李 楊，康俊港，馬占飛，王亞博，趙博偉，姜國均

（1.河北農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，河北 保定 071000；2.河北省畜牧總站，河北 石家莊 050033）

蚯蚓在醫(yī)藥、魚餌和飼料等方面具有較高價值，又因其養(yǎng)殖方法簡單，飼養(yǎng)原料低廉，促使蚯蚓養(yǎng)殖成為農(nóng)民致富增收的重要途徑[1]。蚯蚓在有機殘體轉(zhuǎn)化和土壤養(yǎng)分循環(huán)中起著重要的作用[2]。蚯蚓作為生態(tài)系統(tǒng)中的一環(huán)，不僅通過自身強大的免疫功能適應環(huán)境，分泌免疫因子直接作用于環(huán)境中的污染物及致病微生物，更是通過吞食排泄等生理行為整合調(diào)節(jié)環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)，提高生態(tài)環(huán)境功能的多樣性，從而增強環(huán)境自身抗污染風險的能力[3]。

根據(jù)《2022 年中國牛奶行業(yè)的產(chǎn)業(yè)鏈分析及未來發(fā)展趨勢預測報告》[4]，我國奶牛存欄達到1 233.5萬頭。1 頭牛的排泄物大概有20 kg/d 之多，牛糞日排泄量高達約25萬t，大量牛糞堆積造成環(huán)境污染。中藥渣是中藥產(chǎn)業(yè)化過程中產(chǎn)生的固體廢棄物[5]，中藥加工過程產(chǎn)生藥渣固體廢棄物每年可高達5 500 余萬t[5]，但是目前對中藥渣的利用還很不充分，大多數(shù)被作為垃圾處理，不僅污染環(huán)境，還造成了資源的浪費[6‐7]。實現(xiàn)中藥渣變廢為寶，在保護環(huán)境、節(jié)約資源和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展等方面具有重要意義，將中藥渣開發(fā)成動物飼料，不僅可以增強動物的免疫功能、減少抗生素的使用，而且可以促進動物生長[8]。五味健脾顆粒（由白術、黨參、山藥、神曲和甘草五味中藥組成）具有預防仔豬斷奶腹瀉、提高仔豬日平均增質(zhì)量等作用[9]。赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）采食性非常廣泛、繁殖率較高、適應性極強，在禽畜糞便處理中脫穎而出[10]。鑒于此，為解決畜禽糞污和藥渣對環(huán)境污染的問題，探索中藥渣和牛糞資源化利用的新途徑，以發(fā)酵牛糞和五味健脾顆粒藥渣飼喂蚯蚓，研究其對蚯蚓生長性能、蛋白酶、纖維素酶和磷酸酶活性的影響，旨在為生產(chǎn)中利用蚯蚓處理中藥渣和牛糞提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試動物 體質(zhì)健康的赤子愛勝蚓后期幼蚓（若蚓），體質(zhì)量150～250 mg，購自河北省石家莊市鑫伊達蚯蚓養(yǎng)殖場，普通泥中暫養(yǎng)10 d，待其適應環(huán)境后，進行堆肥處理試驗。

1.1.2 供試藥渣、發(fā)酵牛糞及主要試劑 五味健脾顆粒藥渣由保定冀中藥業(yè)有限公司提供；發(fā)酵牛糞由河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院內(nèi)科實驗室提供；蛋白酶活性、纖維素酶活性和磷酸酶活性檢測試劑盒由江蘇酶免實業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組及處理 將試驗隨機分成A、B、C和D 組，在發(fā)酵牛糞的基礎上，每組分別添加0（對照）、10%、20%、30%的五味健脾顆粒藥渣，每組3個重復，每盆飼料總質(zhì)量均為3 000 g，在盆內(nèi)鋪成長48 cm、寬32 cm、厚度4～5 cm的蚯蚓養(yǎng)殖床，將蚯蚓種投放至蚯蚓床時，需將蚯蚓分散投放，若蚓密度為1 kg/m2，室外養(yǎng)殖28 d。每2 d 檢查1 次，定期灑水以保證養(yǎng)殖床濕度在60%～70%。每隔7 d將盆內(nèi)物料和蚯蚓全部倒出，使養(yǎng)殖床透氣，同時進行取樣和生長性能指標的測定。

1.2.2 生長性能指標測定 取樣時將盆中的物料和蚯蚓全部倒出，平鋪并均分為三部分，每部分取蚯蚓1 條，每組共取9 條蚯蚓，將取出蚯蚓置于塑料布上10～20 min，除去蚯蚓身上的泥土，稱體質(zhì)量，并計算蚯蚓試驗前平均體質(zhì)量、體長，試驗末平均體質(zhì)量、體長、增重率和死亡率。

