李光勝 盧翔 賴弟利 張凱旋 王海華 周美亮

（1 湖南科技大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院，411201，湖南湘潭；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，100081，北京；3 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，520025，貴州貴陽）

苦蕎[Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn.]屬于蓼科蕎麥屬，為一年生雙子葉作物[1]。苦蕎營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)以及藥用類黃酮，如蘆丁、槲皮素、異槲皮素和表兒茶素等[2]。此外，苦蕎及其制品在預(yù)防高血壓、增強(qiáng)機(jī)體免疫力及改善亞健康狀態(tài)等方面具有較好的功效[3]。隨著人們生活質(zhì)量的提高和社會(huì)健康觀念的加強(qiáng)，苦蕎及其加工產(chǎn)品逐漸成為當(dāng)今重要的保健食品。然而，近年來隨著苦蕎種植面積的不斷擴(kuò)增，苦蕎病害的發(fā)生種類和危害程度逐年增長(zhǎng)[4]。其中，以立枯絲核菌（Rhizoctonia soflani）引起的苦蕎立枯病害較為突出[5]。

立枯絲核菌的無性態(tài)屬于無孢目（Agonomycetales）絲核菌屬（Rhizoctonia），有性態(tài)屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）[6]。立枯絲核菌一般在田間多為無性態(tài)，很難發(fā)現(xiàn)有性態(tài)。蕎麥立枯病由立枯絲核菌侵害造成，現(xiàn)已成為蕎麥一大病害，阻礙了蕎麥產(chǎn)業(yè)的高品質(zhì)發(fā)展[4]。目前，防治蕎麥立枯病的傳統(tǒng)方法是化學(xué)藥物噴施，可殺死致病菌或者抑制病菌的生長(zhǎng)，該方法效果顯著，然而長(zhǎng)期使用化學(xué)藥物會(huì)導(dǎo)致土壤微生物種群減少、土壤板結(jié)、肥力下降，且后期修復(fù)困難，還會(huì)帶來農(nóng)藥殘留等問題[7-8]。對(duì)作物資源的篩選及抗病基因的發(fā)掘是水稻抗病性研究的關(guān)鍵之一[9-10]，大豆抗病基因的生物信息學(xué)分析有利于獲得抗病蟲害的新材料[11]，而苦蕎立枯病的發(fā)生與其自身抗病性密切相關(guān)。

ATP 結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是廣泛存在于生物體中的一類大家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中ABCG 是最大的亞家族，它們?cè)谥参锲鞴俚纳L(zhǎng)發(fā)育、激素運(yùn)輸、抵御生物和非生物脅迫等方面扮演著重要作用[12]。例如，木質(zhì)素在植物病原體防御中起關(guān)鍵作用，而擬南芥中的AtABCG36轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與木質(zhì)素的合成[13]；AtABCG14 參與調(diào)控?cái)M南芥的抗旱反應(yīng)[14]。本研究從苦蕎中克隆到FtABCG12基因，并進(jìn)行了一系列功能分析，最后將FtABCG12過表達(dá)至擬南芥，分析了轉(zhuǎn)基因植株的抗病性，為進(jìn)一步研究抗病基因調(diào)控苦蕎抗立枯病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為川蕎1 號(hào)。選取飽滿且大小均勻的種子，剝?nèi)シN皮，用8% NaClO 溶液消毒8min；然后用無菌水清洗數(shù)次，采用MS 培養(yǎng)基，在22℃、光照/黑暗16h/8h、濕度75%～80%的培養(yǎng)間中培養(yǎng)。

苦蕎麥立枯絲核菌菌株（Rhizoctonia soflani，RS）、大腸桿菌菌株DH5α、轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101 和植物過表達(dá)載體pCAMBIA1307 均由蕎麥基因資源創(chuàng)新研究組提供。

1.2 苦蕎總RNA 的提取及cDNA 的合成

取苦蕎幼苗80～100mg，按照植物組織RNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]說明書提取總RNA。測(cè)定RNA 的OD260/280值，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA 進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)合格的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，將cDNA 保存于-20℃冰箱中。

1.3 苦蕎FtABCG12 基因的克隆與生物信息學(xué)分析

利用Primer 5 設(shè)計(jì)FtABCG12基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物對(duì)FtABCG12-F/R（表1），以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)總體系為50μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸1min，30 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收純化。純化產(chǎn)物連接至pTOPO-Blunt Simple Vector 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選單菌落，經(jīng)菌液PCR 鑒定后送公司進(jìn)行測(cè)序，得到FtABCG12-T 載體的質(zhì)粒。

