孟彤彤，崔興帥，朱 寧，冷非凡，王永剛*，陳吉祥1, *

不同生長年限黨參根系微生物群落結構和多樣性研究

孟彤彤1, 3，崔興帥2，朱 寧2，冷非凡2，王永剛2*，陳吉祥1, 2*

1. 蘭州理工大學能源與動力工程學院，甘肅 蘭州 730050 2. 蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050 3. 甘肅省水利科學研究院，甘肅 蘭州 730050

探究不同生長年限黨參根系微生物群落結構變化及其與土壤環(huán)境因子的相關性，以提高黨參品質(zhì)。對一、二、三年生黨參土壤、根際土壤和根進行高通量測序和生物信息學分析。隨黨參生長年限的增加，土壤和根際土壤中優(yōu)勢細菌處于動態(tài)平衡，而根內(nèi)細菌豐度減少。真菌在土壤和根際土壤中豐度逐年降低，病原真菌在黨參根系中豐度逐年增加。不同生長年限的黨參根系微生物群落組裝更多的受隨機性過程影響，且根系細菌的群落功能穩(wěn)定性高于真菌。蛋白酶（protease，PRO）、全氮（total nitrogen，TN）、速效鉀（available potassium，AK）、水分（water content，WC）、速效磷（available phosphorus，AP）和土壤有機質(zhì)（soil organic matter，SOM）是影響不同生長年限黨參根系細菌群落結構和多樣性的主要影響因素，TN和全鉀（TK）是影響真菌群落結構和多樣性的主要影響因素。黨參根系微生物群落組成和多樣性隨生長年限改變，并對不同土壤環(huán)境因子作出差異化響應，該研究為后期深入研究黨參病害防治，提高黨參品質(zhì)提供理論基礎。

黨參；高通量測序；環(huán)境因子；根系；微生物多樣性

黨參(Franch.) Nannf.屬于桔?？浦参铮涓稍锔鳛橹袊鴤鹘y(tǒng)補益藥，富含甾醇、多糖、炔苷、生物堿等活性成分[1-2]。中國藥典中記載，黨參具有健脾、潤肺、養(yǎng)血、生液、增強免疫等功效[3]。黨參在我國種植廣泛，而甘肅省是中國最大的黨參種植基地，栽培面積占全國種植總面積的90%以上[4]。

植物根系包含根內(nèi)、根平面、根際和土壤，土壤中蘊含豐富多樣的微生物，對生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用[5-8]。根際作為地球上物質(zhì)和能量循環(huán)、信息交換最活躍的界面之一，也是植物-微生物-土壤相互作用的一個復雜場所[9]。根際微生物系統(tǒng)可以調(diào)整植物菌群結構，增強植物抵抗力和提高特殊環(huán)境脅迫下的耐受性[10]，同時根際土壤微生物也是衡量土壤肥力和養(yǎng)分的重要指標[11]。藥用植物產(chǎn)生的黃酮、萜類等次級代謝產(chǎn)物的積累，因種植地點、季節(jié)和植物基因型而異，這些因素也會影響定殖于宿主體內(nèi)微生物的分布[5]。在植物生長過程中，這些代謝產(chǎn)物很容易被釋放到土壤中，引起土壤理化性質(zhì)的改變，最終導致根系微生物群落的變化[12]。冼康華等[13]對3、5、7、9年生華重樓根際微生物和土壤理化因子進行的研究結果表明，隨著華重樓生長年限的增加，根際微生物多樣性先升高后降低，速效鉀和全氮是影響根際細菌群落組成的主要因素，總鉀是影響根際真菌群落組成的重要因子。李勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)不同生長年限的西洋參根際土和非根際土中的微生物群落結構存在顯著差異，不同土壤樣品的微生物群落結構表現(xiàn)一定的根際效應。國內(nèi)外研究表明，土壤養(yǎng)分丟失、微生物菌群結構發(fā)生變化[15,16-22]等為植物連作障礙的主要原因。綜上研究所述，探究在不同生長年限藥用植物生長發(fā)育對根系微生物群落多樣性的影響，對了解藥用植物根系狀態(tài)、促進植株生長、防止土傳病蟲害及提高藥材品質(zhì)等有極其重要的意義。

