、青霉屬以及酵母屬為主，還發(fā)現(xiàn)存放年限為3、6、9 年的茶樣幾乎分離不到微生物。徐書澤[14]利用高通量測序技術(shù)從梧州茶廠4 個成品六堡茶中鑒定得到3 個門，7 個綱，9 個目，6 個科及8 個屬的真菌類群，其中曲霉屬和散囊菌屬在4 個樣品中相對豐度最高，為優(yōu)勢菌屬；還利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)從3 個不同茶廠中鑒定得到5 個屬18 種微生物，其中以曲霉屬和青霉屬為優(yōu)勢菌屬。陳慶金等[15]利用Miseq 測序技術(shù)對陳化初期六堡茶真菌進行研究，發(fā)現(xiàn)，隨著陳化進行，真菌多樣性先降低后升高，優(yōu)勢菌群為曲霉屬和散囊菌屬。陳然等[16]對六堡茶產(chǎn)品真菌進行分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌種為散囊菌屬真菌，不同廠家真菌種類各有差異，都檢測出不同含量的金花菌。胡沛然[17]利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法從六堡茶渥堆茶樣中首次分離鑒定出嗜熱菌，并篩選出傘狀毛霉菌、塔賓曲霉和煙曲霉三株產(chǎn)多酚氧化酶的嗜熱菌。前人研究發(fā)現(xiàn)黑茶發(fā)酵過程中對茶多酚物質(zhì)轉(zhuǎn)化影響最大的是微生物中的霉菌，其次是酵母，細(xì)菌對其影響最小[18]，表明真菌是影響黑茶發(fā)酵過程的關(guān)鍵因素。目前關(guān)于六堡茶真菌的研究主要集中在渥堆階段與成品茶。對毛茶及蒸壓工藝前后真菌多樣性的研究相對較少。蒸壓工藝是六堡茶結(jié)束渥堆后的一道重要工序。高溫蒸汽會殺死部分真菌，而留下來的真菌與陳放環(huán)境中的真菌一起參與了六堡茶陳化，對六堡茶“紅、濃、陳、醇”的品質(zhì)形成具有重要影響。

因此，本研究利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法，對六堡茶毛茶、渥堆以及汽蒸后共14 個茶樣可培養(yǎng)真菌進行分離鑒定，探究六堡茶渥堆過程與蒸壓工藝后真菌多樣性及分布規(guī)律，為進一步探究不同茶源真菌對六堡茶品質(zhì)影響提供了材料基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、查氏瓊脂培養(yǎng)基（CA） 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，培養(yǎng)基配制后用高壓滅菌鍋滅菌20 min、121 ℃?zhèn)溆谩?/p>

GXZ-250A 恒溫光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；SW-CJ-2F 雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；DM750 光學(xué)顯微鏡 徠卡顯微系統(tǒng)（上海）有限公司；WACS-1060 自動高壓蒸汽滅菌鍋韓國DAIHAN 科學(xué)有限公司。

1.2 樣品的采集

茶樣取自廣西中茶茶廠2020 年渥堆發(fā)酵茶樣，茶堆翻堆時溫度不超過60 ℃，發(fā)酵時控制茶堆含水量為18%～28%。取樣包括毛茶、翻堆6 次（分為堆表DB 和堆內(nèi)DN）及汽蒸后（汽蒸溫度160～180 ℃，2～3 min）茶樣共14 個茶樣，編號為毛茶、DN1～DN6、DB1～DB6 以及汽蒸后茶樣。其中，樣品取樣采用五點取樣法，每次取300 g 左右，每個樣品3 個重復(fù)，樣品取出后于-80 ℃保存待用。

1.3 真菌的分離與鑒定

1.3.1 真菌的分離 參照歐惠算的方法[19]并稍作修改，具體如下：

分離：稱取茶樣25 g 放入500 mL 三角瓶，加入無菌水225 mL 后置于搖床上搖振15 min，制得10-1倍菌懸液，再將其稀釋為10-2～10-7倍菌懸液備用。用移液槍吸取1 mL 菌懸液均勻涂布在提前備好的PDA 和CA 平板上，每個樣品三個重復(fù)，對照組（CK）為無菌水。將樣品密封后放到28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，每天觀察并拍照記錄。