表1 引物序列匯總Table 1 Summary of primer sequence

對(duì)測(cè)序得到的正確序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，首先利用GSDS（gene structure display server 2.0，gao-lab.org）對(duì)FtABCG12的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析；通過Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析；通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中BLASTP 搜索與該基因同源性較高的序列，并利用MEGAX 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.4 立枯絲核菌的培養(yǎng)和活化

1.4.1 PDB 培養(yǎng)基的制備 稱取馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）粉末（北京酷來博科技有限公司）26g 于蒸餾水中充分溶解，定容至1000mL，搖勻后分裝到250mL 錐形瓶中，封口，121℃高壓滅菌20min，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 PDA 培養(yǎng)基的制備 稱取馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）（北京酷來博科技有限公司）粉末11.5g 于蒸餾水中，充分溶解后定容至250mL，封口，高壓滅菌鍋滅菌，倒板，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 菌株的活化 將立枯絲核菌接種于PDA 培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中活化，暗培養(yǎng)3～5d，得到立枯絲核菌菌株。取PDA 培養(yǎng)基上2 塊長(zhǎng)勢(shì)一致的立枯絲核菌菌株分別接種于PDB 培養(yǎng)基中，28℃恒溫?fù)u床暗培養(yǎng)2～3d，過濾，得到立枯絲核菌菌液。

1.5 FtABCG12 的表達(dá)分析

1.5.1 苦蕎FtABCG12基因的組織特異性表達(dá)分析 選取生長(zhǎng)15d 的長(zhǎng)勢(shì)良好、大小一致的苦蕎無菌苗，用立枯絲核菌菌液侵染，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，侵染0、6、12、24、48h 后取材，分別提取樣品葉片、莖段和根系組織中的總RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對(duì)FtABCG12基因在苦蕎不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)FtABCG12基因的非保守區(qū)間，設(shè)計(jì)熒光定量引物對(duì)FtABCG12-qPCR-F/R（表1）。蕎麥組成型表達(dá)基因FtH3作為內(nèi)參基因，引物名稱為FtH3-qPCR-F/R（表1）。采用南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒和7500 Real Time PCR System 儀器進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)和分析。相對(duì)表達(dá)量（RQ）計(jì)算公式為RQ=2-ΔΔct。

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的構(gòu)建

1.6.1 pCAMBIA1307-FtABCG12過表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)基因克隆測(cè)序結(jié)果正確的FtABCG12序列和過表達(dá)載體pCAMBIA1307 圖譜設(shè)計(jì)引物對(duì)pCAMBIA1307-FtABCG12-F/R，以FtABCG12-T 質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶XbaI、PstI酶切pCAMBIA1307 載體。二者均用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化回收，再進(jìn)行同源重組連接，然后轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落，經(jīng)菌液PCR 檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確，即得到過表達(dá)載體pCAMBIA1307-FtABCG12。

1.6.2 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 及侵染擬南芥pCAMBIA1307-FtABCG12重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單克隆菌落，篩選鑒定得到陽性克隆。將陽性菌液搖至吸光度OD600到0.6～0.8，然后用蘸花法[15]對(duì)野生型擬南芥進(jìn)行侵染試驗(yàn)。收取轉(zhuǎn)基因植株T0代種子，使用潮霉素抗性篩選獲得T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥。提取T1代幼苗葉片基因組DNA，以其為模板，以pCAMBIA1307載體通用引物TLF 為正向引物，基因特異性引物1307-FtABCG12-R 為反向引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，檢測(cè)后獲得單株陽性過表達(dá)植株（GOE）。

1.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系抗病性的鑒定

將過表達(dá)株系GOE 和野生型對(duì)照WT 種子經(jīng)消毒晾干后點(diǎn)播在MS 固體培養(yǎng)基上。將生長(zhǎng)7d的幼苗轉(zhuǎn)到蛭石:營(yíng)養(yǎng)土為1:1 的培養(yǎng)盆中，16h光照/8h 黑暗，22℃培養(yǎng)3 周。為鑒定FtABCG12過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的抗病性，用立枯絲核菌侵染轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照株系的離體葉片，在培養(yǎng)皿中放置濾紙，用水潤(rùn)濕，保持葉片濕度，取2 種株系的葉片置于濾紙上，一部分用病菌侵染，一部分不處理，將已侵染與未侵染的培養(yǎng)皿分開，均用保鮮膜封住，置于28℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，24h 后觀察病害情況。進(jìn)一步做DAB 染色試驗(yàn)以觀察病斑情況。檢測(cè)立枯絲核菌侵染和未侵染條件下擬南芥AtABCG12基因的相對(duì)表達(dá)量、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.8 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 軟件和Origin 2019b 64Bit 等生物信息學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算、處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎抗病基因FtABCG12 的序列擴(kuò)增與生物信息學(xué)分析

