鄭少娜，葉領(lǐng)云，梁達(dá)穎，黃婉慧，廖文波,

1.東莞理工學(xué)院基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣東 東莞 523808

2.東莞理工學(xué)院化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院，廣東 東莞 523808

聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)具有成本低、易加工、低吸水性、無毒、生物相容性良好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于牙科領(lǐng)域中最常用的義齒基托材料[1]。但是，長期佩戴義齒會影響口腔微生態(tài)平衡，沉積于義齒基托表面的菌斑及其毒素產(chǎn)物可導(dǎo)致齲病、牙周病、義齒性口炎等口腔疾病[2-3]。所以，解決PMMA的抗菌性能成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

納米銀(AgNPs)是一種抗菌譜廣、抗菌效能久、熱穩(wěn)定性好、生物安全性高、無耐藥性的納米抗菌材料，負(fù)載于無機(jī)或有機(jī)載體后添加至義齒基托樹脂中，對多種細(xì)菌具有抑制作用[4-5]。但是，AgNPs由于納米尺寸效應(yīng)，比表面能高和表面親水，在義齒基托樹脂中容易團(tuán)聚，而且在賦予基托抗菌性能的同時會影響其機(jī)械性能。兼顧機(jī)械性能和抗菌性能是義齒基托材料需要解決的重要問題[5]。

氧化石墨烯(GO)具有優(yōu)異的水溶性、殺菌活性、生物安全性等優(yōu)點(diǎn)，其獨(dú)特的片層結(jié)構(gòu)及邊緣富含的含氧親水官能團(tuán)使其極易被其他基團(tuán)修飾或負(fù)載[6-7]。作為石墨烯的氧化衍生物，在材料制備過程中僅需添加少量就能顯著改善材料的力學(xué)性能、電學(xué)性能和熱性能[8]。本研究利用GO片層結(jié)構(gòu)的反應(yīng)活性，通過靜電吸附作用和化學(xué)還原反應(yīng)在GO片層原位負(fù)載AgNPs，再與義齒基托樹脂混合后通過3D打印機(jī)打印成型，得到義齒基托復(fù)合涂層。GO在提升義齒基托材料機(jī)械性能的同時發(fā)揮出其自身抗菌性，協(xié)同AgNPs增強(qiáng)了義齒基托材料的抗菌性能。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料

氧化石墨烯(10 mg/mL，粒徑0.1 ~ 1.0 μm，工業(yè)品)：中國科學(xué)院山西煤炭化學(xué)研究所；義齒基托樹脂E-Denture(工業(yè)品)：EnvisionTEC公司；硝酸銀(分析純)：上海麥克林生化科技有限公司；氨水(分析純)：富宇精細(xì)化工有限責(zé)任公司；檸檬酸鈉(化學(xué)純)：天津市百世化工有限公司。

1.2 復(fù)合涂層的制備

將3.81 g的GO放入50 mL水中超聲分散0.5 h備用。通過緩慢滴加氨水到0.005 mol/L AgNO3溶液形成銀氨溶液，然后迅速加入到已經(jīng)分散好的GO懸浮液中。將分散懸浮液置于四口燒瓶中，機(jī)械攪拌下用恒壓漏斗在30 min內(nèi)勻速滴加30 mL的1.5 mol/L檸檬酸鈉水溶液，升溫至60 °C反應(yīng)6.0 h。反應(yīng)完畢后，通過高速離心得到灰色產(chǎn)物，置于真空干燥箱中60 °C干燥12 h，即得載銀氧化石墨烯(AgNPs-GO)。

稱取計(jì)量的AgNPs-GO和義齒基托樹脂(質(zhì)量比為1∶100)，在高速分散機(jī)中分散1 h，然后用DLP 3D打印機(jī)打印成型。按《牙科學(xué) 基托聚合物 第1部分：義齒基托聚合物》(YY 0270.1–2011)將樣條打磨成長(64.0 ± 0.2) mm、寬(10.0 ± 0.2) mm、高(3.3 ± 0.2) mm和長(32.0 ± 0.2) mm、寬(4.0 ± 0.2) mm、高(8.0 ± 0.2) mm的標(biāo)準(zhǔn)形狀。

1.3 分析與測試

1.3.1 微觀形貌分析

采用日本電子株式會社的JEM-2100F型高分辨場發(fā)射透射電鏡(TEM)觀察AgNPs-GO顆粒的微觀形態(tài)，用去離子水將樣品稀釋至固含量為0.1%左右，超聲波振蕩分散0.5 h，在銅網(wǎng)碳膜上進(jìn)行分析。

采用日本電子株式會社的JSM-6701型掃描電鏡(SEM)對AgNPs-GO及3D打印的義齒基托復(fù)合涂層的表面形貌進(jìn)行表征，所有試樣需事先進(jìn)行噴金處理。

1.3.2 表面元素分析

采用日本島津/KRATOS公司的Kratos Axis Ultra(DLD)多功能光電子能譜儀(XPS)對涂膜表面元素及其價(jià)態(tài)進(jìn)行分析，掃描范圍為700 μm × 300 μm。

