段青姣 焦永哲 董雙鵬 馬金竹 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局無(wú)源植入器械重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （天津 300384）

內(nèi)容提要： 對(duì)藥物洗脫支架在疲勞耐久性測(cè)試時(shí)的微粒脫落進(jìn)行了初步研究，測(cè)試條件模擬人體血管生理環(huán)境，將支架放入模擬血管，測(cè)試液體為（37±2）°C的磷酸鹽緩沖液，測(cè)試頻率為6Hz，進(jìn)行了960萬(wàn)次加速疲勞試驗(yàn)，在疲勞測(cè)試過(guò)程中實(shí)時(shí)測(cè)試微粒脫落的數(shù)量及大小。并總結(jié)了試驗(yàn)過(guò)程中需要注意的問(wèn)題，可為各醫(yī)療器械檢測(cè)機(jī)構(gòu)及生產(chǎn)企業(yè)提供參考。

隨著人口老齡化的加劇，心血管疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。冠狀動(dòng)脈易出現(xiàn)粥樣硬化，使血管腔變得狹窄，甚至被阻塞，從而造成心肌缺血缺氧，時(shí)間過(guò)久便會(huì)發(fā)生心肌壞死，嚴(yán)重威脅到患者的生命安全。藥物洗脫支架已成為治療心血管疾病的重要手段。藥物洗脫支架是把抑制細(xì)胞增生的藥物涂在支架上，使藥物可以在支架植入后的3個(gè)月左右慢慢釋放，保持支架的暢通，避免發(fā)生再狹窄。藥物洗脫支架的再狹窄率只有5%～10%，明顯改善了冠心病患者的遠(yuǎn)期預(yù)后。

微粒是一種在人體中不能代謝的不溶性顆粒，其可能有多種來(lái)源，包括醫(yī)療器械材料本身、環(huán)境和臨床使用。藥物洗脫支架除了生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)引入外來(lái)微粒，在使用過(guò)程穿越、擴(kuò)張等操作也會(huì)導(dǎo)致藥物涂層脫落，微粒進(jìn)入血液循環(huán)后，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生損害，支架植入人體后，在人體血流作用下周期性地收縮擴(kuò)張，也會(huì)加速支架上微粒脫落。微粒容易引發(fā)血栓的形成而導(dǎo)致病情惡化或引起新的疾病，微粒進(jìn)入人體血液循環(huán)后可能引發(fā)炎癥反應(yīng)、肉芽腫、血管栓塞、熱原反應(yīng)甚至惡性腫瘤等危害[1-5]。各國(guó)藥典均有對(duì)注射液微粒的限量要求，一次性醫(yī)療器械輸液器具的微粒污染已經(jīng)得到廣泛研究。

目前，國(guó)內(nèi)醫(yī)療器械行業(yè)有關(guān)器械微粒的評(píng)估，主要參照有《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)注射液微粒的要求、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 8368-2018中對(duì)一次性使用輸液器微粒污染指數(shù)的要求、GB/T 19335-2022中對(duì)一次性使用血路產(chǎn)品的微粒含量要求、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 1556-2017中對(duì)醫(yī)用輸液、輸血、注射器具微粒污染檢驗(yàn)方法的要求等，微粒的允許限量取決于多種因素，包括化學(xué)成分、潛在毒性、形狀和大小等[6-8]。現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)專(zhuān)門(mén)針對(duì)血管支架產(chǎn)品微?？刂频慕y(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，目前普遍沿用了各國(guó)藥典中對(duì)小規(guī)格注射液的標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)供試品含10μm以上的微粒不得超過(guò)6000粒，含25μm以上的微粒不得超過(guò)600粒[9]。有關(guān)藥物洗脫血管支架的微粒測(cè)試方法，目前開(kāi)展的主要是即刻微粒測(cè)試，包括基線測(cè)試和模擬使用測(cè)試，基線測(cè)試是指支架在無(wú)約束的水浴中擴(kuò)張，進(jìn)而收集支架即刻產(chǎn)生的微粒數(shù)量，模擬使用測(cè)試是支架模擬臨床使用，在37°C水浴中，支架系統(tǒng)通過(guò)血管模型后，進(jìn)行涂層檢查和即刻微粒表征。這兩種方法都只能表征支架即刻產(chǎn)生的微粒，支架植入人體后將長(zhǎng)期存在，有必要對(duì)支架長(zhǎng)期微粒脫落情況建立測(cè)試方法，目前國(guó)內(nèi)有關(guān)藥物洗脫支架的微粒疲勞耐久性測(cè)試研究鮮有人開(kāi)展。本文模擬人體生理環(huán)境，在PBS緩沖液中對(duì)藥物支架進(jìn)行了960萬(wàn)次（等效92.6d）的加速疲勞測(cè)試，對(duì)支架的微粒脫落進(jìn)行了初步研究。本文提到的方法有助于建立藥物洗脫支架的長(zhǎng)期微粒測(cè)試方法。