從川蕎1 號(hào)幼苗中提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以該cDNA 為模板、FtABCG12-F/R 為PCR引物，擴(kuò)增獲得約1734bp 的條帶。GSDS 基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖1）表明，F(xiàn)tABCG12基因由7 個(gè)外顯子和6 個(gè)內(nèi)含子組成。

圖1 FtABCG12 基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of FtABCG12

使用Plant CARE 軟件對(duì)基因ATG 上游2000bp序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FtABCG12基因啟動(dòng)子中存在大量TATA-box 和CAAT-box 核心啟動(dòng)子元件，除此之外，還包含一系列順式作用元件，包括MeJA反應(yīng)響應(yīng)元件TGACG-motif、脫落酸反應(yīng)響應(yīng)元件ABRE、水楊酸反應(yīng)響應(yīng)元件TCA-element 等激素相關(guān)順式作用元件、光照響應(yīng)元件G-box 和損傷誘導(dǎo)響應(yīng)元件WRE3 等，結(jié)果如表2 所示。有研究報(bào)道，大部分激素都與植物抗病性相關(guān)，其中MeJA可刺激桃根霉腐爛病的特異性防御機(jī)制[16]，水楊酸可在體外抑制靈芝莖腐病病原體[17]，脫落酸抑制劑可增強(qiáng)番茄對(duì)灰葉斑病的抗性[18]。因此，推測(cè)FtABCG12基因在苦蕎中存在一定的抗病性。

表2 FtABCG12 基因啟動(dòng)子序列中的順式作用元件Table 2 Cis-acting elements in FtABCG12 gene promoter sequence

2.2 FtABCG12 蛋白同源比對(duì)與進(jìn)化樹分析

利用TAIR 在線數(shù)據(jù)庫(kù)，選取多條相似度較高的蛋白與FtABCG12（FtPinG0404610000）進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果表明，F(xiàn)tABCG12 與擬南芥AtABCG11、AtABCG12、AtABCG13 和AtABCG15 親緣關(guān)系較近。

圖2 FtABCG12 及其同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of FtABCG12 and its homologous proteins

2.3 立枯絲核菌處理下FtABCG12 基因的表達(dá)

在新的PDA 培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)之前所用的立枯絲核菌，于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d 后，取PDA 培養(yǎng)基上的2 塊大小一致的立枯絲核菌菌餅分別接種到100mL PDB 培養(yǎng)基中，28℃搖床220 轉(zhuǎn)/min 培育2～3d 得到立枯絲核菌菌液。使用該菌液侵染苦蕎幼苗0、6、12、24 和48h，分別選取不同時(shí)間段苦蕎幼苗的根系、莖段和葉片提取RNA。采用qRT-PCR方法檢測(cè)FtABCG12對(duì)立枯絲核菌侵染條件的響應(yīng)模式（圖3）。結(jié)果表明，F(xiàn)tABCG12受立枯絲核菌脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。在立枯絲核菌侵染6～24h 期間FtABCG12基因表達(dá)顯著上調(diào)。

圖3 不同處理下FtABCG12 的表達(dá)模式Fig.3 Expression patterns of FtABCG12 under different treatments