試驗初均體質(zhì)量=9條蚯蚓總質(zhì)量/9；

試驗末均體質(zhì)量=盆內(nèi)剩余蚯蚓總條數(shù)質(zhì)量/蚯蚓總條數(shù)；

試驗初體長=9條蚯蚓總長度/9；

試驗末體長=盆內(nèi)剩余蚯蚓總條數(shù)長度/蚯蚓總條數(shù)；

增重率=[（末均體質(zhì)量-初均體質(zhì)量）/初均體質(zhì)量]×100%。

1.2.3 消化酶活性測定 分別在培養(yǎng)0、7、14、21、28 d，從每個重復中隨機取出3 條蚯蚓，蒸餾水洗去污漬，濾紙吸干水分后于試管中剪碎，用0.9%氯化鈉溶液沖洗，按1∶9 加入50 mL 0.01 mol/L Tris-HCl緩沖溶液，組織勻漿機勻漿，勻漿液放入離心機中，設置條件為4 ℃、1 000×g離心20 min，取上清液即為蚯蚓粗酶液。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定蛋白酶、纖維素酶和磷酸酶活性，操作方法參照試劑盒說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件中單因素方差分析（One-way ANOVA）程序進行分析，使用Origin 7.5作圖軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對蚯蚓生長性能的影響

飼養(yǎng)28 d時，與A 組相比，B、C 和D 組末均體質(zhì)量和末體長均有增長，其中C 組末均體質(zhì)量顯著高于A 組（P<0.05），C 組末體長顯著大于A 組（P<0.05）。C組的末均體質(zhì)量達415.94 mg，其增重率為75.49%，較A 組提高55.50 個百分點；C 組末體長8.06 cm，較A 組末體長增加1.83 cm（表1）。可見，五味健脾顆粒藥渣對蚯蚓生長發(fā)育有一定的促進作用，藥渣添加比例為20%時生長性能達到最佳。

表1 不同處理對蚯蚓生長性能的影響Tab.1 Effect of different treatments on the growth performance of earthworms

2.2 不同處理對蚯蚓蛋白酶活性的影響

從圖1可以看出，隨著飼養(yǎng)時間的增長，不同處理組蛋白酶活性均呈上升趨勢。飼養(yǎng)28 d 時，C 組顯著高于A、D 組（P<0.05），B、C 組相近（P>0.05），C組的活性為10.34 U/g，是A 組活性8.03 U/g 的1.29倍?？梢姡逦督∑㈩w粒藥渣提高了蚯蚓蛋白酶活性，飼養(yǎng)28 d時C組蛋白酶活性達到最高。

圖1 不同處理對蚯蚓蛋白酶活性的影響Fig.1 Effect of different treatments on protease activity of earthworms

2.3 不同處理對蚯蚓纖維素酶活性的影響

從圖2可以看出，隨著飼養(yǎng)時間的增長，各處理組纖維素酶活性均呈上升趨勢。飼養(yǎng)28 d 時，C 組纖維素酶活性顯著高于A、B 組（P<0.05），C 組活性為2.76 IU/g，而A 組活性為2.27 IU/g，C 組是A 組的1.22 倍。五味健脾顆粒藥渣增加了蚯蚓纖維素酶活性，前7 d，D 組蛋白酶活性最高；之后14～28 d，C組纖維素酶活性最高。

圖2 不同處理對蚯蚓纖維素酶活性的影響Fig.2 Effect of different treatments on cellulase activity of earthworms

2.4 不同處理對蚯蚓磷酸酶活性的影響

從圖3可以看出，隨著飼養(yǎng)時間的增長，磷酸酶活性呈現(xiàn)小幅度增長。飼養(yǎng)7、14 d 時，C 組磷酸酶活性顯著高于對照組及其他處理組（P<0.05）；飼養(yǎng)21 d 時，B、C 組磷酸酶活性顯著高于A、D 兩組（P<0.05）；飼養(yǎng)28 d 時，C、D 組磷酸酶活性顯著高于A組（P<0.05）。五味健脾顆粒藥渣增加了蚯蚓的磷酸酶活性，且C 組磷酸酶活性在各個時期均高于其他處理組，飼養(yǎng)28 d時其活性達到最大值。

圖3 不同處理對蚯蚓磷酸酶活性的影響Fig.3 Effect of different treatments on phosphatase activity of earthworms