1.材料與方法

1.1 一般材料

試樣和裝置：試驗(yàn)樣品為某公司提供的藥物洗脫支架，材質(zhì)為鈷鉻鉬合金，輸送系統(tǒng)為與支架匹配的球囊擴(kuò)張導(dǎo)管。試驗(yàn)液體為磷酸鹽（PBS）緩沖鹽溶液，試驗(yàn)溫度（37±2）°C。模擬血管為順應(yīng)性乳膠管。壁厚0.30mm，內(nèi)徑約3.5mm。

儀器設(shè)備：采用的疲勞測(cè)試裝置為Dynatek公司的微粒疲勞試驗(yàn)機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)原理

微粒疲勞測(cè)試設(shè)備在單個(gè)波紋管上利用了電磁驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生循環(huán)壓縮。波形信號(hào)的調(diào)節(jié)使每個(gè)循環(huán)充入測(cè)試樣品中的測(cè)試溶液體積發(fā)生改變，同時(shí)引起設(shè)備徑向擴(kuò)張的變化。閉環(huán)控制使液體流入近端多路管路，在多路管路處被獨(dú)立分開(kāi)至5個(gè)單獨(dú)的測(cè)試樣品中，并將脫落的顆粒沖刷至粒子計(jì)數(shù)器中。在流過(guò)粒子計(jì)數(shù)器后，流體通過(guò)單獨(dú)的流量計(jì)，以調(diào)節(jié)通過(guò)樣品的流體速度。在通過(guò)流量計(jì)之后，流體匯聚到一根管路并在回到近端管路和測(cè)試樣品之前依次經(jīng)過(guò)電容箱、液體泵和0.2μm的濾芯。測(cè)試溶液在電容箱內(nèi)進(jìn)行加熱，液體溫度在近端管路中監(jiān)控。微粒疲勞測(cè)試設(shè)備的系統(tǒng)軟件控制測(cè)試壓力，并通過(guò)電容箱的增壓保持系統(tǒng)內(nèi)的壓力穩(wěn)定。測(cè)試頻率、試驗(yàn)溫度、循環(huán)周期計(jì)數(shù)、測(cè)試壓力及粒子數(shù)量等參數(shù)可通過(guò)微粒疲勞測(cè)試設(shè)備軟件進(jìn)行監(jiān)控和實(shí)時(shí)記錄。粒子數(shù)量由粒子計(jì)數(shù)器持續(xù)監(jiān)測(cè)，并由軟件定期進(jìn)行記錄。粒子以尺寸大小區(qū)分，并根據(jù)需要的尺寸范圍將原始計(jì)數(shù)記錄到記錄器中。

1.2.2 試驗(yàn)過(guò)程所有測(cè)試過(guò)程必須在受控的環(huán)境下（即不影響研究的完整性的環(huán)境）進(jìn)行測(cè)試，這是極為重要的，本試驗(yàn)對(duì)環(huán)境要求較高，應(yīng)盡可能在潔凈間中進(jìn)行，以防止測(cè)試過(guò)程中產(chǎn)生的微粒污染。環(huán)境污染對(duì)藥物支架脫落的微粒形態(tài)，大小和數(shù)量具有顯著影響。同樣，也可能會(huì)對(duì)支架表面造成污染，最終被誤認(rèn)為是涂層的缺陷，影響正確的判斷。試驗(yàn)人員應(yīng)穿著合適的衣服（例如，發(fā)網(wǎng)、不脫落的聚酯外套和無(wú)顆粒手套），以降低顆粒污染的風(fēng)險(xiǎn)。所有器械評(píng)估中使用的耗材應(yīng)不含污染物。玻璃器皿應(yīng)用洗滌劑溶液洗滌，然后使用無(wú)顆?；蜻^(guò)濾液徹底沖洗。試驗(yàn)開(kāi)始前，設(shè)備需要更換新的0.2μm的過(guò)濾器，保證管路潔凈，用試驗(yàn)用水徹底清潔微粒測(cè)試系統(tǒng)，這是為了保證系統(tǒng)中空白的微粒在較低水平，以使添加的任何水平的外來(lái)微粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響都可以忽略不計(jì)。