通過研究在立枯絲核菌侵染條件下，F(xiàn)tABCG12基因在苦蕎不同組織中的表達(dá)情況（圖3），發(fā)現(xiàn)FtABCG12基因在苦蕎幼苗的根、莖和葉中均有不同程度的表達(dá)。通過立枯絲核菌的脅迫處理，在侵染24h，F(xiàn)tABCG12基因在莖和葉中的表達(dá)量均顯著高于在根系中的表達(dá)量。隨著立枯絲核菌侵染時(shí)間的增長(zhǎng)，根系中0～12h 期間FtABCG12基因表達(dá)下調(diào)，12～24h 期間表達(dá)上升；在莖段和葉片中，0～24h 期間FtABCG12基因表達(dá)量均有所變化，12～24h 期間上調(diào)最顯著。在侵染24～48h 期間，根、莖、葉中FtABCG12基因表達(dá)量均下降。由此推測(cè)，在立枯絲核菌侵染苦蕎幼苗時(shí)，F(xiàn)tABCG12基因受到脅迫而誘導(dǎo)表達(dá)。在一定時(shí)間內(nèi)，F(xiàn)tABCG12基因表達(dá)上調(diào)，隨著立枯絲核菌侵入時(shí)間增長(zhǎng)，苦蕎幼苗體內(nèi)可能發(fā)生了其他生理反應(yīng)，導(dǎo)致FtABCG12基因表達(dá)下調(diào)。

2.4 FtABCG12 過表達(dá)擬南芥的抗病性鑒定

2.4.1 過表達(dá)擬南芥離體葉片侵染試驗(yàn) 將轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥正常培育3 周，取大小相近的葉片均分成2 組，分別用于立枯絲核菌離體侵染和無處理對(duì)照。如圖4 所示，發(fā)現(xiàn)24h 后對(duì)照轉(zhuǎn)基因株系和野生型沒有任何差別；而在立枯絲核菌侵染條件下，轉(zhuǎn)基因株系的離體葉片抗病性明顯高于野生型擬南芥。

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗病性表型驗(yàn)證Fig.4 Phenotypic verification of disease resistance in transgenic A.thaliana

2.4.2 DAB 染色試驗(yàn) 選取轉(zhuǎn)基因植株和野生型的離體葉片一部分進(jìn)行立枯絲核菌侵染處理，一部分不侵染。28℃培養(yǎng)箱培育24h 后，用DAB 染色液對(duì)離體葉片染色20min，再用葉綠體脫色液脫色至葉片透明。如圖5 所示，被立枯絲核菌侵染的葉片有明顯病斑，呈棕褐色。在24h 病菌侵染條件下，經(jīng)DAB 染色后，轉(zhuǎn)基因株系離體葉片的病斑明顯少于野生型株系。在0～24h 期間，轉(zhuǎn)基因植株的離體葉片抗病性明顯強(qiáng)于野生型的離體葉片。

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗病性DAB 染色驗(yàn)證Fig.5 DAB staining for resistance of transgenic A.thaliana

2.5 立枯絲核菌侵染FtABCG12 過表達(dá)擬南芥的表達(dá)模式

將轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型在相同條件下培養(yǎng)3周，每4 株擬南芥為一組。取4 組擬南芥進(jìn)行離體葉片侵染（RS-vitro），4 組離體葉片不處理（vitro），4 組擬南芥進(jìn)行活體侵染（RS-living），4 組正常培養(yǎng)（living）。24h 后提取轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用qRT-PCR 方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型在不同處理下的表達(dá)模式。

如圖6 所示，離體情況下，野生型不處理（WT-V）和立枯絲核菌侵染后（WT-RS-V）相對(duì)表達(dá)量變化不顯著；相反，轉(zhuǎn)基因擬南芥相較于不處理（GOE-V），立枯絲核菌侵染（GOE-RS-V）后的相對(duì)表達(dá)量顯著提高?；铙w條件下的結(jié)果與之一致，在野生型中，正常培養(yǎng)的擬南芥（WT-L），其FtABCG12基因的相對(duì)表達(dá)量較低，當(dāng)被立枯絲核菌侵染24h（WT-RS-L）后，相對(duì)表達(dá)量有輕微的上升；而在轉(zhuǎn)基因擬南芥中，正常培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因擬南芥（GOE-L），其FtABCG12基因的相對(duì)表達(dá)量較高，侵染條件下（GOE-RS-L）相對(duì)表達(dá)量有顯著提高。在被立枯絲核菌侵染時(shí)，相對(duì)于野生型，轉(zhuǎn)基因擬南芥的FtABCG12基因表達(dá)量顯著提高。當(dāng)轉(zhuǎn)基因擬南芥被立枯絲核菌侵染時(shí)，其體內(nèi)FtABCG12基因會(huì)作出對(duì)應(yīng)的生物化學(xué)反應(yīng)，但具體的反應(yīng)模式尚不清楚。

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)模式Fig.6 Expression patterns in transgenic A.thaliana