1.3.3 機(jī)械性能測試

按《牙科學(xué) 基托聚合物 第1部分：義齒基托聚合物》(YY 0270.1–2011)中的規(guī)定，用萬能試驗(yàn)機(jī)按照GB/T 9341–2008《塑料 彎曲性能的測定》進(jìn)行力學(xué)性能測試，不同AgNPs-GO含量的義齒基托樹脂試樣各5個。彎曲試驗(yàn)前，將試樣貯存在(37 ± 1) °C的水中(50 ± 2) h。三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)時用恒定的(5 ± 1) mm/min加荷速率使加荷桿從零開始均勻加荷，直至試樣斷裂。斷裂韌性試驗(yàn)前，將試樣貯存在(37 ± 1) °C的水中7 d ± 2 h，臨近試驗(yàn)時再放到(23 ± 1) °C的水中(60 ± 15) min。試驗(yàn)時，載荷壓頭以(1.0 ± 0.2) mm/min的恒定位移從零開始逐漸加力，直到經(jīng)過最大壓力，缺口幾乎到達(dá)試條的對面，當(dāng)載荷減少到最大負(fù)荷的5%時試驗(yàn)結(jié)束。

1.3.4 抗菌性能測試

LB培養(yǎng)基的制備：稱取LB 2.5 g和瓊脂1.5 g，加入100 mL的超純水中溶解。隨后用高溫高壓滅菌鍋在121 °C加熱15 min，待溶液冷卻至40 ~ 50 °C，用電動移液器吸取15 mL培養(yǎng)基倒入一次性無菌平皿中。

細(xì)菌接種：用接種環(huán)挑取一定量的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，接種到培養(yǎng)基上，四區(qū)劃線，37 °C恒溫培養(yǎng)24 h。再從培養(yǎng)基中選取單克隆菌落，加LB培養(yǎng)基稀釋至細(xì)菌密度為1 × 106mL?1。取100 μL菌液加入到LB瓊脂培養(yǎng)基中混合均勻，在平板上涂抹均勻，37 °C恒溫培養(yǎng)24 h后取出拍照并測量抑菌圈大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 AgNPs-GO的合成

GO經(jīng)過氧化后，片層邊緣引入包括羥基、羧基、環(huán)氧基等在內(nèi)的帶負(fù)電荷的含氧基團(tuán)。加入銀氨溶液后，Ag+由于靜電吸附作用，吸附在片層的含氧基團(tuán)表面。添加檸檬酸鈉還原劑后，部分Ag+被原位氧化成AgNPs顆粒，合成過程如圖1所示[5]。反應(yīng)過程中，GO片層上的含氧活性基團(tuán)提供AgNPs原位生長的“節(jié)點(diǎn)”，保證了AgNPs在GO表面的均勻分布[9]。

圖1 AgNPs-GO的合成流程示意圖Figure 1 Synthesis scheme of AgNPs-GO

2.2 AgNPs-GO的化學(xué)結(jié)構(gòu)

從圖2給出的GO的FT-IR譜圖中可以看到，3 411 cm?1處有GO片層邊緣羥基的特征吸收峰，1 715 cm?1處的吸收峰應(yīng)該屬于GO片層表面的羧基，1 634 cm?1和1 544 cm?1則是GO片層上苯環(huán)特征吸收峰所處的位置，而環(huán)氧基在1 204 cm?1和1 083 cm?1兩處出現(xiàn)吸收峰。在AgNPs-GO的FT-IR譜圖上，羥基特征吸收峰明顯變寬，這是GO片層表面存在AgNPs的緣故；在1 715 cm?1的羧基特征吸收峰消失，說明AgNPs優(yōu)先在─COOH基團(tuán)表面吸附和生成，這跟文獻(xiàn)報(bào)道相同[7]。

圖2 GO和AgNPs-GO的FT-IR譜圖Figure 2 FT-IR spectra of GO and AgNPs-GO

2.3 AgNPs-GO的微觀形貌

從圖3a中可以看到，GO呈片層分布，數(shù)層氧化石墨片重合、折疊，并且具有一定的透明度，其厚度已達(dá)納米級。片層上可以觀察到不同尺度范圍和不同形狀的AgNPs，顆粒的尺寸在10 ~ 50 nm之間。在圖3b中，GO表面的褶皺結(jié)構(gòu)清晰可見，上面負(fù)載著白色的AgNPs顆粒，其形狀有的呈球形，有的呈四面體的晶體結(jié)構(gòu)，AgNPs分散性較好，未出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，顆粒尺寸與TEM觀察結(jié)果基本一致。TEM和SEM的結(jié)果證實(shí)AgNPs已經(jīng)成功負(fù)載在GO片層表面。

