呂林芬，龐勝美，李保良，梁雨萱，段強(qiáng)德

（1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省動(dòng)物重要疫病和重要人獸共患病防控技術(shù)國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

仔豬腹瀉是全球范圍內(nèi)影響仔豬生產(chǎn)最為常見的胃腸道疾病，包括新生仔豬腹瀉和斷奶仔豬腹瀉（Post‐weaning diarrhea，PWD）。仔豬腹瀉在臨床主要表現(xiàn)為水樣腹瀉、體質(zhì)量減輕、生長(zhǎng)遲緩和急性死亡。由于高的感染率和較高的死亡率，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。多種因素可以引起仔豬腹瀉，其中病原微生物感染是最主要的因素。病原微生物包括病毒性病原和細(xì)菌性病原。病毒性病原主要包括傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和輪狀病毒（Rotavirus，RV）；而細(xì)菌性病原菌中最主要的是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）[1‐2]。菌毛黏附素和腸毒素是ETEC 感染引起仔豬腹瀉的2 類主要毒力因子。菌毛黏附素包括F4（F4ab、F4ac 和F4ad 3 個(gè)血清型）、F5、F6、F18（F18ab 和F18ac 2 個(gè)血清型）和F41，其中以F4ac 最為常見。腸毒素包括熱敏腸毒素（LT）和熱穩(wěn)定腸毒素（STa 和STb）[3]。對(duì)ETEC 致病機(jī)制的研究表明，ETEC 感染致病過程中，菌毛黏附素首先與仔豬小腸上皮細(xì)胞上特異性的菌毛受體結(jié)合，然后黏附、定植后的菌株通過釋放腸毒素引起機(jī)體水、電解質(zhì)紊亂，最終引起仔豬腹瀉[1]。

當(dāng)前，預(yù)防ETEC 感染所致仔豬腹瀉的主要措施包括在飼料中添加抗生素[4]、喂服特異性菌毛抗體[5]、膳食調(diào)節(jié)[6]、在飼料中添加益生菌或益生元[7]、通過遺傳育種方法選育抗ETEC 豬群[8]等。在飼料中添加抗生素很長(zhǎng)一段時(shí)間是防治ETEC 感染引起仔豬腹瀉的主要措施，但是伴隨抗生素的不適當(dāng)使用和濫用，耐藥性問題日益突出，嚴(yán)重威脅環(huán)境和公共衛(wèi)生安全[4]?？诜禺愋跃贵w雖然對(duì)仔豬腹瀉具有較好的療效，但是抗體提供的保護(hù)只限于飼喂期間，而且大量的飼喂會(huì)增加養(yǎng)殖成本[5]。膳食調(diào)節(jié)和在飼料中添加益生菌或益生元可以競(jìng)爭(zhēng)性地抑制ETEC 和其他病原菌的生長(zhǎng)，在維護(hù)仔豬腸道菌群平衡的同時(shí)，還能有效提高飼料利用率和機(jī)體的免疫力，但是在臨床上的確切效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證[6‐7]。豬群由于遺傳背景的不同會(huì)表現(xiàn)出對(duì)ETEC 的易感性或者抗性。因此，利用遺傳育種的方法選育抗ETEC 的品系是預(yù)防仔豬ETEC 感染的一種重要策略。但是如何精準(zhǔn)鑒定易感性和抗性遺傳分子標(biāo)識(shí)、抗性性能能否在種豬群中長(zhǎng)期穩(wěn)定地遺傳、育種周期太長(zhǎng)等問題決定了該策略在當(dāng)前仍然有一定的局限性[8]。綜上所述，疫苗將是目前預(yù)防ETEC 感染所致仔豬腹瀉最經(jīng)濟(jì)、有效和實(shí)用的措施之一。但是，由于ETEC 血清型眾多、表達(dá)毒力因子的異質(zhì)性、腸毒素野毒本身的細(xì)胞毒性、STa 和STb 腸毒素的弱免疫原性等問題，高效、廣譜ETEC 疫苗的研發(fā)也面臨居多挑戰(zhàn)。因此，對(duì)當(dāng)前各種豬用ETEC 疫苗的優(yōu)缺點(diǎn)、ETEC 疫苗研發(fā)面臨的主要問題以及高效廣譜ETEC 疫苗的研究策略進(jìn)行綜述，旨在為研發(fā)防制ETEC 感染引起的仔豬腹瀉的高效、新型疫苗提供新思路。

