馬桃梅，韓世杰，王晶，馬歡歡，王曉暉

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅蘭州 730000

2 甘肅省中醫(yī)醫(yī)院 甘肅蘭州 730050

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平的逐步提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，人口老齡化的加劇以及遺傳等因素的影響，糖尿病發(fā)病率逐年升高且趨向于年輕化。2型糖尿?。═2DM）是一種常見(jiàn)的代謝性疾病，其主要特征是以胰島素作用障礙或分泌不足所引發(fā)的高血糖[1]，其作為全身性代謝紊亂疾病，不僅與三大物質(zhì)代謝有關(guān)，而且與鈣、磷、鎂等礦物質(zhì)代謝關(guān)系密切，從而產(chǎn)生腎病、視網(wǎng)膜病變、糖尿病足及骨骼系統(tǒng)疾病等100多種多系統(tǒng)并發(fā)癥[2]，其中2型糖尿病性骨質(zhì)疏松癥（Diabetic osteoporosis，DOP）作為2型糖尿病在骨骼系統(tǒng)中最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，國(guó)內(nèi)外研究[3-5]均證實(shí)，2型糖尿病患者存在骨量丟失，2型糖尿病繼發(fā)骨質(zhì)疏松發(fā)生率高達(dá)49.02%，主要臨床特點(diǎn)為腰背、髖部疼痛、持續(xù)肌肉疼痛，并伴有活動(dòng)受限，早期無(wú)明顯的癥狀、體征，嚴(yán)重時(shí)行走困難，身長(zhǎng)縮短，容易骨折，為患者生活帶來(lái)極大影響。

醫(yī)學(xué)古籍中尚無(wú)關(guān)于2型糖尿病性骨質(zhì)疏松的記載，糖尿病在中醫(yī)學(xué)中歸屬于“消渴病”范疇，而骨質(zhì)疏松癥根據(jù)其臨床表現(xiàn)應(yīng)歸屬于“骨痿”“骨痹”“骨枯”“腰腿痛”等病癥[6]，目前尚無(wú)統(tǒng)一的中醫(yī)命名，不過(guò)多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為“骨痿”是比較準(zhǔn)確的描述。糖尿病在中醫(yī)學(xué)中屬于“消渴”范疇，其基本病機(jī)是陰虛燥熱，病變臟腑涉及肺、胃、腎三臟，以腎為主，因此認(rèn)為糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的病因病機(jī)是由于消渴陰虛內(nèi)熱日久，耗氣傷腎，腎精虧虛，髓海不足，骨失所養(yǎng)，骨枯髓減，最終導(dǎo)致骨質(zhì)枯槁發(fā)為“骨枯”“骨痿”等[7-8]?，F(xiàn)代多數(shù)醫(yī)家也認(rèn)為腎臟虛衰，髓海不足是糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵病機(jī)。菟絲子味甘、溫，歸腎、肝、脾經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、固精縮尿、安胎、明目、 止瀉之功效[9]。枸杞子味甘，性平，歸肝、腎經(jīng)，有滋肝補(bǔ)腎、益精明目的功效[10]。兩藥都入肝腎經(jīng)，是臨床上補(bǔ)益肝腎、滋陰益髓的常用藥物，具有較好的療效。本文通過(guò)中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療DOP可能潛在作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為臨床開(kāi)發(fā)新的方藥提供方向。

材料和方法

1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

見(jiàn)表1。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件

2 中藥活性成分及其作用靶點(diǎn)篩選

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)（TCMSP） 以口服生物利用度（ OB） ≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18進(jìn)行菟絲子-枸杞子活性成分的篩選。

3 構(gòu)建小分子化合物對(duì)應(yīng)靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)

將1.步查詢(xún)到的小分子化合物依次作為關(guān)鍵詞放入相應(yīng)藥物的 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)，設(shè)置查詢(xún)結(jié)果為 Targets Information，得到各個(gè)化合物對(duì)應(yīng)靶標(biāo)蛋白合并，并通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換出作用靶點(diǎn)的通用基因名稱(chēng)，建立中藥化學(xué)成分-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

