張旻軼 樓毅云

據(jù)文獻報道，復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）在育齡婦女所有妊娠中的占比為2%～5%，且呈逐年上升趨勢，嚴重危害患者的生育健康[1-2]。妊娠成功與否和胎兒絨毛外滋養(yǎng)細胞以及母體蛻膜免疫細胞功能密切相關(guān)。目前臨床治療策略以對因治療為主，對于原因不明的RSA，暫無特異性的治療手段[3]。因此，探究RSA 的具體發(fā)病機制并尋找有效的治療方法具有重要臨床意義。研究表明，滋養(yǎng)細胞的生物學行為可能在RSA 發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，如蛻膜巨噬細胞（decidual macrophage，DM）可通過分泌粒細胞集落因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）來參與調(diào)控滋養(yǎng)細胞，從而在早期妊娠中發(fā)揮作用[4-5]。滑胎安胎協(xié)定方系名老中醫(yī)臨證經(jīng)驗方，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)其可調(diào)節(jié)妊娠早期子宮內(nèi)膜蛻膜化進程，從而減少腎虛型RSA 的發(fā)生[6]。本研究采用滑胎安胎協(xié)定方干預DM 和滋養(yǎng)細胞，通過觀察DM 分泌G-CSF，滋養(yǎng)細胞增殖活性、遷移和侵襲情況以及磷脂酰肌醇三羥基激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellularly regulated protein kinases，ERK）和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)蛋白表達，從而探究滑胎安胎協(xié)定方干預DM 分泌G-CSF 調(diào)控滋養(yǎng)細胞進而影響RSA 發(fā)生的可能機制，以期為臨床治療RSA 提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料 HTR-8/SVneo人胚胎滋養(yǎng)細胞（批號：CM-0599）購于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司?；グ蔡f(xié)定方藥材包括菟絲子（批號：20220223）、覆盆子（批號：20220413）、苧麻根（批號：20220308）、桑寄生（批號：20220118）、當歸（批號：20220310）、阿膠（批號：2101013）、杭白芍（批號：20220411），均購于華東醫(yī)藥股份有限公司藥材參茸分公司，由浙江省立同德醫(yī)院藥房煎制[具體煎制方法：取菟絲子、覆盆子、苧麻根、桑寄生各80 g，當歸、阿膠、杭白芍各60 g，共計500 g。將500 g 原藥碾壓成粉狀后加入2 000 mL 蒸餾水煮沸，慢沸2.5 h，過濾殘渣收集濾液；再次加入2 000 mL 蒸餾水煮沸，收集濾液。將兩次收集的濾液置于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮過濾，得到200 mL 滑胎安胎協(xié)定方中藥液（相當于每毫升藥液中含2.5 g 原藥）][6]。分化簇（cluster of differentiation，CD）14 抗體（批號：5211204890）購于德國Miltenyi Biotec 公司；CD14 抗體（61D3）FITC（批號：F1609）購于美國Santa 公司；波形蛋白（Vimentin）抗體（批號：GR3333721-16）購于英國Abcam 公司；AKT、ERK、磷酸化ERK（p-ERK）、上皮細胞鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體（批號：4、28、28）購于美國CST 公司；磷酸化AKT（p-AKT）抗體（批號：20t9742）購于英國Affinity 公司；IL-4（批號：20200422）購于北京索萊寶科技有限公司；G-CSF 試劑盒（批號：MM-0040H2）購于江蘇酶免實業(yè)有限公司；細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒（批號：92820210318）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（批號：28718-90-3）購于美國Sigma 公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批號：3292）購于蘇州吉瑪基因股份有限公司。AE2000 光學顯微鏡購于廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；Micro17R 低溫高速離心機、BB150 細胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo 公司；NovoCyte 流式細胞儀購于美國Agilent 公司；CMaxPlus 酶標儀購于美國MD 公司；EPS300 電泳儀、VE 180C 電泳槽、VE186轉(zhuǎn)膜儀購于上海天能科技有限公司；610020-9Q 化學發(fā)光儀購于上海勤翔科學儀器有限公司。