1 ETEC滅活菌苗

當(dāng)前，滅活菌苗仍然是臨床上用來預(yù)防仔豬ETEC 感染引起腹瀉的主要疫苗。國內(nèi)商品化的滅活苗是由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研制的F4、F5 和F6+ETEC 三價(jià)全菌滅活苗。該菌苗是將分別表達(dá)F4、F5和F6菌毛黏附素的ETEC 菌株接種適宜各菌毛黏附素高效表達(dá)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，再將培養(yǎng)物用甲醛滅活，加氫氧化鋁膠作為佐劑制備而成。妊娠母豬在分娩前40 d和15 d分別免疫1次，每次2～5 mL。新生仔豬可以通過吮吸免疫母豬的初乳而獲得被動(dòng)免疫，從而預(yù)防ETEC 引起的新生仔豬腹瀉。由美國Elanco 動(dòng)物保健有限公司所研制的ETEC 四價(jià)滅活苗除包含F(xiàn)4、F5、F6 三種血清型的ETEC 菌株外，還增加了F41 血清型的ETEC 菌株，能同時(shí)預(yù)防這4 種不同血清型的ETEC 菌株感染引起的新生仔豬腹瀉。碩騰公司研發(fā)的仔豬C 型產(chǎn)氣莢膜梭菌病、大腸桿菌?。‵4、F5、F6 和F41+ETEC）二聯(lián)滅活疫苗（利特佳），可以同時(shí)預(yù)防大腸桿菌引起的新生仔豬腹瀉和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的仔豬紅痢。

此外，也有一些研究表明，利用在當(dāng)?shù)馗篂a仔豬流行的ETEC 血清型制備的單價(jià)或多價(jià)自家滅活苗免疫當(dāng)?shù)刎i場(chǎng)同樣也具有良好的免疫保護(hù)效果[9‐10]。張鵬[9]從安徽6個(gè)地區(qū)17家規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)分離并鑒定篩選出優(yōu)勢(shì)血清型ETEC 菌株，選用優(yōu)勢(shì)血清型的強(qiáng)毒株和弱毒株分別制備單價(jià)滅活疫苗或強(qiáng)毒-弱毒株二價(jià)滅活苗，研究結(jié)果表明，無論是單價(jià)還是二價(jià)滅活苗，在小鼠模型中均表現(xiàn)出良好的免疫保護(hù)效果。楊德鴻等[10]將從蘇北地區(qū)21 家規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)中分離鑒定得到的優(yōu)勢(shì)血清型ETEC菌株制備成單價(jià)或二價(jià)自家滅活苗，研究結(jié)果表明，制備的單價(jià)滅活苗對(duì)感染同種血清型的ETEC小鼠具有100%的免疫保護(hù)作用，而二價(jià)滅活苗對(duì)2種血清型ETEC 菌株均具有很高的保護(hù)率，并且對(duì)其他血清型ETEC 菌株感染也具有部分保護(hù)效果。ETEC 自家滅活疫苗對(duì)當(dāng)?shù)亓餍醒逍偷腅TEC 菌株感染具有較好的免疫保護(hù)效果，但是對(duì)不同血清型或者其他地區(qū)流行的血清型ETEC 菌株的保護(hù)效果較差。目前，還沒有商品化的滅活苗用來預(yù)防斷奶仔豬腹瀉，這主要是由于免疫F18ac+ETEC 滅活苗對(duì)F18ac+ETEC感染沒有良好的保護(hù)效果。

ETEC 滅活苗使用的優(yōu)點(diǎn)在于制備程序簡(jiǎn)便，疫苗安全性高，免疫原性和穩(wěn)定性高，儲(chǔ)存以及運(yùn)輸方便。但是滅活苗也存在諸多缺點(diǎn)，如疫苗中存在多種與所需免疫保護(hù)無關(guān)的抗原成分和佐劑，有效抗原含量少，免疫保護(hù)效果較一般，不良反應(yīng)較明顯；接種劑量大，免疫保護(hù)期較短，并且需要多次重復(fù)接種。此外，全菌滅活苗主要誘發(fā)體液免疫，不能產(chǎn)生細(xì)胞免疫或黏膜免疫應(yīng)答。

