程群，朱付平

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南長(zhǎng)沙 410208

2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 湖南長(zhǎng)沙 410007

肢體缺血-再灌注損傷（limb ischemia reperfusion injury，LI-RI），是指肢體在血流減少或停止后，肢體的血流恢復(fù)，肌肉等組織的受損傷程度更加嚴(yán)重的一種綜合征[1]，是骨科疾病中致殘、致死率較高的疾病之一。[2]西醫(yī)治療手段以消炎、止痛、消腫為主，對(duì)LI-RI治療效果一般。中醫(yī)認(rèn)為L(zhǎng)I-RI辨病屬于股腫、脈痹等范疇，與氣行不暢，血瘀脈中有關(guān)。[3]隨著中醫(yī)的發(fā)展，中醫(yī)藥在此病的治療方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)。有研究表明[4-5]桃紅四物湯可以減輕炎癥反應(yīng)，改善血液循環(huán)，對(duì)LI-RI有著不錯(cuò)的治療效果。桃紅四物湯作為治療LI-RI的有效方，其作用機(jī)制尚不清楚。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究桃紅四物湯治療LI-RI的作用機(jī)制，為臨床用藥和基礎(chǔ)研究提供一定理論依據(jù)。

資料與方法

1 桃紅四物湯有效成分和靶點(diǎn)的搜集

在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)[6]（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）中，以口服生物利用度（OB）≥30% 和類(lèi)藥性（DL）≥0.18為篩選條件，分別篩選出桃紅四物湯中桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎六位中藥的有效成分，然后用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)[7]查找與其相對(duì)應(yīng)的官方基因名稱，得到并整理數(shù)據(jù)后，將整理好的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2[8]軟件得到“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

2 LI-RI靶點(diǎn)的搜集及韋恩圖的繪制

以“Limb ischemia-reperfusion injury”“ischemiareperfusion injury”為關(guān)鍵詞，在Gen eCards數(shù)據(jù)庫(kù)[9]、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中[10]，檢索與肢體缺血-再灌注損傷有關(guān)靶點(diǎn)，得到相關(guān)疾病基因靶點(diǎn)。將藥物基因名稱與疾病基因名稱整理、去重后，運(yùn)用Venny2.1平臺(tái)（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），繪制韋恩圖，得到藥物-疾病的交集基因。

3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的交集基因輸入到STRING 11.5（https：//cn.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)[11]中，設(shè)置物種為“Home sapiens”（人類(lèi)），得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖和TSV文件，將TSV文件導(dǎo)入到Cytoscape3.8.2軟件中進(jìn)行分析，得到核心靶點(diǎn)。

4 GO富集及KEGG信號(hào)通路富集分析

將得到的交集基因靶點(diǎn)導(dǎo)入到Metascape（https：//metascape.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中[11]，設(shè)置物種為“Home sapiens”（人類(lèi)），進(jìn)行GO富集和 KEGG 信號(hào)通路富集分析。GO分析包括生物過(guò)程（Biological Process，BP）、細(xì)胞組分（Cellular Components，CC）、分子功能（Molecular Functions）。利用微生信在線平臺(tái)繪制富集分析柱狀圖、氣泡圖。

5 主要有效成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接

將得到的主要有效成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行整理，核心靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)從PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)[12]（http：//www.pdb.org）下載；有效成分的化合物結(jié)構(gòu)在Pub-Chem數(shù)據(jù)庫(kù)[12]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載，然后使用 Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，去驗(yàn)證桃紅四物湯治療LI-RI的可能核心靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性。

結(jié) 果

1 桃紅四物湯活性成分及靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)篩選，共得到69個(gè)有效成分，桃仁23個(gè)，熟地黃2個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，白芍13個(gè)，紅花22個(gè)，川芎7個(gè)。以O(shè)B值排名前20為例，見(jiàn)表1。在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)查找與其相對(duì)應(yīng)的官方基因名稱共240個(gè)。

表1 桃紅四物湯中部分有效成分

2 成分-靶點(diǎn)圖的構(gòu)建與分析

將搜集到的240個(gè)基因，去重、整理數(shù)據(jù)后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件，得到成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。該網(wǎng)絡(luò)包含310個(gè)節(jié)點(diǎn)，909條邊，其中菱形表示靶點(diǎn)基因，圓形表示有效成分，正三角形表示藥物。然后運(yùn)用“Analyze Network ”功能進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到度值?Degree） 排名前三的有效成分為quercetin（槲皮素）、kaempferol（山柰酚）、luteolin（木犀草素），推測(cè)這三個(gè)成分可能是桃紅四物湯治療LI-RI的主要有效成分。