1.2 DM 原代分離及熒光鑒定 經(jīng)浙江省立同德醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查通過（批準文號：浙同德倫審2022 研第037 號-JY），符合中西醫(yī)診斷標準[6]，選取2022 年7 月在浙江省立同德醫(yī)院婦科計劃生育門診就診的妊娠早期（妊娠＜12 周）流產(chǎn)患者1 例，經(jīng)患者知情同意后取流產(chǎn)蛻膜組織，使用0.9%氯化鈉溶液充分清洗，消化液消化，1 000 r/min 離心5 min；用Midi-MACS 緩沖液重懸細胞沉淀，加入CD14 磁珠置于4 ℃冰箱孵育，將MACS 磁柱固定在分離器上，進行細胞過柱；收集磁柱上的細胞，1 000 r/min 離心5 min，重懸細胞沉淀，置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取上述細胞懸液種板，4%多聚甲醛固定，加入Triton X-100 通透細胞膜，封閉液封閉；加入CD14 抗體孵育，漂洗，加二抗，孵育30 min，加入DAPI 染色，漂洗，封片，采用熒光顯微鏡拍照觀察。采用免疫熒光法進行巨噬細胞CD14 抗體的再次鑒定，確定所分離的細胞為DM，富集的蛻膜巨噬細胞純度約90%，見圖1（插頁）。

圖1 DM 熒光鑒定結(jié)果（×200）

1.3 滑胎安胎協(xié)定方含藥血清的制備 取無特定病原體的雌性SD 大鼠6 只，體重約250 g，購于上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司[許可證號：SCXK（滬）2017-0012]，飼養(yǎng)于浙江鷹旸醫(yī)藥研發(fā)有限公司[許可證號：SYXK（浙）2021-0033]。按隨機數(shù)字表法分為中藥組（1.8 mL 滑胎安胎協(xié)定方中藥液）和空白對照組（1.8 mL 0.9%氯化鈉溶液），均灌胃給藥，1 次/d，連續(xù)7 d，末次給藥后1 h 采集血清，過濾后-20 ℃凍存待用。所有動物實驗步驟經(jīng)浙江鷹旸醫(yī)藥研發(fā)中心實驗動物倫理委員會審查通過（批準文號：ZJEY-20220602-02）。

1.4 DM 和滋養(yǎng)細胞分組 （1）DM 分組：將培養(yǎng)好的DM 分為中藥干預組（10%滑胎安胎協(xié)定方含藥血清）、IL-4 誘導組（10 ng/mL IL-4）和空白對照組（10%空白血清），干預72 h。（2）滋養(yǎng)細胞分組：將HTR-8/SVneo細胞接種于Transwell 小室的上室中，下室分別為DM、DM+10%滑胎安胎協(xié)定方含藥血清、400 ng/mL G-CSF（預實驗提示400 ng/mL 為最合適劑量，滋養(yǎng)細胞存活率較高）、10%空白血清，構(gòu)建細胞共培養(yǎng)體系，分為DM組、DM+中藥組、G-CSF組和空白對照組，共培養(yǎng)48 h。

1.5 DM 分型檢測 采用流式細胞術(shù)。取DM，胰酶消化貼壁細胞，PBS 洗滌2 次，PBS 重懸細胞；加入相應抗體，避光孵育30 min；PBS 洗滌2 次，加入PBS 重懸細胞，使用流式細胞儀檢測DM 分型，以CD80 標記M1 型DM，CD163 標記M2 型DM[7]。

1.6 DM 中G-CSF 含量檢測 采用ELISA 法。取DM，用PBS 稀釋細胞懸液至濃度為1×107個/mL；凍融細胞，3 000 r/min 離心20 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存，參照G-CSF ELISA 試劑盒說明書檢測各組DM中G-CSF 含量。

1.7 滋養(yǎng)細胞存活率檢測 采用CCK-8 法。將HTR-8/SVneo 細胞接種于96 孔板內(nèi)，培養(yǎng)48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育；使用酶標儀測定450 nm 處的吸光度（absorbance，A）值，計算各組滋養(yǎng)細胞存活率。細胞存活率=（實驗組A 值-空白調(diào)零A值）/（對照組A 值-空白調(diào)零A 值）×100%。

1.8 滋養(yǎng)細胞遷移能力檢測 采用劃痕實驗。將HTR-8/SVneo 細胞接種于已標記的6 孔板內(nèi)，培養(yǎng)至鋪滿板孔后，使用移液槍槍頭于垂直板底部作橫線劃痕；PBS 漂洗，棄去劃痕下細胞，繼續(xù)培養(yǎng)；于0、24 h 觀察劃痕情況并拍照，使用Image J 軟件分析并計算各組滋養(yǎng)細胞遷移率。細胞遷移率=（0 h 劃痕寬度-培養(yǎng)24 h 后劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%。