2 ETEC口服活疫苗

ETEC 的口服活疫苗主要是從自然界篩選到的自然弱毒或無毒菌株。目前，市售的活疫苗只有美國Elanco 公 司 研 制 的Coliprotec?F4 單 價(jià) 和Coliprotec?F4/F18 二價(jià)活疫苗。大于18 日齡仔豬，斷奶后1 d 通過飲水口服單個(gè)劑量的Coliprotec?F4活疫苗（1×108cfu），在免疫后3、7、21 d 進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，免疫后3 d 的保護(hù)效果即達(dá)到53%，免疫后7、21 d 的保護(hù)效果分別為89% 和100%?？梢姡瑔蝿┝康腃oliprotec?F4 活疫苗即對(duì)F4+ETEC 感染引起的斷奶仔豬腹瀉具有良好的免疫保護(hù)效果[11]。NADEAU 等[12]研究表明，大于18 日齡的斷奶仔豬通過飲水口服免疫Coliprote?F4/F18雙價(jià)活疫苗[1.6×108cfu（F4），2.8×108cfu（F18）]，在免疫后7、21 d，對(duì)F4+和F18+血清型的ETEC 菌株感染的斷奶仔豬均具有良好的保護(hù)效果。此后，GOODMAN[13]等的臨床應(yīng)用效果調(diào)查表明，以上2種疫苗在臨床上對(duì)斷奶仔豬腹瀉的保護(hù)效果不佳。這可能主要是由于引起斷奶仔豬腹瀉的病因較多，以及飼喂和管理方式等因素對(duì)疫苗的使用效果影響也很大。目前，國內(nèi)商品化的活疫苗僅有中牧實(shí)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的仔豬大腸桿菌腹瀉K88（F4）-LTB 雙價(jià)基因工程疫苗。該疫苗重組菌株能夠同時(shí)表達(dá)F4 菌毛和LT 腸毒素的B 亞單位，臨床上主要應(yīng)用于預(yù)防F4+ETEC 感染引起的新生仔豬腹瀉。免疫程序：在母豬預(yù)產(chǎn)期前15～25 d，將每頭份疫苗（5×1010cfu）與2 g 小蘇打一起拌入精飼料中，空腹飼喂母豬后再常規(guī)喂食；或者于母豬預(yù)產(chǎn)期前10～20 d 進(jìn)行肌肉注射免疫（每頭100 億cfu 活菌，注射劑量為1 mL）。疫情嚴(yán)重的豬場(chǎng)，則需在產(chǎn)前7～10 d再加強(qiáng)免疫1次，方法同上。

目前，除了以上3種商品化的疫苗外，也有多種活疫苗處于研發(fā)階段。HUR 等[14]利用減毒傷寒沙門氏菌同時(shí)表達(dá)F4ab、F4ac、F5、F6 和F41 菌毛，研究表明，妊娠母豬在生產(chǎn)前10 d 口服該重組菌株對(duì)斷奶前（<21 d）仔豬的ETEC 感染具有良好的免疫保護(hù)效果。與傳統(tǒng)的肌肉注射疫苗相比，減毒傷寒沙門氏菌重組ETEC 活疫苗在1 周齡和3 周齡的仔豬中能夠誘導(dǎo)更高水平的菌毛黏附素IgG 抗體。但是研究沒有評(píng)估該候選疫苗是否對(duì)21 d 以后斷奶仔豬的ETEC 感染同樣具有良好的免疫保護(hù)效果。除免疫母豬外，研究表明，仔豬免疫表達(dá)菌毛黏附素和/或腸毒素的重組菌株對(duì)仔豬ETEC 感染也有比較好的保護(hù)效果。RUAN 等[15]研究表明，將表達(dá)FaeG-FedF-LTA2:B融合蛋白的重組菌株連續(xù)2 d 以7.5×109cfu/頭的劑量免疫仔豬，能夠在仔豬體內(nèi)同時(shí)誘導(dǎo)抗FaeG、FedF 和LT 腸毒素的高水平抗體產(chǎn)生，并且可以有效保護(hù)表達(dá)K88菌毛和LT腸毒素的ETEC 感染引起的仔豬腹瀉。但是該疫苗候選株是否對(duì)表達(dá)F18 菌毛的ETEC 感染引起的仔豬腹瀉具有同樣的保護(hù)效果還需進(jìn)一步的研究。LIU 等[16]研究表明，當(dāng)小鼠以1.0×109cfu 的劑量口服免疫表達(dá)LT192-STa13 和LT192-STb 的重組大腸桿菌ER-A和ER-B 時(shí)，在小鼠體內(nèi)能夠同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的抗LT、STa、STb和F41的抗體，并且誘導(dǎo)的抗體能夠有效阻斷小鼠感染表達(dá)相應(yīng)毒素的ETEC 菌株。但是這2株疫苗候選株對(duì)仔豬是否具有免疫保護(hù)效果，以及免疫保護(hù)效果如何還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