近年來黨參根系微生物研究多集中在連作障礙[23]、緩解根腐病[24]等方面，而不同發(fā)育時期的黨參與根系微生物群落多樣性變化的研究較少，微生物群落結構變化與黨參生長年限的關系仍不清楚。因此，本研究利用Illumina MiSeq的高通量測序技術，對不同生長年限黨參土壤、根際土壤和根細菌16S rRNA和真菌ITS序列進行測序，研究不同生長年限的栽培黨參根系微生物群落結構組成和多樣性，探討黨參生長發(fā)育對定殖微生物群落結構變化的影響，為后續(xù)深入研究黨參活性成分積累調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

供試黨參根際土壤和根來自甘肅省定西市岷縣中藥種植基地（104°14′40″E，35°10′12″N），植物樣本經(jīng)蘭州理工大學生命科學與工程學院制藥工程專業(yè)楊林副教授鑒定為桔?？浦参稂h參(Franch.) Nannf.，品種為“白條”。不同年限黨參主要通過種苗移栽的方式種植。

1.2 儀器

DYCP-32C型瓊脂糖水平電泳儀（北京市六一儀器廠）；Covaris超聲波破碎儀（Covaris S2 System Massachusetts，美國）；Qubit Fluorometric Quantification（Qubit 2.0，Thermo Scientific，美國）；Agilent 5400生物分析儀（Agilent Technologies有限公司，USA）T100 PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；Novaseq 6000測序儀（Illumina，San Diego，CA，美國）。

2 方法

2.1 樣品處理

2021年8月中旬，在甘肅省定西市岷縣中藥種植基地分別采集一年生、二年生和三年生黨參根際土壤和藥用部位根。采樣時，每個樣地隨機選取6個樣方（5 m×5 m），每個樣方隨機設置3個重復，則共采集黨參土壤18×3份，根際土壤18×3份，根18×3份。先采用抖落法收集與根系結合松散的土壤，作為非根際土壤，再收集與根系表面粘附性較強的土壤作為根際土壤（距離根部2.5 mm），最后收集根[25]。土壤樣品裝入無菌密封袋，冰袋保存迅速送回實驗室。隨機將每2個樣方內(nèi)的土壤混合作為土壤樣本的一個重復；將每個樣方內(nèi)的根際土壤混合，作為根際土壤樣本的一個重復；將每個樣方內(nèi)的根混合，作為根樣本的一個重復。3個處理（SF、SS、SR），共得到18組樣品，分別標記為SF1、SF2、SF3、SS1、SS2、SS3、SR1、SR2、SR3。SF1、SF2、SF3分別表示一、二、三年生黨參土壤；SS1、SS2、SS3分別表示一、二、三年生黨參根際土壤；SR1、SR2、SR3分別表示一、二、三年生黨參根。所有樣品平均分成2份，一份保藏于?80 ℃用于高通量測序，一份保藏于?20 ℃用于理化性質(zhì)測定。

采集的黨參根部，分別用毛刷去除表面土壤，自來水沖洗干凈，利用0.1%次氯酸鈉表面消毒10 min，再用75%乙醇，消毒5 min，最后用無菌水沖洗干凈，無菌濾紙吸干表面水分，最后一次清洗水用于菌落檢查，將確定表面消毒徹底的根部保存在預先滅菌的離心管中，液氮速凍，置于?20 ℃冰箱中，用于后續(xù)的內(nèi)生菌群落結構分析。

2.2 土壤理化性質(zhì)測定

土壤理化性質(zhì)測定參考《土壤農(nóng)化分析》[26]。土壤有機質(zhì)（SOM）含量測定采用重鉻酸鹽濕法燃燒法；全氮（TN）測定采用凱氏定氮法；速效氮（AN）測定采用堿擴散法；全磷（TP）含量測定采用鉬酸銨比色法；速效磷（AP）含量測定采用碳酸氫鈉浸提-火焰分光光度法。全鉀（TK）含量測定采用氫氧化鈉熔融-火焰分光光度法[27]。速效鉀（AK）含量采用醋酸銨浸提-鉬銻抗比色法[28]。土壤含水率（MC）采用常規(guī)烘干恒重法測定[29]。