圖1 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

3 桃紅四物湯治療LI-RI的靶點(diǎn)

在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肢體缺血-再灌注損傷或缺血再灌注損傷進(jìn)行檢索得到相關(guān)靶點(diǎn)1211個(gè)，與桃紅四物湯共同靶點(diǎn)基因133個(gè)，運(yùn)用Venny2.1平臺(tái)，繪制得到藥物-疾病的韋恩圖。見(jiàn)圖2。

圖2 桃紅四物湯與LI-RI共同靶點(diǎn)

4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的133個(gè)交集基因，導(dǎo)入到STRING 11.5數(shù)據(jù)庫(kù)中，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖與TSV文件，PPI網(wǎng)絡(luò)中含有132個(gè)節(jié)點(diǎn)（隱藏了1個(gè)不參與網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)），2551條相互作用線，見(jiàn)圖3；將TSV文件導(dǎo)入到Cytoscape3.8.2軟件中，運(yùn)用“Network analyze”功能進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到排名?1的為核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖4（X 軸表示度值，Y 軸表示靶點(diǎn)名稱）。degree值越大，證明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用越重要。

圖3 桃紅四物湯治療LI-RI靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前11的關(guān)鍵靶點(diǎn)

5 GO富集分析

將得到的133個(gè)交集基因靶點(diǎn)導(dǎo)入到Metascape平臺(tái)中，進(jìn)行GO富集，得到生物過(guò)程1788個(gè)，細(xì)胞組分100個(gè)，分子功能152個(gè)，整理數(shù)據(jù)后得到排名前20的生物過(guò)程（Biological Process，BP）、細(xì)胞組分（Cellular Components，CC）、分子功能（Molecular Functions，MF）。然后利用微生信在線繪制富集分析柱狀圖。見(jiàn)圖5（X軸表示 GO 分析條目，Y軸表示富集分?jǐn)?shù)）。BP富集包括對(duì)脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)等。CC富集包括膜筏、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞器外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等。MF富集包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶結(jié)合腫、瘤壞死結(jié)合因子受體結(jié)合、抗氧化活性等。將GO富集排名前20條目，用氣泡圖表示，見(jiàn)圖6（氣泡越大表示基因越多，顏色越深表示P值越大） 。

圖5 GO富集分析分類(lèi)

圖6 GO分析氣泡

6 KEGG信號(hào)通路富集分析

將得到的133個(gè)交集基因靶點(diǎn)導(dǎo)入到Metascape平臺(tái)中，進(jìn)行KEGG富集，分析得到202條信號(hào)通路，主要包括AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等，整理數(shù)據(jù)后得到排名前20的信號(hào)通路，利用微生信在線繪制富集分析柱狀圖，見(jiàn)圖7（Y軸表示信號(hào)通路，X軸表示基因數(shù)目）。選取關(guān)鍵通路并整理數(shù)據(jù)后，數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件得到“靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖8（藍(lán)色六邊形表示通路，黃色菱形表示靶點(diǎn)）。

圖7 KEGG通路富集分析

圖8 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

7 分子對(duì)接結(jié)果

將得到主要有效成分槲皮素、山柰酚、木犀草素與核心靶點(diǎn)ALB、TNF、AKT1進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接分?jǐn)?shù)見(jiàn)表2。運(yùn)用 Pymol 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行輸出優(yōu)化，見(jiàn)圖9。結(jié)合能越低，表示靶點(diǎn)蛋白與有效成分結(jié)合能力越強(qiáng)[13]。

圖9 有效成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接

表2 主要有效成分與核心靶點(diǎn)對(duì)接情況

討 論

LI-RI的臨床表現(xiàn)為肢體皮膚蒼白、腫脹、疼痛，更嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致截肢或者死亡。中醫(yī)根據(jù)其臨床表現(xiàn)認(rèn)為其病機(jī)主要是氣行不暢，血瘀脈中[14]。一般以活血化瘀、理氣通絡(luò)為治法[15]，治療后氣血通暢，筋骨肌肉得到濡養(yǎng)，臨床癥狀可以得到好轉(zhuǎn)?；钛鼋?jīng)典方桃紅四物湯具有活血化瘀，祛瘀通絡(luò)的作用。同時(shí)桃紅四物湯具有抗炎、止痛、消腫的功效[16-17]，符合西醫(yī)治療LI-RI的原則。申震等[18]發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯可以減輕LI-RI中的炎癥反應(yīng)及其細(xì)胞凋亡率。