與注射用疫苗需要大劑量、多次免疫不同，ETEC 口服活疫苗往往只需要一次免疫即可誘發(fā)全面、穩(wěn)定、持久的黏膜免疫應(yīng)答，達(dá)到較好的免疫保護(hù)效果。更重要的是，口服疫苗可以刺激母豬腸相關(guān)淋巴組織（GALT）產(chǎn)生分泌型IgA（sIgA）抗體，該抗體可以通過母豬初乳轉(zhuǎn)移給仔豬[17]?？诜庖咭部梢杂行П苊庾⑸涿庖呓o仔豬造成的應(yīng)激反應(yīng)。但是口服活疫苗熱穩(wěn)定性相對(duì)較差，運(yùn)輸、保存條件要求較高（要求在低溫、冷暗條件下運(yùn)輸和儲(chǔ)存；通常制成凍干苗以利于保存），并且存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)和不易制備成聯(lián)苗。此外，活疫苗容易受到母源抗體干擾，免疫接種時(shí)間選擇范圍相對(duì)較窄。

3 ETEC基因工程苗

3.1 基于菌毛黏附素的工程亞單位疫苗

菌毛黏附素介導(dǎo)ETEC 菌株與仔豬腸道上皮細(xì)胞的黏附和定植是ETEC 感染的第一步，也是必不可少的一步。鑒于菌毛黏附素在ETEC 致病過程中的重要作用，很多基因工程疫苗是以菌毛黏附素亞單位作為抗原。母豬或者仔豬免疫該類疫苗后，仔豬自身可以主動(dòng)誘導(dǎo)產(chǎn)生或者通過母乳被動(dòng)獲得針對(duì)菌毛黏附素的特異性抗體，抗體可以有效阻斷表達(dá)相應(yīng)菌毛黏附素的ETEC 菌株與仔豬小腸上皮細(xì)胞的黏附，從而預(yù)防仔豬ETEC感染[18]。

表達(dá)F4 菌毛的ETEC 是引起新生仔豬腹瀉的最主要病原菌。多項(xiàng)研究表明，母豬產(chǎn)前注射接種表達(dá)F4 菌毛主要亞單位的疫苗，或飼喂表達(dá)FaeG亞單位的轉(zhuǎn)基因植物或益生菌，對(duì)新生仔豬的F4+ETEC 感 染 均 具 有 較 好 的 免 疫 保 護(hù) 效 果[19‐22]。YAHONG 等[19]報(bào)道，母豬在產(chǎn)前6 周和2 周分別免疫純化的FaeG重組蛋白，在母豬血清和初乳中有高水平的IgG 和IgA 抗體，能有效保護(hù)新生仔豬的K88ac+ETEC 感染。另有研究表明，斷奶仔豬通過口服免疫F4菌毛亞單位疫苗，在仔豬體內(nèi)能夠誘導(dǎo)針對(duì)F4+菌毛的特異性抗體，能有效預(yù)防仔豬F4+ETEC 感染引起的PWD[23]。因病原體污染的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的菌毛亞單位疫苗比用傳統(tǒng)的工程菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的菌毛亞單位疫苗更安全[22]。另外，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)亞單位疫苗成本更低，而且通過口服能有效誘導(dǎo)仔豬的黏膜免疫反應(yīng)[24]。由于適口性好，苜蓿常用來飼喂豬，也常用作轉(zhuǎn)基因植物的受體。利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)菌毛黏附素亞單位，對(duì)表達(dá)相應(yīng)菌毛黏附素的ETEC 感染具有較好的保護(hù)效果[25]。前人研究表明，斷奶仔豬飼喂表達(dá)F4菌毛黏附素主要亞單位的轉(zhuǎn)基因苜蓿能有效預(yù)防F4+ETEC 感染引起的斷奶仔豬腹瀉[20‐21]。利用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)菌毛黏附素亞單位安全性高、成本低，但是如何提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)量，如何抵抗胃酸對(duì)蛋白質(zhì)的消化作用是當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn)，這也是目前還沒有商品化轉(zhuǎn)基因植物疫苗的原因。