2.3 土壤微生物活性測定

土壤微生物生物量氮（MBN）和微生物生物量碳（MBC）采用氯仿熏蒸浸提法測定[30-33]。

2.4 土壤酶活性測定

土壤酶活性測定參考《土壤酶及其研究法》[32]。硝酸還原酶（nitrate reductase，NiRs）采用苯酚二磺酸比色法測定，纖維素酶（cellulase，CE）和蔗糖酶（sucrase，SUC）采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定，過氧化氫酶（catalase，CAT）采用高錳酸鉀滴定法測定，土壤磷酸酶（soil phosphatase，PHP）采用磷酸苯二鈉比色法測定，亞硝酸還原酶（nitrite reductase，NR）采用微量法測定，土壤蛋白酶（soil protease，PRO）采用茚三酮比色法測定。

2.5 DNA提取與PCR擴增

從根部和土壤中提取總DNA。根樣本的16S用799F（5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’）和1193R（5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’）引物對V5-V7可變區(qū)進行PCR擴增，土壤和根際土壤樣本的16S用341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）引物對V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增，所有樣本的ITS用ITS1-1F-F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAA- GTAA-3’）和ITS1-1F-R（5’-GCTGCGTTCTT- CATCGATGC-3’）引物對ITS1-1F可變區(qū)進行PCR擴增。擴增程序為：在98 ℃預變性1 min后，運行30個循環(huán)，包括在98 ℃下孵育10 s，50 ℃下孵育30 s，在72 ℃時延長30 s，然后在72 ℃時延長5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳法純化回收。

2.6 文庫構建與測序

根據(jù)Illumina MiSeq平臺（Illumina，San Diego，美國）標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建文庫。構建文庫步驟如下：（1）連接“Y”字形接頭；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴增進行文庫模板的富集；（4）氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE250平臺進行測序。運用QIIME2 feature-classifier插件將ASV的代表序列比對到預先訓練好的13.8版本99%相似度的GREENGENES數(shù)據(jù)庫（16S rRNA）（根據(jù)引物對將數(shù)據(jù)庫分別聚集到V3V4和V4V5的區(qū)域）和8.2版本的UNITE數(shù)據(jù)庫（ITS）（根據(jù)引物對將數(shù)據(jù)庫分別聚集到ITS1、ITS3的區(qū)域），得到了物種的分類信息表[34]。之后用QIIME2 feature-table插件剔除了所有污染性的線粒體和葉綠體序列。

2.7 生物信息學分析

使用Qiime 2.0計算分析到物種的Chao1、Shannon、Simpson和Observed feature指數(shù)值，使用ANOVA分析α多樣性指數(shù)的組間差異?；赗的“Phyloseq”包進行主坐標分析（principal coordinates analysis，PCoA）分析，以可視化不同組之間樣本關系。Mantel test基于R的“vegan”包分析土壤養(yǎng)分與物種多樣性之間關系。應用中性群落模型來評估細菌和真菌群落的組裝過程，中性群落模型用于通過預測微生物群落組裝的頻率之間的關系來確定隨機過程對微生物群落組裝的貢獻[35]。去除樣本發(fā)現(xiàn)率低于20%的物種，構建共生網(wǎng)絡，選取豐度＞10%的模塊進行標記，并展示其top10門水平物種豐度，使用R的“vegan”“psych”和“igraph”包完成上述內(nèi)容。冗余分析（redundancy analysis，RDA）使用深圳微科盟云平臺繪制（https://www. bioincloud.tech）。