1.3.2 真菌的鑒定 菌株純化后編號，三點接種于CA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，拍攝菌株在平板上的正反面，觀察并記錄菌株形態(tài)特征；利用光學(xué)顯微鏡觀察菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、菌絲形態(tài)，孢子大小、形狀及顏色等特征。

DNA 序列分析：將活化好的菌株用平板劃線法劃線生長7 d 后送往上海生工技術(shù)有限公司進行測序分析。應(yīng)用引物ITS1 和ITS4 進行分析，測定序列。

1.4 數(shù)據(jù)處理

圖片拼接采用Photoshop，系統(tǒng)發(fā)育樹繪制采用MEGA-X 軟件。將得到的序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫用Blast 軟件進行同源序列比對分析，選擇相似性大于99%的序列作為菌種鑒定參考，用MEGA-X 軟件進行鄰接法（neighbor-joining）聚類構(gòu)建參考菌與鑒定菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的微生物分析

從毛茶、渥堆階段及汽蒸后六堡茶樣品中分離出的81 株菌，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后，利用光學(xué)顯微鏡觀察菌株的菌落、菌絲、分生孢子梗、分生孢子頭和分生孢子，所有菌株的形態(tài)特征如圖1所示，參照《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》，再根據(jù)所示的ITS 序列鑒定結(jié)果，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2 所示。去重后鑒定為13 個屬39 種真菌。渥堆過程中真菌種類最豐富，分離到9 個屬33 種真菌，其次為毛茶5 個屬10 種真菌，蒸后6 個屬9 種真菌。在屬水平上，曲霉屬、籃狀菌屬和酵母屬真菌在所有茶樣中均檢測到，六堡毛茶和渥堆過程中主要為曲霉屬和青霉屬的真菌，且毛茶中分離到的10 種真菌大多數(shù)在翻堆前期和中期仍然存在，推測發(fā)酵過程中的大部分真菌是來自于茶原料。蒸后茶樣中以籃狀菌屬真菌為主，曲霉屬和青霉屬大量消失，幾乎檢測不到，推測部分真菌已被高溫蒸汽殺死。Penicillium commune（團青霉）、Aureobasidium pullulans（出芽短梗霉）、Aureobasidium melanogenum（產(chǎn)黑色素短梗霉）只在毛茶中檢測到，Aspergillus chevalieri（謝瓦氏曲霉）、Aspergillus niger（黑曲霉）、Aspergillus tubingensis（塔賓曲霉）、Aspergillus sydowii（聚多曲霉）、Aspergillus ruber（赤曲霉）、Aspergillus versicolor（雜色曲霉）、Aspergillus amstelodami（阿姆斯特丹曲霉）、Aspergillus fumigatus（煙曲霉）、Aspergillus keratitidis、Aspergillus montevidensis、Aspergillus intermedius、Aspergillus flavus、Penicillium chermesinum（鮮紅青霉）、Penicillium manginii、Penicilliumcitrinum（桔青霉）、Penicillium mallochii（馬洛奇青霉）、Penicillium sumatraense、Penicillium senticosum（刺青霉）、Penicillium griseofulvum（灰黃青霉）、Penicillium brocae、Talaromyces pinophilus、Talaromyces cellulolyticus、Talaromyces amestolkiae、 Cladosporium sphaerospermum、Cladosporium tenuissimum、Microascus trigonosporus、Pseudocercosporella fraxini、Arxula adeninivorans、Rhodotorula diobovata、Sakaguchia dacryoidea、Trichomonascus ciferrii、Moesziomyces antarcticus只在渥堆過程中檢測到，而Triodiomyces crassus、Penicillium laeve（無絨毛青霉）、Penicillium gerundense、Talaromyces siamensis只在蒸后茶樣中檢測到。在所有分離到的真菌中還包括6 種金花菌，分別為Aspergillus chevalieri、Aspergillus ruber、Aspergillus amstelodami、Aspergillus montevidensis、Aspergillus intermedius和Penicillium manginii，以及7 種酵母菌，Arxula adeninivorans、Aureobasidium pullulans、Aureobasidium melanogenum、Rhodotorula diobovata、Sakaguchia dacryoidea、Trichomonascus ciferrii、Moesziomyces antarcticus。