待系統(tǒng)沖洗干凈，加入PBS緩沖鹽溶液，更換驗(yàn)證管進(jìn)行微粒驗(yàn)證。應(yīng)對(duì)測(cè)試系統(tǒng)的每個(gè)通道的微?；厥章蔬M(jìn)行驗(yàn)證。微?；厥章蕬?yīng)在沒(méi)有安裝支架的情況下進(jìn)行。微粒的均勻分布以及注射體積精確與否對(duì)驗(yàn)證微?；厥章手陵P(guān)重要。注入微粒前，應(yīng)保證搖勻驗(yàn)證微粒，然后將微粒吸入注射器，排出注射器中所有氣泡，注入時(shí)，避免管道里引入任何氣泡，進(jìn)行一次或多次注射，因?yàn)檫@代表了粒子捕獲效率最差的情況。測(cè)試期間回收的微粒數(shù)量應(yīng)達(dá)到預(yù)先規(guī)定的水平。微粒計(jì)數(shù)器的準(zhǔn)確性可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)微粒進(jìn)行驗(yàn)證，建議回收的顆粒在≥10μm和≥25μm尺寸范圍內(nèi)滿(mǎn)足≥90%回收率。量化的最大顆粒尺寸滿(mǎn)足≥75%回收率，建議最大尺寸至少為≥50μm[10]。

驗(yàn)證完成后，更換測(cè)試用的順應(yīng)性模擬血管，運(yùn)行空白溶液至微粒較低水平，并持續(xù)一段時(shí)間。測(cè)試模擬血管的順應(yīng)性，其順應(yīng)性宜控制在3%～5%。根據(jù)產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)，將支架用球囊輸送系統(tǒng)輸送到模擬血管中心部位，這個(gè)過(guò)程應(yīng)在潔凈平臺(tái)進(jìn)行，將裝有支架的模擬血管安裝到疲勞機(jī)的接頭上，開(kāi)啟溫控系統(tǒng)，調(diào)整溫度到（37±2）°C，將疲勞試驗(yàn)機(jī)的頻率調(diào)到1.2Hz，壓力80～160mmHg，用激光測(cè)量?jī)x測(cè)量模擬血管（有支架部位）的平均直徑和直徑變化量，調(diào)節(jié)試驗(yàn)頻率為6Hz，并調(diào)節(jié)設(shè)備使模擬血管（有支架部位）達(dá)到目標(biāo)直徑及直徑變形量，排出系統(tǒng)中所有氣泡，開(kāi)始測(cè)試。

經(jīng)過(guò)960萬(wàn)次的加速疲勞測(cè)試后，拆除模擬血管，先用低倍放大鏡觀察支架表面是否損壞，然后用光學(xué)顯微鏡放大觀察支架，檢查支架表面是否有結(jié)構(gòu)損傷。

1.2.3 試驗(yàn)過(guò)程中需要注意的問(wèn)題

試驗(yàn)液體為PBS緩沖鹽，應(yīng)保證配制的緩沖鹽溶解完全，可先用0.45μm濾膜過(guò)濾，人體的生理溫度下鹽類(lèi)介質(zhì)很容易滋生細(xì)菌，所以試驗(yàn)開(kāi)始前有必要加入適當(dāng)?shù)囊志鷦?，以避免系統(tǒng)長(zhǎng)菌。上文提到過(guò)，排除系統(tǒng)中的氣泡至關(guān)重要，本文中的微粒計(jì)數(shù)法為光阻法，系統(tǒng)中產(chǎn)生的微小氣泡可能會(huì)作為微粒被統(tǒng)計(jì)，所以應(yīng)盡可能地排出系統(tǒng)中的所有氣泡，加熱有利于氣泡的排出，安裝支架前輕拍管子也有利于趕出氣泡。由于流量過(guò)大或者過(guò)小都會(huì)影響到微粒的計(jì)數(shù)，應(yīng)每天觀察流量計(jì)的讀數(shù)，使設(shè)備的流量維持在100mL/min。當(dāng)驗(yàn)證完成后，不要立即更換測(cè)試用的模擬血管，應(yīng)運(yùn)行空白溶液直至微粒降低到較低水平，以避免系統(tǒng)中殘留的驗(yàn)證粒子污染測(cè)試管，更換測(cè)試管后，繼續(xù)運(yùn)行空白溶液至微粒在可接受水平，此時(shí)再將支架安裝到模擬血管。這個(gè)過(guò)程可能要持續(xù)一周或更長(zhǎng)的時(shí)間，這是為了保證系統(tǒng)中的空白足夠干凈，以對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響降到最低。