1.9 滋養(yǎng)細胞侵襲能力檢測 采用Transwell 實驗。取30 μL 無血清DMEM 高糖培養(yǎng)液按3∶1 比例制備的Matrigel 稀釋液，均勻包被Transwell 小室，4 ℃孵育過夜；將Transwell 小室放入24 孔板內(nèi)，上室加入HTR-8/SVneo 細胞，培養(yǎng)24 h；使用棉簽輕擦上層未遷移細胞，固定液固定，PBS 漂洗，0.1%結(jié)晶紫染色后拍照并計數(shù)侵襲至下室的細胞數(shù)量，即細胞侵襲數(shù)量。本實驗重復3 次取平均值。

1.10 滋養(yǎng)細胞PI3K/AKT/ERK 和EMT 相關(guān)因子蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。取HTR-8/SVneo細胞，RIPA 裂解液裂解，提取總蛋白，二辛可寧酸法測定蛋白含量；經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入相應二抗，室溫孵育1 h，TBST 漂洗。以GAPDH 為內(nèi)參，電化學發(fā)光儀顯影，使用chemi caPture 軟件定量分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。

1.11 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組DM 分型檢測結(jié)果比較 與空白對照組比較，中藥干預組、IL-4 誘導組DM 數(shù)量均明顯減少（均P＜0.05），M2 型DM 數(shù)量均明顯增加（均P＜0.05），而M1 型DM 數(shù)量比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖2。

圖2 3 組DM 分型檢測結(jié)果比較

2.2 3 組DM 中G-CSF 含量比較 中藥干預組、IL-4誘導組、空白對照組DM 中G-CSF 含量分別為（95.75±9.64）、（127.62±9.72）、（65.55±7.75）ng/L，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中中藥干預組、IL-4 誘導組均明顯高于空白對照組（均P＜0.05）。

2.3 4 組滋養(yǎng)細胞存活率比較 DM 組、DM+中藥組、G-CSF組、空白對照組滋養(yǎng)細胞存活率分別為（112.20±6.04）%、（121.97±7.37）%、（143.35±8.38）%、（100.00±7.79）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中DM 組、DM+中藥組、G-CSF 組均明顯高于空白對照組（均P＜0.05）。

2.4 4 組滋養(yǎng)細胞遷移能力比較 4 組滋養(yǎng)細胞遷移率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中DM 組、DM+中藥組、G-CSF 組滋養(yǎng)細胞遷移率均明顯高于空白對照組（均P＜0.05），見圖3（插頁）。

圖3 4 組滋養(yǎng)細胞遷移能力比較

2.5 4 組滋養(yǎng)細胞侵襲能力比較 4 組滋養(yǎng)細胞侵襲數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中DM 組、DM+中藥組、G-CSF 組滋養(yǎng)細胞侵襲數(shù)量均明顯多于空白對照組（均P＜0.05），見圖4（插頁）。

圖4 4 組滋養(yǎng)細胞侵襲能力比較（×200）

2.6 4 組滋養(yǎng)細胞PI3K/AKT/ERK 和EMT 相關(guān)因子蛋白表達水平比較 4 組滋養(yǎng)細胞p-AKT/AKT、p-ERK1/2/ERK1/2、Vimentin、E-cadherin 蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而AKT、ERK1/2 蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；其中DM 組、DM+中藥組、G-CSF 組滋養(yǎng)細胞p-AKT/AKT、p-ERK1/2/ERK1/2、Vimentin 蛋白表達水平均明顯高于空白對照組（均P＜0.05），DM+中藥組、G-CSF組E-cadherin 蛋白表達水平均明顯低于空白對照組（均P＜0.05），見圖5。

圖5 4 組滋養(yǎng)細胞PI3K/AKT/ERK 和EMT 相關(guān)因子蛋白表達水平比較

3 討論

滋養(yǎng)細胞來自胚胎外滋養(yǎng)層，在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮滋養(yǎng)功能，而滋養(yǎng)細胞的遷移和侵襲對于胚胎著床和正常妊娠至關(guān)重要，滋養(yǎng)細胞功能障礙是引發(fā)RSA 的重要原因之一[4]。Fan 等[8]研究表明，滋養(yǎng)細胞可以分散成單獨的細胞株，并通過增殖、遷移、侵襲進入子宮蛻膜并發(fā)揮其作用。在生理妊娠中，DM 在協(xié)助滋養(yǎng)細胞遷移、侵襲以及形成母胎免疫耐受環(huán)境的過程中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，M2 型DM 是成功妊娠的關(guān)鍵，而M1 型DM 可能導致RSA 發(fā)生[9-10]。Ding等[11]研究表明，由M2 型DM 分泌的G-CSF 能夠調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜免疫細胞和滋養(yǎng)細胞的功能，在母體與胎兒之間的相互作用中起重要調(diào)節(jié)作用。