4 DOP疾病靶點(diǎn)的提取

使用糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的英文檢索術(shù)語(yǔ)（Diabetic osteoporosis）在Drug Bank、OMIM、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)DOP相關(guān)靶點(diǎn)，剔除非人源基因，繪制疾病靶點(diǎn)交集基因venn圖。

5 中藥靶點(diǎn)與疾病相關(guān)基因韋恩（Venn）圖的繪制

利用R軟件進(jìn)行中藥靶點(diǎn)與疾病相關(guān)基因韋恩（Venn）圖的繪制，圖中交集靶點(diǎn)即為菟絲子-枸杞子抗DOP的作用靶點(diǎn)。利用這些基因?yàn)闃蛄簶?gòu)建中藥后續(xù)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

6 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 （PPI） 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將中藥靶點(diǎn)-疾病基因交集文件輸入到String數(shù)據(jù)庫(kù)中，將物種設(shè)定“Homo sapiens”、參數(shù)設(shè)置為0.9，獲得PPI的數(shù)據(jù)文件。隨后將此文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，獲得蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)圖中各靶點(diǎn)的點(diǎn)度中心性（degree）、中介中心性、接近中心性等拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)。這些參數(shù)值越大說(shuō)明此節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要，選取數(shù)據(jù)排名靠前的核心靶點(diǎn)蛋白。

7 GO、KEGG分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)中藥干預(yù)DOP靶點(diǎn)進(jìn)行功能的富集分析，包括GO功能富集、京都基因與基因組百科全書(shū)通路富集（KEGG）分析，GO分析包括生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）的富集分析。

結(jié) 果

1 菟絲子-枸杞子活性成分及作用靶點(diǎn)

按照OB≥30%、DL≥0.18在TCMSP數(shù)據(jù)進(jìn)行中藥活性成分的篩選，共得到56種，其中菟絲子11種、枸杞子45種（圖中僅列出符合OB、DL條件排名前10的成分，見(jiàn)表2）。同時(shí)，篩選出菟絲子-枸杞子藥對(duì)作用靶點(diǎn)共 705個(gè)。

2 DOP疾病相關(guān)基因及相關(guān)的菟絲子-枸杞子作用靶點(diǎn)

以糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的英文為檢索術(shù)語(yǔ) （Diabetic osteoporosis）在Drug Bank、OMIM、PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)到3195個(gè)與DOP相關(guān)靶點(diǎn)，進(jìn)行了三大數(shù)據(jù)庫(kù)疾病交集靶點(diǎn)圖的繪制（圖1）。然后進(jìn)行了藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)韋恩圖的繪制獲得的交集基因共143個(gè)，

圖1 疾病靶點(diǎn)Venn圖

作為菟絲子-枸杞子治療DOP的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析（圖2）。

圖2 中藥-疾病交集靶點(diǎn)

3 “中藥-疾病-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)圖

利用 Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建“藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，共得到 185個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中中藥治療 DOP有效成分節(jié)點(diǎn)42個(gè)，疾病與藥物交集靶點(diǎn)143個(gè)。圖中紫色圓圈代表菟絲子活性成分，紅色圓圈代表枸杞子活性成分，藍(lán)色方塊代表藥物干預(yù)疾病潛在靶點(diǎn)，連線(xiàn)代表著化合物與靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系（圖3）。

圖3 中藥-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將藥物與疾病共有的143靶點(diǎn)上傳String數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白之間的作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白相互網(wǎng)絡(luò)（圖4），其中節(jié)點(diǎn)代表基因，連線(xiàn)代表蛋白互作關(guān)系，不同顏色代表不同證據(jù)。然后將網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入到 Cytoscape3.8.0軟件中利用 CytoNCA 插件進(jìn)行計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的度中心性（DC）、介度中心性（BC）、接近中心性（CC）、特征向量中心性 （EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（NC）和局部邊連通性（LAC），得到上述值的中位數(shù)，小于中位數(shù)的靶點(diǎn)則去除。第一次分析得到核心基因網(wǎng)絡(luò)共包含了123個(gè)靶基因。第二次分析得到核心基因網(wǎng)絡(luò)共包含33個(gè)重要靶基因。 最終分析得到核心靶基因共12個(gè)（圖5）。表3為最終核心基因在各個(gè)參數(shù)的得分值。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 核心靶基因