2.結(jié)果

2.1 支架長(zhǎng)期微粒測(cè)試結(jié)果

由于測(cè)試開(kāi)始時(shí)安裝支架會(huì)引入大量氣泡，對(duì)空白通道10～25μm粒徑的微粒進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)從循環(huán)周期175814開(kāi)始，空白通道微粒基本達(dá)到穩(wěn)定（見(jiàn)圖1），經(jīng)過(guò)960萬(wàn)次循環(huán)的加速疲勞試驗(yàn)，每個(gè)測(cè)試樣品總微粒數(shù)及空白通道總微粒數(shù)見(jiàn)下表1和表2。

表1 .測(cè)試樣品總微粒數(shù)(包含空白)（粒）

表2 測(cè)試樣品總微粒數(shù)(扣除空白)（粒）

圖1 .空白通道10～25μm 的實(shí)時(shí)微粒數(shù)量（粒）

圖2～5是樣品及空白通道測(cè)試期間實(shí)時(shí)微粒數(shù)與總微粒數(shù)。由此可見(jiàn)扣除空白后，樣品在長(zhǎng)期的疲勞耐久測(cè)試中脫落的微粒數(shù)量在較低的水平，對(duì)支架表面放大觀察的結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。

圖2 .空白通道實(shí)時(shí)微粒數(shù)量（粒）

圖3 .空白通道總微粒數(shù)量（粒）

圖4 .樣品實(shí)時(shí)微粒數(shù)量（粒）

圖5 .樣品總微粒數(shù)量（粒）

測(cè)試到的微?？赡軄?lái)自鹽結(jié)晶、氣泡、產(chǎn)品脫落等，可對(duì)每個(gè)通道上安裝的過(guò)濾膜取出做進(jìn)一步表征，本文未作進(jìn)一步分析。

2.2 支架即刻模擬使用微粒測(cè)試結(jié)果

根據(jù)說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備支架系統(tǒng)和所有配件，將模擬穿越裝置放置在（37±2）°C的水浴中，按照使用說(shuō)明書(shū)建議使用各種輔助器械（例如，導(dǎo)引導(dǎo)管、導(dǎo)絲、導(dǎo)引鞘）操作，在血管模型中進(jìn)行穿越、擴(kuò)張、回撤支架系統(tǒng)或球囊擴(kuò)張導(dǎo)管，擴(kuò)張壓力首選額定爆破壓。模擬使用過(guò)程中的跟蹤應(yīng)通過(guò)模型彎曲路徑，該路徑模擬臨床使用過(guò)程中支架系統(tǒng)通過(guò)的具有代表性的血管幾何構(gòu)型。血管模型可以由玻璃或其他耐用的非顆粒脫落材料制成，從而最大限度地減少背景顆粒計(jì)數(shù)。血管模型需浸沒(méi)在水浴中，擴(kuò)張后的支架應(yīng)緊貼血管模型壁，待支架完全釋放后，撤出。用足夠的水沖洗導(dǎo)管、模擬穿越裝置和支架放入的血管模型，收集釋放的微粒，確保微粒已全部收集。在沖洗時(shí)注意不要損壞涂層。應(yīng)注意不要引入任何可能影響研究結(jié)果的氣泡或其他污染物。應(yīng)避免使用保留氣泡或可能產(chǎn)生氣泡的溶液進(jìn)行分析，樣品可以放置一段時(shí)間以便對(duì)樣品進(jìn)行脫氣，但應(yīng)混合均勻（如攪拌、倒置、滾動(dòng)、旋轉(zhuǎn)），以確保顆粒懸浮在樣品中。同時(shí)應(yīng)考慮和控制混合的時(shí)間、方法和速率，以便在保持顆粒懸浮液均勻的情況下最大限度地減少顆粒結(jié)塊或破碎。將支架從血管模型中取出，注意不要損壞支架涂層。收集或連續(xù)監(jiān)測(cè)從支架的涂層、支架系統(tǒng)和相關(guān)配件在整個(gè)釋放過(guò)程中累積的顆粒物，并按照顆粒的大小和范圍進(jìn)行分類(lèi)。對(duì)微粒進(jìn)行分類(lèi)是必要的，可以幫助區(qū)分微粒的來(lái)源，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3。