圖3 AgNPs-GO的TEM(a)和SEM(b)圖像Figure 3 TEM (a) and SEM (b) images of AgNPs-GO

2.4 AgNPs-GO的表面元素分析

如圖4所示，結(jié)合能541.56 eV和294.06 eV分別屬于O 1s和C 1s，380.66 eV則是Ag 3d的結(jié)合能，說明AgNPs已經(jīng)成功負(fù)載在GO片層表面。在AgNPs-GO的Ag 3d窄區(qū)掃描譜圖上，368.28 eV和374.33 eV處分別出現(xiàn)對應(yīng)于Ag 3d5/2和Ag 3d3/2的特征峰，說明還原反應(yīng)只是將部分吸附在GO片層含氧基團(tuán)表面的Ag+還原為Ag[10]。

圖4 AgNPs-GO的XPS全譜圖(a)和Ag 3d窄區(qū)掃描譜圖(b)Figure 4 XPS survey (a) and high-resolution spectrum of Ag 3d region (b) for AgNPs-GO

2.5 義齒基托復(fù)合涂層的表面形貌

從圖5中可知，GO片層嵌入到PMMA基體樹脂內(nèi)部，兩者之間沒有明確的邊界，說明GO在PMMA基體樹脂中的分散性良好。AgNPs在義齒基托復(fù)合涂層表面分散均勻，沒有觀察到明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，這是因?yàn)锳gNPs與GO片層上的含氧基團(tuán)通過靜電吸附原位生長，GO對AgNPs起到了穩(wěn)定和保護(hù)作用，避免了AgNPs的團(tuán)聚。

圖5 義齒基托復(fù)合涂層的表面SEM圖像Figure 5 SEM image of the surface of denture base composite material

2.6 義齒基托復(fù)合涂層的機(jī)械性能

有研究報(bào)道，GO片層表面和邊緣富含大量的含氧基團(tuán)，使其在水溶液及有機(jī)溶劑中的溶解度增大，更易于與聚合物復(fù)合。但是，高濃度GO的分散性會變差，在復(fù)合涂層表面團(tuán)聚，反而對機(jī)械性能產(chǎn)生負(fù)面影響。由圖6可知，添加1.0% AgNPs-GO后，義齒基托復(fù)合涂層的彎曲模量(Ef)從(687.81 ± 28.26) MPa增大到(746.42 ± 20.45) MPa，彎曲強(qiáng)度(σfM)從(24.52 ± 1.95) MPa增大到(30.06 ± 1.58) MPa，說明AgNPs-GO在復(fù)合涂層中的分散性尚好，對復(fù)合涂層機(jī)械性能的提升有正面影響。

圖6 含與不含AgNPs-GO的義齒基托涂層的機(jī)械性能Figure 6 Mechanical properties of denture base composite materials with and without AgNPs-GO

2.7 義齒基托復(fù)合涂層的殺菌性能及機(jī)理

為了研究GO和AgNPs的協(xié)同殺菌效果，考察了PMMA、添加了GO的義齒基托復(fù)合涂層(GO/PMMA)和AgNPs-GO義齒基托復(fù)合涂層(AgNPs-GO/PMMA)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性能，結(jié)果見圖7和圖8。無論采用大腸桿菌還是金黃色葡萄球菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，PMMA周圍都沒有出現(xiàn)抑菌圈，說明PMMA本身不具備抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的性能。添加了GO的義齒基托復(fù)合涂層試樣中有部分出現(xiàn)較為微弱的抑菌圈，說明GO賦予了義齒基托涂層一定的殺菌能力。而添加了AgNPs-GO的義齒基托復(fù)合涂層對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的平均抑菌圈直徑分別為2 mm和3 mm，其抗菌活性明顯高于PMMA和GO/PMMA，且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果要優(yōu)于對大腸桿菌的抑菌效果。

圖7 不同義齒基托涂層對大腸桿菌的抗菌效果Figure 7 Antibacterial effect of different denture base materials on Escherichia coli

圖8 不同義齒基托涂層對金黃色葡萄球菌的抗菌效果Figure 8 Antibacterial effect of different denture base materials on Staphylococcus aureus

GO和AgNPs協(xié)同殺菌的可能機(jī)理如圖9所示：一方面，分散在復(fù)合涂層表面的GO利用其銳利的邊緣直接接觸粘附在涂層表面的菌體，對菌膜造成物理切割損傷，從而起到殺菌的作用[2]；另一方面，AgNPs具有穩(wěn)定的緩釋作用，在O2和質(zhì)子(H+)的協(xié)同作用下所釋放的Ag+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)菌殺死[11-13]。

圖9 GO與AgNPs協(xié)同殺菌的機(jī)理Figure 9 Synergistic germicidal mechanism of GO and AgNPs

3 結(jié)論

通過靜電吸附和化學(xué)還原反應(yīng)，在褶皺的GO片層表面原位生長負(fù)載尺寸為10 ~ 50 nm的AgNPs，再與義齒基托樹脂混合后通過3D打印得到義齒基托復(fù)合涂層。AgNPs在義齒基托復(fù)合涂層表面均勻分布，義齒基托復(fù)合涂層的彎曲模量和彎曲強(qiáng)度因此而增大。GO和AgNPs協(xié)同作用可以賦予義齒基托復(fù)合涂層抑菌性能，且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于對大腸桿菌的抑菌效果。