2.8 統(tǒng)計分析

3 結果與分析

3.1 不同生長年限黨參土壤理化性質(zhì)的變化

對不同生長年限黨參土壤和根際土壤的理化性質(zhì)進行測定和分析（表1），結果顯示測得的土壤理化因子中除SOM外，其余理化因子含量在各樣本中組間差異顯著（＜0.05）。不同生長年限的黨參根際土壤和土壤中TN含量組間差異顯著（＝5.293，＜0.01），根際土壤中的TN含量逐年增加，而土壤中SF2的TN含量最高。土壤中的TP含量、MC隨黨參種植年限的增加逐漸提高，而根際土壤中的相應含量與之相反。不同生長年限黨參的土壤、根際土壤都呈弱堿性（pH 7.7～8.0）。MBN在一年生黨參的土壤和根際土壤中含量最高，而在二年生、三年生黨參相應土壤中含量顯著降低，且隨種植時間的增加，含量逐漸降低。各土壤酶活性，僅NiRs表現(xiàn)出組間顯著差異（＝2.859，＜0.05），隨年限增加，NiRs含量分別在土壤、根際土壤中呈先減少后增加趨勢。PRO含量在土壤和根際土壤中隨時間序列，先增加后減少，且二年生黨參的土壤中NiRs含量高于根際土壤。

表1 各樣品土壤理化因子含量()

同行中數(shù)值后面的不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）；*＜0.05**＜0.01***＜0.001，下同

Different lowercase letters after the values in the same line indicate significant differences. ANOVA:*< 0.05**< 0.01***< 0.001, same as below

3.2 不同生長年限黨參根系微生物群落組成及其多樣性

3.2.1 細菌群落組成及其多樣性 對不同生長年限黨參土壤、根際土壤和根樣品進行細菌16S和真菌ITS高通量測序，土壤和根際土壤樣品采用同一引物擴增16 S序列，而根樣品采用不同引物擴增16S序列，結果顯示土壤樣本與植物樣本細菌注釋稍有差異。在質(zhì)量控制后，18個根樣本得到1 446 298個16 S的clean reads，27個土壤和根際土壤樣本得到2 240 267個16 S的clean reads，在97%分類水平下進行OTU分類，根內(nèi)生細菌共獲得3287個OTU，分類學地位明確的細菌有25個門，68個綱，105個目，156個科，265個屬和150個種；根際土壤細菌共獲得20 522個OTU，分類學地位明確的細菌有49個門，140個綱，202個目，238個科，362個屬和179個種。不生長年限黨參土壤、根際土壤、根內(nèi)微生物組成差異顯著，選擇top10屬水平物種相對豐度進行優(yōu)勢物種展示。圖1結果顯示土壤、根際土壤屬水平優(yōu)勢細菌為（3.07%），根樣本中優(yōu)勢屬為（23.64%）。黨參生長過程中，土壤和根際土壤樣本中的各細菌物種占比處于動態(tài)平衡，而根內(nèi)細菌屬的比例逐年減少，的比例逐年增加。

表中展示Shannon、Simpson、Observed features、Chao1 4個α多樣性指數(shù)（表2）。細菌的Shannon指數(shù)顯示，不同生長年限黨參土壤和根際土壤分別與根樣本組間差異顯著（＜0.001），土壤樣本Shannon指數(shù)高于根樣本。Chao1指數(shù)顯示土壤和根際土壤中組間差異顯著（＜0.001），土壤樣本的Chao1指數(shù)高于根樣本。圖2-A、B的PCoA顯示同年生黨參土壤和根際土壤細菌樣本聚集在一起，而不同年之間樣本分離（Permanova：＝2.294，＝0.001），解釋率為25.77%；不同生長年限黨參根細菌樣本分離（Permanova：＝2.303，＝0.001），解釋率為33.15%。

A-屬水平根系相關微生物群落組成 B-根內(nèi)細菌組成 C-土壤和根際土壤細菌組成

表2 根系微生物α多樣性指數(shù)()

3.2.2 真菌群落組成及其多樣性 測序質(zhì)量控制后，45個土壤樣本和根樣本得到3 537 408個ITS的clean reads。在97%分類水平下進行OTU分類，所有樣本真菌共獲得3287個OTU，分類學地位明確的真菌有20個門，50個綱，113個目，259個科，599個屬和916個種。圖1-C結果顯示土壤、根際土壤和根內(nèi)屬水平優(yōu)勢真菌為（10.66%）、（9.98%）、（7.80%）、（6.64%）和（5.05%）。黨參生長過程中，真菌在三年生黨參的不同隔室中比例最高，在一年生黨參的不同隔室中比例最高。