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出桃紅四物湯主要有效成分，對(duì)藥物-成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，發(fā)現(xiàn)排名前三的有效成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素。有研究表明[19]，槲皮素可以直接抑制炎癥因子（TNF-α、IL-6等）的分泌，也可以通過(guò)抑制核因子κB的表達(dá)，來(lái)抑制炎癥介質(zhì)的分泌。山奈酚是一種黃酮類(lèi)化合物，有研究證實(shí)[20-22]其具有抗氧化、抗炎、改善血液動(dòng)力學(xué)作用。沈瑞明等[23]發(fā)現(xiàn)木犀草素可以舒張血管，影響纖維細(xì)胞增殖和分化。

通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選得到degree值排名前3位分別是是ALB（白蛋白）、TNF（腫瘤壞死因子）、AKT1（蘇氨酸-蛋白激酶）。ALB具有維持血液滲透壓、具有抗休克、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、減輕水腫、抗凝等功能，ALB水平下降，則機(jī)體免疫功能受損，淋巴細(xì)胞數(shù)量下，吞噬作用減弱，并影響組織代謝及其功能[24]，導(dǎo)致LI-RI患者肢體水腫等癥狀。TNF可以通過(guò)NF-κB、MAPK 信號(hào)通路刺激炎癥反應(yīng)的發(fā)生[25]，加重LI-RI的疼痛、組織壞死等臨床癥狀。申震等[26]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α與LI-RI有密切關(guān)系，則血清中TNFα的表達(dá)水平可以作為評(píng)估LI-RI的臨床指標(biāo)。

桃紅四物湯治療LI-RI的GO富集和KEGG信號(hào)通路富集分析得出，其中生物過(guò)程與分子功能都與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、信號(hào)通路等有關(guān)，在治療LI-RI中起重要作用。KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯治療LI-RI可能與AGE-RAGE、TNF、IL-17等信號(hào)通路有關(guān)。

AGE-RAGE信號(hào)通路[27]通過(guò)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)激活NF-κB信號(hào)通路[28]，誘導(dǎo)多種炎癥因子的表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化與凋亡。有研究表明桃紅四物湯可以降低LI-RI中的細(xì)胞凋亡率[16]。TNF信號(hào)通路參與許多細(xì)胞活動(dòng)，例如炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等[29]，亦可以對(duì)其他通路起激活作用，誘發(fā)連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致LI-RI患者的疼痛產(chǎn)生或加劇[30]。IL-17信號(hào)通路的激活，與炎癥因子的產(chǎn)生、免疫應(yīng)答有關(guān)，可以導(dǎo)致多種炎癥反應(yīng)的發(fā)生和自身免疫疾病的形成[31-33]。

通過(guò)分子對(duì)接可以看到有效成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均≤-6kcal/mol，對(duì)接最穩(wěn)定是木犀草素與ALB的結(jié)合（-9.8kcal/mol），所有的結(jié)合位點(diǎn)均有穩(wěn)定的氫鍵、疏水鍵，構(gòu)建穩(wěn)定，分子結(jié)果表示桃紅四物湯有效成分能與受體蛋白穩(wěn)定結(jié)合，對(duì)LI-RI有治療作用。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接方法，對(duì)桃紅四物湯治療LI-RI的作用機(jī)制進(jìn)行了探討，桃紅四物湯治療LI-RI具有多靶點(diǎn)、多通路等特點(diǎn)，其機(jī)制可能與桃紅四物湯中有效成分槲皮素、山柰酚、木犀草素等，通過(guò)ALB、TNF、AKT1等靶點(diǎn)，激活A(yù)GE-RAGE、TNF、IL-17等信號(hào)通路，調(diào)控炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡等有關(guān)，為桃紅四物湯治療LI-RI提供了理論支持。但是，目前仍需要更多的相關(guān)實(shí)驗(yàn)和臨床研究，去進(jìn)一步研究其具體的治療機(jī)制。