圖1 菌株的形態(tài)分析Fig.1 Morphological analysis of strains

圖2 分離到的真菌與Blast 比對結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the isolated fungi and Blast comparison results

2.2 微生物的分布情況

由表1 可知，酵母菌Arxula adeninivorans在所有樣品中均出現(xiàn)，Aureobasidium pullulans和Aureobasidium melanogenum只在毛茶中分離到，Rhodotorula diobovata、Sakaguchia dacryoidea、Trichomonascus ciferrii、Moesziomyces antarcticus4 種酵母菌出現(xiàn)在渥堆中后期。6 種金花菌只在渥堆前中期出現(xiàn)。籃狀菌屬真菌主要分布于渥堆中后期，其中Talaromyces pinophilus只在第六次翻堆中未分離到。枝孢屬真菌出現(xiàn)于翻堆中期及蒸后茶樣中。渥堆前期，隨著茶堆溫度逐漸升高，喜溫喜濕的曲霉屬和青霉屬真菌迅速增加，成為發(fā)酵前期的主要真菌；渥堆后期，隨著茶堆含水量的降低，曲霉屬和青霉屬真菌種類驟減，酵母屬和籃狀菌屬真菌大量出現(xiàn)。第三次翻堆時分離到的真菌種類最多，且在所有渥堆樣品中堆表的真菌種類都比堆內(nèi)多。在第六次翻堆時分離到的黑曲霉和Talaromyces amestolkiae在汽蒸后仍然出現(xiàn)，說明其耐高溫，為嗜熱菌。

表1 渥堆及蒸壓過程六堡茶真菌分布情況Table 1 Distribution of fungi in Liupao tea during the pile-fermentation and autoclaved process

3 討論與結(jié)論

黑曲霉、Talaromyces amestolkiae和Arxula adeninivorans在汽蒸前后均分離到，這與歐惠算等[20]的研究結(jié)果有一定差異，可能由于不同廠家生產(chǎn)的六堡茶原料及渥堆環(huán)境中所含微生物群落結(jié)構(gòu)不同，汽蒸處理后，參與后期陳化階段的微生物也不一樣，從而導(dǎo)致不同廠家六堡茶風(fēng)味不同。本研究分離到22 種真菌，為首次在六堡茶中發(fā)現(xiàn)并報道，其中，Aspergillus keratitidis、 Aspergillus montevidensis、Aspergillus intermedius、 Penicillium sumatraense、Penicillium senticosum、Talaromyces cellulolyticus、Talaromyces amestolkiae、 Cladosporium tenuissimum、Microascus trigonosporus、Pseudocercosporella fraxini、Rhodotorula diobovata、Sakaguchia dacryoidea、Moesziomyces antarcticus、Trichomonascus coferrii在渥堆過程中分離到，Penicillium manginii、Penicillium commune、Talaromyces pinophilus、Aureobasidium pullulans、Aureobasidium melanogenum在毛茶中分離到，Penicillium laeve、Talaromyces siamensis、Triodiomyces crassus在汽蒸后茶樣中分離到。

首次分離到的曲霉屬和青霉屬真菌在其他研究中有報道，如，Aspergillus keratitidis是一株海洋真菌[21]，能夠在固體和液體兩種介質(zhì)中對合成染料進行脫色[22]；Penicillium laeve曾在壁畫中分離到[23]；Penicillium senticosum是一種藥用植物內(nèi)生真菌[24]；Penicillium commune從四川黑茶渥堆過程中分離到，是一株分泌纖維素酶、果膠酶效果較好的菌株[25]，但其在六堡茶渥堆過程中的功效作用還有待進一步驗證；Penicillium sumatraense是中國南海軟珊瑚共附生真菌中的一種[26]。