A-根系微生物β多樣性基于Permanova的PCoA B-根內(nèi)細菌的PCoA C-土壤和根際土壤細菌的PCoA

真菌的Shannon指數(shù)顯示，不同生長年限黨參土壤和根際土壤分別與根樣本組間差異顯著（＜0.001），土壤樣本Shannon指數(shù)高于根樣本。Chao1指數(shù)顯示不同生長年限黨參根內(nèi)細菌和真菌組間差異不顯著，而各樣本中細菌的Chao1指數(shù)明顯高于真菌。圖2-C的PCoA顯示不同生長年限的黨參土壤和根際土壤樣本的真菌聚集在一起，根樣本聚集在一起（Permanova：＝4.448，＝0.001），解釋率為36.93%。

3.3 不同生長年限的黨參根系微生物菌群分布

3.3.1 細菌菌群分布 中性群落模型表明隨機過程在土壤和根際土壤細菌群落組裝過程中占主導作用。圖3-A結果顯示中性模型分別解釋了一年生、二年生、三年生土壤和根際土壤細菌85%、90.6%、90.2%的群落變化，其中二年生黨參土壤細菌擴散能力高于一年生和三年生細菌。隨機過程主導了土壤和根際土壤細菌的群落構建，二年生黨參隨機過程的相對貢獻最大。根內(nèi)細菌受隨機過程影響最大（圖3-B），中性模型分別解釋了一年生、二年生、三年生根內(nèi)細菌65.4%、79.7%、79%的群落變化，而二年生黨參根內(nèi)細菌擴散能力也高于一年生和三年生細菌。

3.3.2 真菌菌群分布 真菌群落組裝的隨機性過程的貢獻度低于細菌。中性模型分別解釋了一年生、二年生、三年生黨參根系真菌61.7%、64.3%、66.7%的群落變化，其中三年生黨參根系真菌擴散能力高于一年生和二年生真菌。基于生態(tài)位寬度的觀察，圖3-B結果顯示土壤細菌和根內(nèi)細菌的生態(tài)位寬度隨生長年限的增加而增加，相對于其他2種根際土壤，二年生黨參根際土壤細菌的生態(tài)位寬度更高。對于真菌而言，土壤和根際土壤生態(tài)位寬度變化趨勢相同，隨生長年限的增加，生態(tài)位寬度先增加后減少，這與根際土壤細菌的變化趨勢相同。根內(nèi)真菌的生態(tài)位寬度最小。

3.4 不同生長年限黨參根系微生物與土壤環(huán)境因子的相關性

不同生長年限黨參根系微生物的組成和多樣性受環(huán)境因素驅(qū)動，進一步探究強相關性的環(huán)境因子的驅(qū)動作用，進行如下分析。圖4為分別以土壤和根際土壤微生物為一組，根內(nèi)微生物為一組的物種組成與環(huán)境因子的Mantel分析。圖4-A結果顯示，土壤和根際土壤的細菌物種與SUC、TN、AK、MC、MBN呈顯著正相關（＜0.05），與CAT呈顯著負相關（＝0.91），且AK與TN之間有強相關性，真菌與PHP、TN、MC呈顯著正相關（＜0.05），與NR呈顯著負相關（＝1.00）。圖4-B結果顯示，根內(nèi)細菌物種與NiRs、TN呈顯著正相關（＜0.05），與CE呈顯著負相關（＝0.95），真菌與PHP、NiRs、TN、MBC、SOM呈顯著正相關（＜0.05），與SUC呈顯著負相關（＝0.95）。

選取屬水平優(yōu)勢微生物與環(huán)境因子進行RDA，結果如圖5所示。圖5-A顯示RDA1和RDA2共解釋該模型的23.63%，TN（＝0.007）、AK（＝0.001）和WC（＝0.001）是影響不同生長年限黨參土壤和根際土壤細菌群落結構和多樣性的主要影響因素。AK與和呈顯著正相關，TN與呈顯著正相關。圖5-B顯示RDA1和RDA2共解釋該模型的20.46%，PRO（＝0.003）、AK（＝0.006）、AP（＝0.001）和SOM（＝0.001）是影響不同生長年限黨參根內(nèi)細菌群落結構和多樣性的主要因素，PRO和AK與呈顯著正相關，而AP和SOM與呈顯著正相關。圖5-C顯示RDA1和RDA2共解釋該模型的21.92%，TN（＝0.033）和TK（＝0.011）是影響不同生長年限黨參根系真菌群落結構和多樣性的主要因素，TN與呈顯著正相關，pH與呈顯著正相關。

