韓雨晴，薄素雪，嚴(yán)飛飛，段夢琪，強(qiáng)巴央宗，商 鵬

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏 林芝 860000）

骨骼肌的生長發(fā)育對于畜禽生長發(fā)育有著重要的影響。骨骼肌是機(jī)體重要的運(yùn)動和能量代謝組織，對于維持機(jī)體代謝平衡和穩(wěn)態(tài)起到重要作用[1]。骨骼肌是一種高度異質(zhì)的組織，主要是由骨骼肌細(xì)胞、周圍結(jié)締組織以及神經(jīng)組織構(gòu)成[2]。在哺乳動物中骨骼肌約占機(jī)體質(zhì)量的三分之一，是機(jī)體新陳代謝、運(yùn)動及調(diào)節(jié)體溫的重要組織[3]。

小白蛋白（Parvalbumin，PVALB）是一種分子質(zhì)量為0～12 ku 的球狀α-螺旋小蛋白[4]，屬于EFHand 家族，是一種鈣轉(zhuǎn)運(yùn)體/穿梭蛋白[5]，1973 年，PVALB首次從鯉魚肌肉中分離出來[4]。PVALB 蛋白主要調(diào)控肌肉松弛的過程，在大腦、骨骼肌、心肌、甲狀旁腺和腎臟中表達(dá)量顯著高于其他器官組織[6‐7]。EF-Hand 家族蛋白質(zhì)的特征是具有保守的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)單元，該類蛋白質(zhì)由Ca2+螯合環(huán)橋接的α-螺旋組成[8]。EF-Hand家族蛋白質(zhì)參與許多關(guān)鍵細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)，包括基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)磷酸化、核苷酸代謝和離子轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。而PVALB 存在于快速收縮和快速松弛的骨骼肌纖維中，并且與兩棲動物和魚類的肌肉松弛速度呈正相關(guān)[10‐11]。AYUSO等[12]采用Transcriptome 技術(shù)對純種伊比利亞豬和杜洛克雜交豬（IBDU）進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，發(fā)現(xiàn)PVALB基因與豬的骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)，并對豬生長性狀產(chǎn)生明顯影響。

藏豬是中國高原地區(qū)特有的小型地方品種，耐低氧，抗高寒，遺傳多樣性豐富，肉質(zhì)風(fēng)味獨(dú)特[13]；而大約克豬是著名的瘦肉型豬種，具有生長速度快、飼料利用率高和瘦肉率高等特點(diǎn)[14]。鑒于此，對藏豬和大約克豬的PVALB基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）及組織表達(dá)差異分析，探究PVALB基因?qū)Σ刎i肌肉組織生長發(fā)育的影響，旨在為藏豬的分子育種研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

采集西藏農(nóng)牧學(xué)院實習(xí)牧場[西藏林芝地區(qū)（海拔約2 900 m）]飼養(yǎng)的180 日齡藏豬（TP）和林芝宇高生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司養(yǎng)殖基地[西藏林芝地區(qū)（海拔約2 900 m）]飼養(yǎng)的180 日齡大約克豬（YP）耳組織進(jìn)行基因組DNA 的提取。共采集66 份（藏豬36 頭，大約克豬30 頭）耳組織樣品，放入裝有75%乙醇的離心管中，于-20 ℃冰箱保存。選取同期飼養(yǎng)至30 日齡、90 日齡及180 日齡且生長情況相近的藏豬、大約克豬各8頭進(jìn)行屠宰，分別取其腿肌和背最長肌組織，剪黃豆大小放入裝有RNA 保存液的凍存管中，置于液氮中快速冷凍，用于組織總RNA 的提取。

1.2 DNA、RNA的提取以及cDNA制備

豬耳組織樣品用苯酚氯仿抽提法提取總DNA，提取完成后使用RNase-Free ddH2O 溶解，再使用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000 分光光度計檢測DNA 質(zhì)量和濃度，將可用于后續(xù)試驗的DNA于-20 ℃保存。

腿肌及背最長肌組織用RNAiso Plus 試劑法提取組織RNA，提取完成后用RNase-Free ddH2O 溶解，再使用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000分光光度計檢測RNA 質(zhì)量和濃度，所提取好的RNA于-80 ℃保存。

cDNA 制備根據(jù)快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒（KR180123）說明書進(jìn)行。gDNA 去除反應(yīng)體系：5×gDNA Buffer 2 μL，總RNA 根據(jù)比例計算出用量，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。反轉(zhuǎn)錄體系：上述gDNA 去除及應(yīng)體 系10 μL、10×Fast RT Buffer 2μL、RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer Mix 2μL，RNase-Free ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SNP篩選引物設(shè)計與合成