多表位融合抗原（Multiepitope fusion antigen，MEFA）技術(shù)是一種基于電腦生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)相結(jié)合的新型疫苗構(gòu)建技術(shù)和平臺(tái)，是將來源于不同種屬的菌株或者不同血清型菌株中和（阻斷）抗原表位，利用電腦生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)整合至一個(gè)抗原中，并最大限度地模擬抗原表位本身的免疫原性，從而有利于構(gòu)建具有廣泛保護(hù)力的新型多聯(lián)或多價(jià)疫苗[26]。DUAN等[27]利用MEFA技術(shù)，分別以F4 菌毛主要亞單位FaeG 和F18 黏附亞單位FedF作為骨架，構(gòu)建了FaeG-Fim41a-FanC-FasA 和FedF-FasA-Fim41a-FanC 2 種多表位融合抗原蛋白，將多表位融合抗原蛋白混合后通過皮下注射免疫小鼠能誘導(dǎo)產(chǎn)生同時(shí)針對(duì)F4、F5、F6、F18 和F41菌毛的特異性抗體，并且獲得的抗體在體外能有效阻斷表達(dá)相應(yīng)菌毛黏附素的ETEC 菌株對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-1 和IPEC-J2 的黏附。再進(jìn)一步將2種蛋白質(zhì)融合構(gòu)建成FaeG-FedF-FanC-FasAFim41a 多表位融合抗原蛋白，該五價(jià)候選疫苗抗原可以在小鼠體內(nèi)同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)F4、F5、F6、F18 和F41 這5 種靶向菌毛的特異性抗菌毛中和抗體，并且免疫小鼠血清樣品可以有效抑制表達(dá)這5種菌毛的ETEC 菌株對(duì)仔豬小腸上皮細(xì)胞的黏附[28]。因此，上述構(gòu)建的3 個(gè)靶向ETEC 菌毛黏附素的多表位融合抗原蛋白具有作為預(yù)防ETEC 感染引起PWD的高效、廣譜菌毛黏附素疫苗的潛力。

3.2 基于腸毒素的工程亞單位疫苗

除了菌毛黏附素外，腸毒素也是ETEC 感染過程中的重要毒力因子。因此，利用基于腸毒素為候選抗原的類毒素疫苗誘導(dǎo)針對(duì)腸毒素的中和抗體也是預(yù)防仔豬ETEC 感染的一個(gè)重要策略[29]。但是鑒于腸毒素本身強(qiáng)的細(xì)胞毒性、不同種類毒素之間缺乏交叉保護(hù)以及ST毒素本身免疫原性差等原因，一直以來基于腸毒素為抗原的疫苗研發(fā)困難重重。