SF-SS-土壤和根際土壤 SR-根內(nèi) C1-一年生黨參 C2-二年生黨參 C3-三年生黨參

A-根系相關微生物與環(huán)境因子的相關性 B-土壤和根際土壤細菌和真菌多樣性與環(huán)境因子的Mantel分析

A-根系屬水平優(yōu)勢物種與環(huán)境因子的RDA B-根內(nèi)細菌與環(huán)境因子的RDA C-土壤和根際土壤優(yōu)勢細菌與環(huán)境因子的RDA

3.5 共生網(wǎng)絡分析

為進一步探究不同生長年限黨參根系相關微生物之間的相互關系，對不同樣本繪制共生網(wǎng)絡圖并進行拓撲結構分析。將節(jié)點按照模塊化分組并以不同顏色填充，圖6顯示，細菌網(wǎng)絡圖共分為9個模塊，真菌網(wǎng)絡圖共分為5個模塊，土壤和根際土壤細菌共有155個節(jié)點和497條邊，根內(nèi)細菌有78個節(jié)點和131條邊，真菌共有120個節(jié)點和1465條邊。表3顯示土壤和根際土壤細菌的模塊化系數(shù)最高，為0.645，真菌的模塊化系數(shù)最低，為0.165。平均聚類系數(shù)最高的是真菌，為0.704，最低的是根內(nèi)細菌，為0.384。平均加權度最高的是真菌，為16.811，最低的是根內(nèi)細菌，為2.609。

4 討論

土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在本研究中，不同生長年限黨參土壤和根際土壤pH值呈弱堿性（pH值7.7～8.0），理想黨參生長pH值為弱酸性或中性[36]，有研究表明，受空間格局和季節(jié)變化的影響，甘肅省大多數(shù)土壤情況為堿性沉淀[37]。除SOM外，所測土壤理化因子存在組間差異（＜0.05），二年生和三年生非根際土壤、根際土壤樣本的MBN含量都低于一年生樣本，且表現(xiàn)顯著差異（＜0.05），可能與土壤物種多樣性有關，有研究表明高寒草地生態(tài)系統(tǒng)中，土壤細菌和真菌多樣性與土壤微生物生物量呈負相關[38]，微生物生物量和群落組成而非多樣性也會影響多年生苜蓿根際土壤的氮含量[39]。SOM含量在不同生長年限黨參土壤樣本中表現(xiàn)出動態(tài)穩(wěn)定，可能與腐生微生物組成和氮磷肥的施用有關。

A-黨參根系微生物的共發(fā)生網(wǎng)絡 B-土壤和根際土壤細菌的共發(fā)生網(wǎng)絡 C-根內(nèi)細菌的共發(fā)生網(wǎng)絡

表3 共生網(wǎng)絡拓撲結構

不同生長年限黨參根系優(yōu)勢微生物豐度處于動態(tài)變化之中，這種動態(tài)變化可能導致代謝物差異和積累。許多內(nèi)生菌，如、和也有利于藥用植物中人參皂苷、倍半萜和生物堿的生成[40]。根部微生物群落變化除微生物間相互作用外，也受植物生長階段的影響，例如不同豆科植物在種植過程中，根瘤內(nèi)生菌的富集遵循分級過濾，根瘤內(nèi)生菌的細菌群落根據(jù)植物種類發(fā)生變化[41-42]。從土壤向根內(nèi)圈過渡，物種多樣性和豐度減少，隨黨參生長年限增加，物種多樣性和豐度也有減少趨勢，有研究表明草莓和馬鈴薯在種植的不同年根際群落表現(xiàn)出不同[43]，這表明黨參根系具有一般植物根系微生物的共性。在不同生長的黨參根際土壤中，本研究發(fā)現(xiàn)了一些植物促進生長的根際細菌（PGPR），例如和[44]?？梢援a(chǎn)生鐵載體和胞外多糖，有助于調(diào)節(jié)離子平衡、在植物組織中運輸水分并抑制病原微生物生長[45]，這可能解釋了黨參生長早期病原菌豐度低的原因。觀察不同生長年限黨參根系微生物群落組裝過程，結果顯示群落組裝過程受隨機性過程影響，二年生黨參根系細菌和三年生黨參根系真菌受隨機性影響更大，在同一種植基地栽培的黨參，生長環(huán)境相似，隨機過程可能會壓倒確定性過程[46]。此外，在群落水平對不同生長年限根系生態(tài)寬度進行分析，結果表明根內(nèi)細菌和真菌相比土壤和根際土壤表現(xiàn)出更窄的生態(tài)位寬度，有研究表明，具有更廣泛生態(tài)位寬度的群落受環(huán)境因素影響較小[47]。