2.6 擬南芥抗病性相關(guān)生理生化指標(biāo)分析

如圖7 所示，在野生型擬南芥WT 未經(jīng)處理和經(jīng)立枯絲核菌侵染24h 條件下，POD 活性沒有顯著性差異；而在FtABCG12-1307 過表達(dá)株系GOE 中，擬南芥POD 活性在經(jīng)立枯絲核菌侵染24h 后顯著升高。野生型擬南芥WT 在病菌侵染下，其體內(nèi)SOD 活性的變化與正常培養(yǎng)下無顯著差異；而在過表達(dá)株系GOE 中，與正常生長(zhǎng)條件相比，被立枯絲核菌侵染24h 后，GOE 體內(nèi)的SOD 活性顯著升高。結(jié)果表明，過表達(dá)株系GOE在被立枯絲核菌侵染時(shí)，其體內(nèi)的POD 和SOD活性均會(huì)提高，表明過表達(dá)株系GOE 抗病性較野生型WT 強(qiáng)。

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗病性相關(guān)生理生化指標(biāo)分析Fig.7 Analysis of physiological and biochemical indices related to disease resistance in transgenic A.thaliana

3 討論

立枯絲核菌是廣泛存在于世界各地的植物土傳病原真菌，能夠感染多種作物，引起種子腐爛、幼苗萎蔫和根腐病等，嚴(yán)重危害植物的生長(zhǎng)進(jìn)而影響產(chǎn)量和品質(zhì)[19-20]。

劉博等[21]在分析玉米紋枯病病菌γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因表達(dá)特性時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間點(diǎn)該基因均有表達(dá)，且在立枯絲核菌侵染玉米葉片24h 表達(dá)量最高。受到立枯絲核菌侵染時(shí)，F(xiàn)tABCG12在苦蕎根、莖和葉中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)也都有表達(dá)，且在24h表達(dá)量同樣達(dá)到最高。因此，推測(cè)FtABCG12基因在病菌侵入時(shí)受立枯絲核菌誘導(dǎo)，且基因的表達(dá)與立枯絲核菌的侵染時(shí)間密切相關(guān)，進(jìn)而可以調(diào)節(jié)植物本身的抗病性。

本研究中，F(xiàn)tABCG12基因的表達(dá)量明顯受立枯絲核菌侵染的誘導(dǎo)，且在葉中表達(dá)量最高，具有明顯的組織特異性，說明在苦蕎中FtABCG12基因是奢侈基因。Olga 等[22]對(duì)大蒜進(jìn)行病菌侵染時(shí)，發(fā)現(xiàn)大蒜體內(nèi)的AsPR1基因表達(dá)量明顯增加，植物本身形成了一定的防御機(jī)制。推測(cè)在立枯絲核菌侵染苦蕎時(shí)，苦蕎自身形成了防御機(jī)制，F(xiàn)tABCG12基因表達(dá)量增加，提高了苦蕎的抗病性。

為進(jìn)一步研究擬南芥中FtABCG12基因的生理生化性質(zhì)，在不同處理下對(duì)野生型和過表達(dá)植株GOE 中的POD 及SOD 活性進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果顯示，野生型中立枯絲核菌侵染前后POD 和SOD 活性均無顯著變化，而GOE 中在病菌侵染后POD 和SOD 活性明顯增強(qiáng)。POD 和SOD 可降低自由基對(duì)細(xì)胞膜的損傷[23]。李易初等[24]發(fā)現(xiàn)，大豆菌核病致病菌致病力的強(qiáng)弱與POD 和SOD 活性相關(guān)。因此，推測(cè)POD 和SOD 活性可能與立枯絲核菌致病性相關(guān)。綜上，過表達(dá)植株GOE 在立枯絲核菌侵染后，其POD 和SOD 活性增加，提高了植物的抗病性。

4 結(jié)論

從苦蕎中克隆得到FtABCG12基因，在立枯絲核菌侵染24h 后，其在苦蕎根、莖和葉中表達(dá)量均有顯著增加，且在葉中表達(dá)量最高，表明FtABCG12基因受立枯絲核菌誘導(dǎo)表達(dá)。過表達(dá)擬南芥離體葉片侵染和DAB 染色結(jié)果說明FtABCG12基因具有顯著的抗病性。在立枯絲核菌侵染條件下，F(xiàn)tABCG12轉(zhuǎn)基因擬南芥植株GOE的POD 和SOD 活性較對(duì)照植株野生型顯著提高，其抗病能力顯著高于對(duì)照。