腸毒素野毒雖然具有強(qiáng)的毒性，但是將與腸毒素毒性相關(guān)的某些關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)突變能使其毒性顯著降低或者無毒性，并且保留其免疫原性[30‐31]。此外，將ST 毒素與其他免疫原性強(qiáng)的蛋白質(zhì)融合表達(dá)可以增強(qiáng)ST的免疫原性，這表明研發(fā)基于ETEC 腸毒素的抗毒素疫苗是可行的[32‐33]。由于不同毒素之間的異質(zhì)性，雖然基于單一類毒素為抗原的抗毒素疫苗對(duì)表達(dá)相同毒素的ETEC 感染具有良好免疫保護(hù)效果，但是對(duì)表達(dá)異種毒素的ETEC感染無交叉保護(hù)作用。鑒于單一ETEC 菌株常能同時(shí)產(chǎn)生2 種或者多種類型腸毒素，基于單一類毒素為抗原的抗毒素疫苗的免疫保護(hù)效果往往不佳。最近研究發(fā)現(xiàn)，將與細(xì)胞毒性相關(guān)的A 亞基上的單個(gè)或者多個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)突變后，LT腸毒素的毒性顯著減弱但是保留了良好的免疫原性[34‐35]。因此，這些LT類毒素不僅可以直接作為抗原制成類毒素疫苗，還可以作為蛋白質(zhì)載體來增強(qiáng)ST毒素的免疫原性。ZHANG 等[36]以LTR192G類毒素為載體，將STa 和STb 毒素與其融合表達(dá)，研究結(jié)果表明，該融合蛋白在小鼠體內(nèi)能同時(shí)誘導(dǎo)抗LT、STa和STb 3種腸毒素的中和性抗體。FENG 等[37]利用同源重組的方法構(gòu)建了能同時(shí)表達(dá)LT、STa 和STb 3 種腸毒素的減毒重組大腸桿菌（ER-T），研究結(jié)果表明，小鼠口服該重組菌株能誘導(dǎo)3 種毒素的高水平IgG 和sIgA 抗體，抗體在體內(nèi)能中和STa 和STb 的毒性作用。此外，SEO 等[38]的研究結(jié)果也表明，將3 個(gè)拷貝的STaN12S多肽融合至LT 雙突變體（dmLT）構(gòu)建的3xSTaN12S-mnLTR192G/L211A類毒素融合蛋白免疫小鼠和仔豬，在小鼠和仔豬體內(nèi)均可誘導(dǎo)高滴度的針對(duì)STa 和LT 腸毒性的保護(hù)性中和抗體，保護(hù)仔豬免受產(chǎn)生這2 種腸毒素的ETEC 菌株感染?；诙喾N腸毒素的多價(jià)類毒素疫苗由于具有更廣泛的保護(hù)力，其免疫保護(hù)效果較基于單一腸毒素的類毒素疫苗的免疫保護(hù)效果更好。

3.3 基于菌毛黏附素和腸毒素的廣譜工程亞單位疫苗

ETEC 感染引起仔豬腹瀉需要菌毛黏附素和腸毒素的共同作用，缺一不可。因此，一種真正高效、廣譜的ETEC 疫苗應(yīng)該同時(shí)包含有菌毛黏附素和腸毒素這2 類抗原，這樣誘導(dǎo)的抗菌毛黏附素的抗體能有效阻斷ETEC 與仔豬腸道上皮細(xì)胞的黏附，而同時(shí)誘導(dǎo)的抗腸毒素的抗體能有效中和腸毒素的毒性作用，從而起到雙重保護(hù)效果[39]。目前，我國市售的基因工程疫苗有遼寧益康公司研發(fā)的仔豬大腸桿菌病基因工程滅活疫苗（GE-3 株）。該疫苗株能同時(shí)表達(dá)K88 菌毛、STa 和LT 腸毒素，以5 mL 的劑量，分別在產(chǎn)前30～35 d 和15～20 d 肌肉注射免疫妊娠母豬，對(duì)K88ac+ETEC 感染引起的仔豬腹瀉具有良好的保護(hù)效果[40]。免疫該疫苗只能對(duì)仔豬的K88ac+ETEC 菌株感染具有保護(hù)力，對(duì)其他血清型的ETEC感染無交叉保護(hù)力。

此外，ZHANG 等[41]以F4 菌毛黏附素主要亞單位FaeG為骨架，將LT腸毒素和STa腸毒素的B細(xì)胞抗原表位嵌合至FaeG 中構(gòu)建了能同時(shí)表達(dá)F4菌毛黏附素、LT 和STa 腸毒素的重組菌株。提取重組菌株表達(dá)的嵌合菌毛免疫兔子能同時(shí)誘導(dǎo)抗F4 菌毛黏附素、抗LT 和STa 毒素的抗體。在另外一項(xiàng)研究中，ZHANG 等[17]將腸毒素融合蛋白SLS（STa-LTBSTb）與F4ac 和F5 菌毛抗原混合免疫母豬，發(fā)現(xiàn)這種多價(jià)候選疫苗可以在母豬血清和初乳中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌毛黏附素和腸毒素的多種抗體，并且有效保護(hù)仔豬的F4+和F5+ETEC 感染，甚至對(duì)F41+ETEC 感染也具有較好的保護(hù)效果。此外，LU 等[42]利用MEFA 技術(shù)平臺(tái)構(gòu)建了同時(shí)包含菌毛黏附素（F4 和F18 菌毛黏附素）和腸毒素（LT、STa、STb、Stx2e）的多表位融合抗原蛋白，將該抗原蛋白免疫小鼠不僅能誘導(dǎo)阻斷表達(dá)F4菌毛和F18菌毛的ETEC菌株與仔豬腸道上皮細(xì)胞的黏附，還能誘導(dǎo)針對(duì)LT、STa、STb 和Stx2e 4 種毒素的中和抗體，表明其具有作為預(yù)防ETEC感染引起PWD的候選疫苗的潛質(zhì)。