不同生長年限植物可以保護耕地土壤，減少土壤流失和水分流失[48]，也可能導致環(huán)境因素驅(qū)動微生物群落影響轉(zhuǎn)變。土壤理化因子與黨參根系微生物群落結構和多樣性顯著相關，在本研究中，分析結果顯示與TN呈顯著正相關，可能是具有促進黨參根系吸收氮元素的功能，有研究表明促進植物固氮和增加非生物脅迫耐受性[49]。AK與和呈顯著正相關，其作為植物促生菌具有良好的解鉀作用[50]。TN與呈顯著正相關，由此推測該病原菌會因有機質(zhì)增加或隨土壤中氮含量下降而降低[51-52]。

土壤和根際土壤細菌網(wǎng)絡復雜度高于根內(nèi)細菌，植物的根系分泌物可能改變了根內(nèi)菌和根際土壤細菌群落的組成。根際真菌群落被認為對植物健康至關重要[53]。在本研究中，病原菌占總體注釋物種的29.94%，土壤和根際土壤中含有植物病原菌豐度高于根內(nèi)，而且屬作為引起根腐病的病原菌，在三年生黨參中豐度最高，該物種在多種作物包括小麥[54]、菠蘿[55]、馬鈴薯[56]中存在。在植物生長早期的集約化管理農(nóng)業(yè)土壤中，真菌主要定殖于健康的植物根系[57]，而在后期階段，病原體逐漸積累，聚集于根內(nèi)。排泄物腐生菌在土壤和根際土壤中的含量高于根內(nèi)，可能與糞肥的施用和腐殖質(zhì)的含量有關。綜上，本研究通過甘肅地區(qū)不同生長年限黨參根系樣本分析，探討了不同生長年限黨參根系土壤的理化性質(zhì)和根系相關微生態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)了在黨參生長過程中，對根系微生物群落結構和多樣性具有顯著影響的土壤環(huán)境因子，為后續(xù)深入研究黨參病害防治，提高黨參品質(zhì)提供理論基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 周武先, 熊琳珂, 張雅娟, 等. 化感作用對川黨參種子萌發(fā)及幼苗生長的影響 [J]. 山東農(nóng)業(yè)科學, 2022, 54(11): 76-85.

[2] 李芳, 楊扶德. 黨參多糖提取分離、化學組成和藥理作用研究進展 [J]. 中華中醫(yī)藥學刊, 2023, 41(4): 42-49.

[3] Bai R B, Li W Y, Li Y D,. Cytotoxicity of two water-soluble polysaccharides fromNannf. var.(Nannf.) L. T. Shen against human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and its mechanism [J]., 2018, 120(Pt B): 1544-1550.

[4] 李成義, 劉書斌, 李碩, 等. 甘肅黨參栽培現(xiàn)狀調(diào)查分析 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2016, 18(1): 102-105.

[5] Li Y M, Liu Y, Zhang H,. The composition of root-associated bacteria and fungi ofand their relationship with the bioactive ingredients [J]., 2021, 12: 642730.

[6] 姜茗軒, 張紅兵, 李冉, 等. 金銀花主要活性成分及內(nèi)生菌研究進展 [J]. 河北省科學院學報, 2022, 39(5): 7-13.

[7] 丁兆軍, 白洋. 根系發(fā)育和微生物組研究現(xiàn)狀及未來發(fā)展趨勢 [J]. 中國科學: 生命科學, 2021, 51(10): 1447-1456.