在中醫(yī)角度，RSA 屬“滑胎”“數(shù)墮胎”“屢孕屢墮”范疇，其病因在于母體損傷和胎元不健，多為腎虛肝郁、氣血虛弱，兼有脾胃虛寒、氣血瘀滯[12-13]。臨床上應結(jié)合病因辨證論治，以標本同治為綱，以益氣養(yǎng)血、補腎益腎為治療之根本，同時輔以補益脾胃、行氣活血[14]。本研究所用的滑胎安胎協(xié)定方中菟絲子補肝腎安胎，為君藥；覆盆子益腎固精，為臣藥；苧麻根涼血止血安胎，桑寄生補肝腎安胎，共為佐藥；當歸、阿膠、杭白芍養(yǎng)血活血、益腎固精，促進胚胎發(fā)育；諸藥相配能起到益氣養(yǎng)血、補腎安胎之功?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子提取物可通過增加早孕滋養(yǎng)層細胞的增殖活性，從而減少DM 凋亡[15]；苧麻根可提高血清中激素孕酮和人絨毛膜促性腺激素水平，進而調(diào)節(jié)外周血和胎盤組織中的Th1/Th2/Th17/調(diào)節(jié)性T 細胞，從而發(fā)揮保胎、安胎的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DM、DM+滑胎安胎協(xié)定方含藥血清、G-CSF 分別干預后，滋養(yǎng)細胞存活率、遷移率均明顯升高，侵襲數(shù)量均明顯增加，提示滑胎安胎協(xié)定方可能的作用機制是通過誘導DM 極化來促進G-CSF 分泌，從而增強滋養(yǎng)細胞的增殖、遷移和侵襲能力，可能與菟絲子有效成分能增加滋養(yǎng)層細胞增殖活性和減少DM 凋亡有關(guān)[15]。

G-CSF 在胚胎著床和功能性胚胎發(fā)育過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF 能夠通過激活PI3K/AKT 和ERKl/2 信號通路來增強滋養(yǎng)層細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2 活性和血管內(nèi)皮生長因子分泌，兩者均有助于胚胎著床和功能性胚胎的發(fā)育[17]。此外，G-CSF 還通過激活P38、ERK1/2 和PI3K 信號通路來調(diào)控β1 整合素的表達，這一調(diào)控作用導致滋養(yǎng)層細胞中β1 亞基的表達增加，從而增強滋養(yǎng)細胞的增殖、遷移和侵襲能力，減少細胞凋亡的發(fā)生，促進胚胎植入和胎盤發(fā)育[18-19]。EMT 在維持滋養(yǎng)細胞遷移和侵襲能力方面具有重要作用，Vimentin、E-cadherin 是標志性蛋白，其中Vimentin 蛋白表達水平與滋養(yǎng)細胞遷移和侵襲能力呈正相關(guān)，而E-cadherin 則相反。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制滋養(yǎng)細胞EMT 程序會削弱其遷移和侵襲能力，從而導致RSA 的發(fā)生[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DM、DM+滑胎安胎協(xié)定方含藥血清、G-CSF 分別干預后，滋養(yǎng)細胞中p-AKT、p-ERK1/2、Vimentin 蛋白表達水平均明顯升高，其中DM+滑胎安胎協(xié)定方含藥血清、G-CSF 組滋養(yǎng)細胞E-cadherin 蛋白表達水平均明顯降低，提示滑胎安胎協(xié)定方通過促進DM 分泌G-CSF 來激活PI3K/AKT/ERK 信號通路和EMT 進程，進而增強滋養(yǎng)細胞增殖、遷移和侵襲能力，幫助胚胎植入和胎盤發(fā)育，進而減少RSA 的發(fā)生。

綜上所述，滑胎安胎協(xié)定方可通過促進DM 分泌G-CSF 來激活PI3K/AKT/ERK 信號通路和EMT 進程，進而調(diào)控滋養(yǎng)細胞增殖、遷移和侵襲，從而防止RSA的發(fā)生。本研究為滑胎安胎協(xié)定方在RSA 臨床治療中的應用提供了分子機制的基礎(chǔ)。