本研究共分離到6 種金花菌，其中Aspergillus montevidensis、Aspergillus intermedius和Penicillium manginii首次在六堡茶中發(fā)現(xiàn)，而謝瓦氏曲霉、赤曲霉和阿姆斯特丹曲霉是六堡茶渥堆及陳化過程中曾報道過的金花菌[13,16,19,27-28]。蘇贊等[27]從廣西梧州六堡茶中分離到兩株謝瓦氏曲霉，能分泌一定量的果膠酶、纖維素酶和淀粉酶；歐惠算[13]發(fā)現(xiàn)阿姆斯特丹曲霉液態(tài)發(fā)酵過程中能降低茶多酚、黃酮類、氨基酸以及可溶性糖的含量，使茶褐素含量總體增加。Aspergillus montevidensis和Aspergillus intermedius同為茯磚茶中的金花菌[29-30]，Aspergillus montevidensis還是一種嗜鹽真菌[31]；楊苗等[32]通過研究NaCl 濃度對“金花菌”菌株的影響發(fā)現(xiàn)Aspergillus intermedius比Aspergillus costiforme具有更強的耐鹽特性；Penicillium manginii為金花普洱茶中曾報道過的優(yōu)勢菌，Zhou 等[33]通過對比貯藏過程金花普洱茶和普洱茶的化學(xué)成分和真菌群落，發(fā)現(xiàn)Penicillium manginii與可溶性糖呈高度顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

本研究在所有樣品中分離到7 種酵母菌。其中，Arxula adeninivorans是六堡茶中發(fā)現(xiàn)并報道過的優(yōu)勢菌酵母菌，有研究證明，Arxula adeninivorans能分泌大量胞外酶，參與多種糖的同化作用，促進茶葉中多酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，對六堡茶發(fā)酵和品質(zhì)的影響顯著[10]。其他6 種酵母菌為首次在六堡茶中分離。Rhodotorula diobovata是大棚果蔬的優(yōu)勢酵母菌[34]，產(chǎn)油脂和胡蘿卜素[35]；Trichomonascus coferrii在曲霉型豆豉后發(fā)酵過程中也有分離得到，經(jīng)鑒定為產(chǎn)香酵母，利用該菌株純種發(fā)酵豆豉能高產(chǎn)脂類化合物，賦予豆豉更濃郁的酯香、花香和果香，可用于純種發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)豆豉[36]；在一定的培養(yǎng)條件下Aureobasidium pullulan能產(chǎn)生胞外多糖，產(chǎn)生的短梗霉多糖不會影響茶葉品質(zhì)，對綠茶中的茶多酚有較好的保護作用，同時還附加了茶葉的保健作用[37]；張鵬等[38]從煙葉中篩選到的Aureobasidium melanogenum是一株產(chǎn)果香型菌株，可作為一種提高煙草品質(zhì)的香料來源。酵母菌對于六堡茶的品質(zhì)形成具有重要影響，因此，篩選鑒定六堡茶中的有益酵母菌可為未來開發(fā)六堡茶發(fā)酵菌種提供理論指導(dǎo)及菌種來源。

本研究首次從黑茶中分離到4 種籃狀菌屬真菌，Talaromyces sp.（籃狀菌）廣泛分布在食物、植物、土壤和海綿中，其代謝產(chǎn)物種類豐富且部分具有較好的生物活性[39]。分離到2 株枝孢屬真菌，Cladosporium tenuissimum首次在黑茶中被分離出，具有高產(chǎn)纖維素酶的能力[40]；Cladosporium sphaerospermum菌株曾被從蜂巢珊瑚中分離出，其發(fā)酵液具有很強的抗氧化活性。

本研究結(jié)果顯示，六堡茶渥堆及蒸壓過程中真菌種類豐富，存在多種酵母菌和金花菌。首次發(fā)現(xiàn)存在于六堡茶的22 種真菌，其中部分真菌對黑茶品質(zhì)的形成有重要影響[41]，而未在黑茶中報道過的真菌在其他食品研發(fā)[36]和植物病原菌抑制[42]等方面也發(fā)揮著重要作用，但對其在六堡茶發(fā)酵過程中的功效及安全性還有待進一步研究。因此，篩選鑒定六堡茶有益菌并將其應(yīng)用于六堡茶發(fā)酵對提升六堡茶品質(zhì)具有積極意義。本研究可為改善六堡茶加工工藝提供材料基礎(chǔ)和理論依據(jù)。