表3 最終核心基因得分值

5 GO 和 KEGG 分析

在GO富集分析中共得到2427條，其中生物學(xué)進(jìn)程 （ biological process，BP）2195條，細(xì)胞組分（cellular component，CC） 77條，分子功能 （molecular function，MF） 155條，根據(jù) P值從小到大篩選 BP、CC和 MF 排名前十繪制柱狀圖（圖6）和氣泡圖（圖7）。BP重要富集在細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)水平、氧化應(yīng)激反應(yīng)、氧活性（含量）反應(yīng)等。CC 涉及最高的條目包括膜筏、膜微區(qū)、胞質(zhì)囊腔等。MF 中富集最高的包括DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、脫氧核糖核酸結(jié)合性轉(zhuǎn)錄激活蛋白等。KEGG 通路富集分析共得到158個(gè)富集條目，選取前30個(gè) 進(jìn)行分析顯示柱狀圖（圖8）和氣泡圖（圖9），其中脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號(hào)通路、癌癥相關(guān)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF）、IL-17信號(hào)通路、肝炎相關(guān)信號(hào)通路等信號(hào)通路可能與菟絲子-枸杞子治療 DOP 機(jī)制密切相關(guān)。

圖6 GO分析的柱狀圖

圖7 GO分析的氣泡圖

圖8 KEGG通路分析的柱狀圖

圖9 KEGG通路分析的氣泡圖

討 論

2型糖尿病性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的根本在于腎虛，涉及脾、肝，三臟之間相互影響，病理表現(xiàn)為精氣不足，骨髓空虛，骨質(zhì)脆弱。菟絲子-枸杞子藥對(duì)是中醫(yī)臨床治療DOP的常用藥對(duì)，具有補(bǔ)腎填精、調(diào)節(jié)腎陰陽(yáng)平衡的功效，是補(bǔ)腎益精類(lèi)方劑中的常用藥對(duì)[11]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究菟絲子具有免疫調(diào)節(jié)、改善心腦血管、保肝、降血糖、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、骨損傷修復(fù)等作用[12-13]。枸杞子具有降血糖、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血脂、抗脂肪肝等作用，大量臨床實(shí)踐也證明兩藥合用可以治療DOP。然而，菟絲子-枸杞子藥對(duì)治療DOP的潛在機(jī)制仍不清楚，因此，本文設(shè)計(jì)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)一步探索藥對(duì)的藥理機(jī)制。

通過(guò)篩選得到菟絲子-枸杞子的活性成分共56種，其中β-谷甾醇，槲皮素、山柰酚、芝麻素等成份節(jié)點(diǎn)度值較高說(shuō)明這些化合物在抗DOP中起重要的作用，其中β-谷甾醇是一種植物甾醇，現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等作用。王鵬等[14]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明槲皮素能顯著改善骨小梁結(jié)構(gòu)數(shù)量，增加骨密度，對(duì)廢用性骨質(zhì)疏松有明顯預(yù)防作用；其機(jī)制與槲皮素可抑制 ERK1/2、MAPK mRNA 和蛋白的表達(dá)，從而抑制 ERK1/2-MAPK 信號(hào)通路的傳導(dǎo)有關(guān)。劉軍等[15]通過(guò)補(bǔ)充槲皮素輔助雙膦酸鹽治療老年性骨質(zhì)疏松患者臨床觀察，發(fā)現(xiàn)可以顯著改善患者骨密度指標(biāo)、疼痛癥狀、功能障礙情況及骨代謝指標(biāo)的異常表達(dá)，提升患者生活質(zhì)量。王艷等[16]發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過(guò)調(diào)節(jié)骨組織中OPG、RANKL的相對(duì)含量而抑制骨吸收，防止骨質(zhì)疏松?，F(xiàn)代藥理研究表明，山奈酚具有抗癌、抗炎、抗骨質(zhì)疏松、降糖、免疫調(diào)節(jié)和修復(fù)損傷組織等作用[17]。曾意榮等[18]發(fā)現(xiàn)山柰酚能夠激活雌激素受體的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，提高成骨細(xì)胞分化和礦化能力。馬忠平等[19]發(fā)現(xiàn)芝麻素有通過(guò)調(diào)節(jié) Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的趨勢(shì)，對(duì)重塑大鼠骨結(jié)構(gòu)有一定影響，對(duì)骨質(zhì)疏松有治療和預(yù)防作用。