與傳統(tǒng)疫苗相比，基因工程疫苗通常只包含病原的某一或者某些抗原成分，無核酸，因而基本無不良反應(yīng)，安全性更好。此外，其可以同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且具有容易克隆多個(gè)抗原基因研制多價(jià)苗等優(yōu)點(diǎn)。但是基因工程苗制備成本較高，免疫原性較弱，通常需要添加佐劑，是否在體內(nèi)存在基因重組的風(fēng)險(xiǎn)也有待評(píng)估。

4 ETEC疫苗研發(fā)面臨的主要挑戰(zhàn)

雖然疫苗是當(dāng)前預(yù)防ETEC 所引起仔豬腹瀉的有效手段，但是當(dāng)前安全、高效、廣譜的ETEC 疫苗研發(fā)仍然面臨諸多難以克服的挑戰(zhàn)，主要包括：（1）ETEC 表達(dá)毒力因子（黏附素和腸毒素）的異質(zhì)性要求高效的疫苗必須能同時(shí)誘導(dǎo)針對(duì)黏附素和腸毒素的特異性抗體，并且對(duì)表達(dá)不同黏附素和腸毒素的ETEC 菌株感染具有廣泛的保護(hù)力[43]。（2）由于腸毒素是ETEC 引起仔豬腹瀉的重要毒力因子，因此其必須作為疫苗的重要成分，但是LT、STa和STb野毒均具有強(qiáng)的細(xì)胞毒性，不能直接作為安全的疫苗抗原使用[44]。（3）STa和STb腸毒素為短的多肽，免疫原性差，本身直接作為抗原不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗STa 和STb 的中和抗體[33]。（4）F18 菌毛作為抗原免疫機(jī)體，不能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)F18+ETEC 感染的保護(hù)性抗體[45]。（5）斷奶仔豬的免疫時(shí)間點(diǎn)難以選擇，免疫時(shí)間過早易受到母源抗體的干擾，過遲則起不到免疫保護(hù)作用[46]。（6）口服型ETEC 疫苗需要克服胃蛋白酶和胃酸的影響，并且保證抗原能夠到達(dá)腸上皮細(xì)胞處與腸相關(guān)淋巴組織中的抗原遞呈細(xì)胞相互作用[47]。

5 小結(jié)和展望

在當(dāng)前ETEC 菌株耐藥性越來越嚴(yán)重和我國全面“禁抗”的形式下，免疫ETEC疫苗是預(yù)防ETEC感染引起的仔豬腹瀉最經(jīng)濟(jì)和可行的手段[48‐50]。鑒于引起仔豬腹瀉的ETEC 菌株血清型眾多，以及病原菌本身表達(dá)的毒力因子眾多和毒力因子異質(zhì)性的問題，廣譜、高效的ETEC 疫苗應(yīng)該是利用新技術(shù)研發(fā)的多價(jià)疫苗，而且最好是同時(shí)包含黏附素抗原和腸毒素抗原的廣譜多價(jià)菌苗。課題組前期的研究表明，基于MEFA 技術(shù)平臺(tái)構(gòu)建的多價(jià)表位疫苗對(duì)不同血清型的ETEC 菌株感染具有良好的免疫保護(hù)效果，更重要的是疫苗抗原只包括毒力因子的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位，具有更好的安全性。因此，將來可以利用該技術(shù)平臺(tái)研發(fā)新型、高效和廣譜的多價(jià)ETEC 疫苗。另外，雖然利用分子生物學(xué)手段將與毒力相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)突變后，LT 腸毒素和STa 腸毒素的毒性大大降低，但在把腸毒素作為疫苗抗原之前應(yīng)進(jìn)一步降低其毒性。