登錄GenBank 網(wǎng)站（htttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank），下載豬PVALB基因（登錄號：NC_010447.5）起始密碼子上游2 000 bp 區(qū)域的DNA 序列，采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計5′UTR 的引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，于4 ℃保存。

表1 PVALB基因5′UTR SNP篩選引物信息Tab.1 The primer information for SNP screening of PVALB gene 5′UTR

1.4 PVALB基因PCR擴(kuò)增

以提取的藏豬和大約克豬耳組織DNA 為模板，擴(kuò)增PVALB基因的5′UTR 區(qū)域。PCR 反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix Ⅱ10 μL、RNase-Free ddH2O 8μL、上/下游引物0.5μL、DNA 模板1μL，共20μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，59.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行38 個循環(huán)；72 ℃延伸4 min，4 ℃保存。

最后將PCR 產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，經(jīng)檢驗合格后的PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5 SNP基因頻率、基因型頻率與轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

混池測序分析基因的單核苷酸多態(tài)性，篩選出SNP 突變位點(diǎn)后，根據(jù)篩選的突變位點(diǎn)擴(kuò)大個體進(jìn)行個體測序。使用Excel 分別計算各個SNP 位點(diǎn)的基因型頻率以及等位基因頻率。用JASPAR 在線網(wǎng)站（htttp://jaspar.binf.ku.dk/）進(jìn)行SNP 位點(diǎn)突變前后轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）引物設(shè)計與合成

登錄GenBank 網(wǎng)站（htttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）下載豬PVALB基因的mRNA 序列，選用β-actin作為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物（表2），由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物合成后用RNase-Free ddH2O 溶解，于4 ℃保存。

表2 PVALB基因?qū)崟r熒光定量PCR引物信息Tab.2 The primer information for real?time fluorescence quantitative PCR of PVALB gene

1.7 實時熒光定量PCR檢測

選取檢驗合格的PVALB基因cDNA 為模板，選取β-actin基因為內(nèi)參基因，每個個體樣品各設(shè)置3個重復(fù)。采用20 μL 的反應(yīng)體系對PVALB和β-actin進(jìn)行實時熒光定量PCR 擴(kuò)增。采用Livak 法計算PVALB基因在組織中的相對表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 軟件計算各個突變位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率，使用卡方檢驗對PVALB基因的基因型頻率和基因頻率進(jìn)行差異顯著性分析；利用Sigma plot 軟件對PVALB基因相對表達(dá)量進(jìn)行雙因素（品種和組織）分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差作圖，并利用SPSS 25.0 軟件對PVALB基因表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏豬和大約克豬PVALB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

提取藏豬和大約克豬的DNA、RNA 條帶清晰，無雜帶、拖尾情況，同時無蛋白質(zhì)污染，使用Nano Drop 2000 檢測DNA、RNA 質(zhì)量，OD260/280和OD260/230值均在1.8～2.0，可滿足后續(xù)要求。以提取的DNA為模板進(jìn)行PVALB基因的5′UTR 擴(kuò)增，可見清晰的目的條帶，大小為840 bp（圖1），與目的條帶大小相符。

圖1 藏豬和大約克豬PVALB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of PVALB gene fromTibetan and Yorkshire pigs

2.2 藏豬和大約克豬PVALB基因SNP篩選與轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

通過測序比對（圖2），發(fā)現(xiàn)PVALB基因5′UTR共有2個突變位點(diǎn)，分別標(biāo)記為G1659C、C1269T。

圖2 藏豬和大約克豬PVALB基因SNP篩選Fig.2 SNP screening of PVALB gene in Tibetan and Yorkshire pigs

基因型頻率、基因頻率及卡方檢驗結(jié)果如表3所示。在藏豬中，突變位點(diǎn)G1659C 存在GG、GC、CC 型，C 基因為優(yōu)勢等位基因；在大約克豬中存在GG、GC、CC 型，G 基因為優(yōu)勢等位基因。在突變位點(diǎn)C1269T 中，藏豬和大約克豬均存在CC、CT、TT型，C基因為優(yōu)勢等位基因。

表3 藏豬和大約克豬PVALB基因SNP位點(diǎn)基因型頻率及卡方檢驗Tab.3 Genotypic frequency and chi?square test of SNP locus of PVALB gene in Tibetan and Yorkshire pigs

PVALB基因2 個突變位點(diǎn)（G1659C 和C1269T）均符合哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡（P? 0.05）。在藏豬和大約克豬中，G1659C（χ2=6.667，P=0.0357）和C1269T（χ2=7.862，P=0.020）突變位點(diǎn)均存在顯著差異（P?0.05）。