3 結(jié)論與討論

3.1 五味健脾顆粒藥渣的添加對蚯蚓生長性能的影響

中草藥含有多種天然營養(yǎng)成分，其中有能促進動物機體代謝、增加營養(yǎng)物質(zhì)吸收的成分存在，起到促進動物生長等作用[11‐14]。五味健脾顆粒由白術、黨參、山藥、神曲和甘草組成。方中白術為君藥，健脾益氣，燥濕利水；黨參補中益氣，生津和胃；山藥為臣藥，補中益氣，固腎益肺；神曲健脾和胃，提高消化能力；甘草補脾益氣，調(diào)和諸藥[9]。忻富寧[15]研究發(fā)現(xiàn)，五味健脾顆?？梢杂行Т龠M脾虛仔豬和健康仔豬的生長發(fā)育，提高飼料利用率，降低料重比。本研究中，與未添加五味健脾顆粒藥渣組相比，添加比例為20%時，蚯蚓體質(zhì)量和體長顯著增加，其增重率提高55.50 個百分點、體長增加1.83 cm?？梢?，五味健脾顆粒藥渣具有促進蚯蚓生長性能的作用。

3.2 五味健脾顆粒藥渣的添加對蚯蚓消化酶活性的影響

蚯蚓體內(nèi)的消化酶主要包括蛋白酶、纖維素酶和磷酸酶等[16‐18]，它是反映其消化機能的重要指標，直接關系到蚯蚓對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。本研究中，隨著養(yǎng)殖時間的增加，在飼養(yǎng)28 d 時，蚯蚓的蛋白酶、纖維素酶和磷酸酶活性較高，成體的蚯蚓蛋白酶、纖維素酶和磷酸酶活性均高于幼體，說明養(yǎng)殖時間長的蚯蚓對蛋白質(zhì)類和纖維類食物消化能力比幼體強。這與蘇志星等[19]、張正榮等[20]研究中消化酶活性隨著仔稚魚的生長發(fā)育發(fā)生顯著變化的結(jié)果一致。中藥渣經(jīng)發(fā)酵后得到富含多糖和蛋白質(zhì)的功能性飼料[20]。五味健脾顆粒藥渣能提高蚯蚓體內(nèi)的蛋白酶活性，也可能與五味健脾顆粒藥渣能促進消化道蠕動、促進消化道胃蛋白酶的分泌等作用有關。試驗結(jié)果表明，飼養(yǎng)28 d 時，添加20%五味健脾顆粒藥渣組蚯蚓的蛋白酶活性達到最高，對于延長養(yǎng)殖飼養(yǎng)時間，是否能繼續(xù)升高蛋白酶活性，提高養(yǎng)殖效果，有待進一步探討。

蚯蚓對纖維素的消化能力直接反映蚯蚓的消化能力[21]。中藥渣中含有豐富的纖維素[22]，赤子愛勝蚓是表居型蚯蚓，生活和取食于地表的枯枝落葉層，主要以植物殘落物為食，其腸道內(nèi)較高的纖維素酶活性，能使其有效地利用主要構(gòu)成成分為纖維素的植物殘體[3]。中藥渣中也含有大量的粗纖維，其粗纖維含量在11.82%～44.86%，可以作為飼料添加劑來適當提高日糧中的纖維水平，從而來刺激蚯蚓胃腸道蠕動、分泌消化液[23]。本研究中，28 d 時，添加20%五味健脾顆粒藥渣組蚯蚓的纖維素酶活性達到最高值。這可能是因為五味健脾顆粒藥渣可以調(diào)節(jié)腸道菌群，隨著養(yǎng)殖時間的增加，影響蚯蚓腸道微生物的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的產(chǎn)量，進而影響腸道pH 值，使蚯蚓形成適宜的腸道環(huán)境，消化酶活性升高。這與馬麗娜[24]在基質(zhì)中接種蚯蚓能使纖維素酶活性大幅提高的研究結(jié)果相似。五味健脾顆粒具有健脾益氣、開胃消食之功效[25]。在已發(fā)酵牛糞的基礎上加入五味健脾顆粒藥渣后，促進了蚯蚓的進食。推測蚯蚓消化組織器官的消化功能不斷發(fā)育完善，飼喂五味健脾顆粒藥渣加強了蚯蚓對飼料的消化吸收[26]。

綜上所述，在發(fā)酵牛糞中添加20%的五味健脾顆粒藥渣對蚯蚓生長發(fā)育有促進作用，能夠提高蚯蚓消化酶的活性。