3.討論

目前微粒測(cè)試的方法主要有光阻法和顯微鏡法，這兩種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，光阻法的優(yōu)勢(shì)是速度快，可以對(duì)微粒進(jìn)行100%的計(jì)數(shù)，而且能夠根據(jù)微粒大小進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù)。缺點(diǎn)是不能表征微粒的組成，不能識(shí)別具有氣泡和潤(rùn)滑劑的人工制品，而且如果有陰影干擾可能會(huì)將微粒遺漏，其對(duì)非球形微粒的粒徑辨別不準(zhǔn)確，對(duì)大粒徑的微粒識(shí)別有限制。顯微鏡法的優(yōu)勢(shì)在于可以通過(guò)微粒的顏色和外觀判別來(lái)源，而且對(duì)氣泡和潤(rùn)滑劑不敏感。其缺點(diǎn)是詳細(xì)分析耗時(shí)且需要使用計(jì)算軟件，存在抽樣誤差，微粒的聚集會(huì)造成計(jì)數(shù)和粒徑的判別失誤，設(shè)備不能對(duì)樣品進(jìn)行處理（例如，從燒杯轉(zhuǎn)移到過(guò)濾器，從過(guò)濾器轉(zhuǎn)移到顯微鏡），對(duì)圖像分析軟件需要驗(yàn)證，人工計(jì)數(shù)的重復(fù)性和再現(xiàn)性差[11]。例如，若微粒中有纖維存在，由于其三個(gè)維度不同，（纖維定義為縱橫比為≥10:1），光阻法計(jì)數(shù)可能無(wú)法區(qū)分纖維，應(yīng)使用顯微鏡檢查來(lái)表征支架上脫落的顆粒形狀，以確保顆粒物計(jì)數(shù)方法的適當(dāng)性。本文中設(shè)備中的計(jì)數(shù)方法為光阻法，而濾膜上的微粒測(cè)試則需要使用顯微鏡法計(jì)數(shù)。

綜上，支架長(zhǎng)期微粒測(cè)試時(shí)影響因素眾多，安裝支架時(shí)引入的大量氣泡應(yīng)排除，此段時(shí)間產(chǎn)生的微粒數(shù)量及大小可通過(guò)濾膜上的微粒用顯微鏡法進(jìn)行測(cè)試，也可以通過(guò)支架即刻模擬使用測(cè)試進(jìn)行表征，對(duì)于微粒長(zhǎng)期測(cè)試開(kāi)始的時(shí)間點(diǎn)，本文是通過(guò)空白通道微粒趨于穩(wěn)定的時(shí)間來(lái)確定，空白通道也便于排除非顆粒物（如氣泡）等的影響，由于磷酸鹽生理環(huán)境下極易長(zhǎng)菌，測(cè)試開(kāi)始后，應(yīng)注意測(cè)試液有必要加入抑菌劑。試驗(yàn)中產(chǎn)生的微?？赏ㄟ^(guò)取出過(guò)濾膜進(jìn)一步研究，通過(guò)對(duì)微粒材料的化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行鑒定，可以將微粒的來(lái)源進(jìn)行區(qū)分，確認(rèn)微粒是否屬于支架系統(tǒng)自身產(chǎn)生。在研究和表征顆粒物的潛在來(lái)源時(shí)，顆粒的化學(xué)成分可能是一個(gè)重要的考慮因素?？紤]到器械適用的血管區(qū)域，顆粒的尺寸大小同樣重要，應(yīng)明確被測(cè)試微粒的尺寸范圍（通常為三個(gè)或更多），以量化落入這些指定分組的顆粒數(shù)量。顆粒物的化學(xué)鑒定可采用傅里葉變換紅外光譜、X射線光譜、掃描電子顯微鏡、熒光顯微鏡、拉曼光譜等方法進(jìn)行。

本文對(duì)藥物洗脫支架在疲勞耐久性測(cè)試時(shí)的微粒脫落進(jìn)行了初步研究，并總結(jié)了試驗(yàn)過(guò)程中需要注意的問(wèn)題，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究開(kāi)展較少，本研究可為各醫(yī)療器械檢測(cè)機(jī)構(gòu)及生產(chǎn)企業(yè)提供參考。而如何確定微粒的來(lái)源，評(píng)估微粒的臨床風(fēng)險(xiǎn)，以及如何確定器械產(chǎn)品的微粒限值問(wèn)題，還有待進(jìn)一步深入研究。