本試驗對PVALB基因的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，PVALB基因G1659C 位點(diǎn)突變后NRF2 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失，并出現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄因子NR1D1結(jié)合位點(diǎn)。C1269T 位點(diǎn)突變后NCOR1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)消失并出現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄因子OTX2結(jié)合位點(diǎn)。

2.3 藏豬和大約克豬PVALB基因在不同肌肉組織中的相對表達(dá)量

利用實時熒光定量PCR 技術(shù)對PVALB基因在藏豬和大約克豬腿肌、背最長肌中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3 所示。從圖3 可以看出，在腿肌中90 日齡時PVALB基因表達(dá)量最高，30、180 日齡次之；在背最長肌組織中180 日齡時PVALB基因表達(dá)量最高，30、90日齡次之。在腿肌和背最長肌這2個組織中，PVALB基因的表達(dá)量大約克豬顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于藏豬。

圖3 藏豬和大約克豬PVALB基因在腿?。╝）和背最長肌（b）中的表達(dá)量Fig.3 Expression levels of PVALB gene of Tibetan and Yorkshire pigs in leg muscle（a）and longissimus dorsi muscle（b）

3 結(jié)論與討論

PVALB 是肌肉組織生長發(fā)育、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝平衡的重要蛋白質(zhì)，是關(guān)鍵細(xì)胞過程的重要成分[15]。LIAN 等[16]研究結(jié)果表明，Ca2+通過決定鈣蛋白酶活性在肌肉生長中起關(guān)鍵作用，并通過減少Ca2+與原肌球蛋白-肌鈣蛋白復(fù)合物的結(jié)合來促進(jìn)肌肉的生長發(fā)育。本研究在PVALB基因起始密碼子上游2 000 bp 區(qū)域中發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)G1659C 和C1269T，2個突變位點(diǎn)基因型頻率和基因頻率在藏豬和大約克豬中存在顯著差異。通過對2 個突變位點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)新增的轉(zhuǎn)錄因子大多與組織代謝、生長發(fā)育、細(xì)胞分化密切相關(guān)，如轉(zhuǎn)錄因子NR1D1 是核受體超家族中的一員，該基因在哺乳動物的骨骼肌、大腦和肝中表達(dá)，參與肌肉生長和細(xì)胞分化等生理過程[17‐19]；轉(zhuǎn)錄因子OTX2是一種含有同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程，在YUE 等[20]的研究中，利用RNA-seq 技術(shù)證實OTX2 調(diào)控豬胚胎肌肉生長發(fā)育過程。綜上，G1659C 和C1269T 位點(diǎn)可能與豬肌肉的生長發(fā)育相關(guān)。

本研究通過對藏豬和大約克豬的背最長肌和腿肌進(jìn)行實時熒光定量PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)PVALB基因在90 日齡腿肌中的表達(dá)量最高，PVALB基因mRNA表達(dá)量在藏豬和大約克豬中均位于最高水平，該時間節(jié)點(diǎn)屬于豬的快速生長階段，說明PVALB基因在促進(jìn)豬肌肉快速生長發(fā)育中起到重要作用；在背最長肌中，PVALB基因表達(dá)量在整個生長發(fā)育階段中處于上升趨勢，與機(jī)體生長發(fā)育規(guī)律趨勢一致，且在180 日齡處于最高水平，說明PVALB基因?qū)Σ刎i和大約克豬肌肉生長發(fā)育具有正調(diào)控作用。且有研究顯示，禁食30 d 處理后，魚肌肉中PVALB基因的表達(dá)量降低，表明該基因與肌肉的生長發(fā)育呈正相關(guān)[21]。由此推測PVALB基因為豬生長發(fā)育關(guān)鍵上調(diào)基因。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)PVALB基因5′UTR 區(qū)域存在2 個SNP 位點(diǎn)G1659C 和C1269T，該位點(diǎn)突變前后消失和新增的轉(zhuǎn)錄因子均與肌肉生長發(fā)育相關(guān)，PVALB基因在不同日齡大約克豬背最長肌和腿肌中mRNA 相對表達(dá)量均顯著或極顯著高于藏豬，結(jié)合SNP結(jié)果和RT-qPCR 結(jié)果推測，PVALB基因有促進(jìn)豬肌肉生長發(fā)育的功能，可作為骨骼肌早期發(fā)育和肉質(zhì)性狀研究新的候選基因，為后續(xù)闡明其在豬生長發(fā)育中的分子作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。