本研究結(jié)果表明，菟絲子-枸杞子的主要有效成分可通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)、多個(gè)信號(hào)通路影響DOP的發(fā)生。其中TP53、JUN、MAPK14、ESR1、RELA等對(duì)DOP的發(fā)生發(fā)展有重要作用。這些基因可通過(guò)DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、脫氧核糖核酸結(jié)合性轉(zhuǎn)錄激活蛋白、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等影響DOP的發(fā)生，即主要影響細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體、轉(zhuǎn)錄因子等從分子水平上干預(yù)骨質(zhì)疏松[20]。

KEGG富集分析顯示血脂和動(dòng)脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號(hào)通路注釋基因數(shù)相對(duì)較多，近年來(lái)，脂質(zhì)與骨代謝之間的關(guān)系日益成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，動(dòng)脈粥樣硬化（AS）和骨質(zhì)疏松（OP）經(jīng)常同時(shí)存在?；趯?shí)驗(yàn)室和臨床的試驗(yàn)表明，脂肪細(xì)胞的增加伴隨著骨密度（BMD）和骨量的減少，用于治療高脂血癥的降脂藥物他汀類(lèi)也對(duì)DOP的治療有益處[21]。因此，有證據(jù)表明脂類(lèi)代謝與骨代謝相關(guān)，兩者相互調(diào)節(jié)。一項(xiàng)橫斷面研究研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松和動(dòng)脈粥樣硬化是共病的，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)脂質(zhì)組模塊及其特定的分子脂質(zhì)，它與骨質(zhì)疏松和動(dòng)脈粥樣硬化亞臨床期的替代標(biāo)記物顯著相關(guān)。所發(fā)現(xiàn)的脂類(lèi)代謝的改變可能有助于共病條件，并為其雙基礎(chǔ)預(yù)防方法帶來(lái)新的可能性[22]。Suzuki等[23]研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)高水平AGE使骨蛋白及骨細(xì)胞分化受到影響，導(dǎo)致骨形成減少，骨膠原連接障礙，骨的質(zhì)量降低，脆性增加，引發(fā)骨質(zhì)疏松。Zhang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在AGEs作用下，骨細(xì)胞樣MLO-Y4細(xì)胞中FOXO1基因、促凋亡基因（P53等）及下游靶基因Bax 表達(dá)增加，caspase-3活化增強(qiáng)，誘發(fā)骨細(xì)胞凋亡，致使骨代謝失衡。持續(xù)性高血糖狀態(tài)可導(dǎo)致晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的積累和激活晚期糖基化終產(chǎn)物（RAGE）信號(hào)受體，AGE-RAGE信號(hào)激活可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）功能障礙，使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化減少、炎癥增強(qiáng)、活性氧產(chǎn)生和BMSC凋亡[25]。因此菟絲子-枸杞子可通過(guò)抑制AGE-RAGE信號(hào)，減弱高糖介導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能障礙，可能是糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的潛在治療方法。AGEs可通過(guò)調(diào)節(jié)AGEs受體（RAGE）促進(jìn)破骨細(xì)胞骨吸收，抑制成骨細(xì)胞骨形成。此外，AGEs破壞骨質(zhì)量并通過(guò)改變骨材料成分增加骨折風(fēng)險(xiǎn)[26]。研究表明測(cè)量血清中sRAGE的水平可能在骨質(zhì)疏松進(jìn)展的監(jiān)測(cè)中具有潛在的診斷作用，特別是在從預(yù)防和篩查階段到骨質(zhì)減少水平到骨質(zhì)疏松的骨折風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中[27]。

綜上所述，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度對(duì)菟絲子-枸杞子治療DOP的潛在活性成分、關(guān)鍵基因和關(guān)鍵通路、機(jī)制進(jìn)行了闡述，并通過(guò)細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該藥對(duì)治療 OP 的協(xié)同增效作用。 結(jié)果提示該藥對(duì)在DOP的治療中可能涉及不同靶點(diǎn)和通路延緩DOP的進(jìn) 展，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療多靶點(diǎn)、多途徑的治療特點(diǎn)。