[8] Zheng Q, Hu Y T, Zhang S S,. Soil multifunctionality is affected by the soil environment and by microbial community composition and diversity [J]., 2019, 136: 107521.

[9] 祝蕾, 嚴輝, 劉培, 等. 藥用植物根際微生物對其品質(zhì)形成的影響及其作用機制的研究進展 [J]. 中草藥, 2021, 52(13): 4064-4073.

[10] 王繼蓮, 李明源, 周茜, 等. 鹽脅迫下植物與根際微生物互作研究進展 [J]. 北方園藝, 2021(17): 143-149.

[11] 全鑫, 楊艷艷, 梁娟, 等. 小麥-玉米輪作一體化保護栽培期間土壤微生物群落變化 [J]. 中國農(nóng)學通報, 2016, 32(12): 132-138.

[12] Li Y Y, Dang H, Lv X,. High-throughput sequencing reveals rhizosphere fungal community composition and diversity at different growth stages ofin the lower reaches of the Tarim River [J]., 10: e13552.

[13] 冼康華, 蘇江, 付傳明, 等. 不同生長年限華重樓根際土壤微生物多樣性研究 [J]. 廣西植物, 2022, 42(12): 2087-2098.

[14] 李勇, 應益昕, 趙東岳, 等. 人參及西洋參栽培土壤微生物種群遺傳多樣性的RAPD分析 [J]. 中草藥, 2010, 41(11): 1871-1875.

[15] Li X G, Ding C F, Zhang T L,. Fungal pathogen accumulation at the expense of plant-beneficial fungi as a consequence of consecutive peanut monoculturing [J]., 2014, 72: 11-18.

[16] 劉詩蓉, 王紅蘭, 孫輝, 等. 半夏連作對根際土壤微生物群落的影響研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(4): 1148-1155.

[17] 吳清瑩, 林宇龍, 孫一航, 等. 根系分泌物對植物生長和土壤養(yǎng)分吸收的影響研究進展 [J]. 中國草地學報, 2021, 43(11): 97-104.

[18] 李敏, 趙熙州, 王好運, 等. 干旱脅迫及外生菌根菌對馬尾松幼苗根系形態(tài)及分泌物的影響 [J]. 林業(yè)科學, 2022, 58(7): 63-72.

[19] 李月明, 楊帆, 韓沛霖, 等. 植物根系分泌物響應非生物脅迫機理研究進展 [J]. 應用與環(huán)境生物學報, 2022, 28(5): 1384-1392.

[20] Hobson D J, Harty M A, Langton D,. The establishment of winter wheat root system architecture in field soils: The effect of soil type on root development in a temperate climate [J]., 2023, 39(1): 198-208.

[21] Langenfeld A, Prado S, Nay B,. Geographic locality greatly influences fungal endophyte communities in[J]., 2013, 117(2): 124-136.

[22] Zhou Y, Coventry D R, Gupta V V S R,. The preceding root system drives the composition and function of the rhizosphere microbiome [J]., 2020, 21(1): 89.

[23] 楊陽, 李海亮, 馬凱麗, 等. 連作對黨參根際土壤理化性質(zhì)、微生物活性及群落特征的影響 [J]. 環(huán)境科學, 2023: 1-15.

[24] 楊姍姍, 仲彩萍, 王儀, 等. 草甘膦對黨參生長根腐病及根際土壤微生物的影響 [J]. 中國現(xiàn)代中藥, 2022, 24(10): 1932-1938.

[25] Dong Y M, Gao M L, Qiu W W,. Effect of microplastics and arsenic on nutrients and microorganisms in rice rhizosphere soil [J]., 2021, 211: 111899.

[26] 鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析 [M]. 第3版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000: 26.

[27] Bremner J M, Mulvaney C S.[M] Madison: Agronomy Monographs, 2015: 595-624.

[28] Olsen B S R.[M]. Washington D C: U.S. Dept. of Agriculture, 1954: 23.

[29] Lu R.[M]. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press, 1999, 107: 147-68.

[30] Jenkinson D S, Powlson D S. The effects of biocidal treatments on metabolism in soil—V [J]., 1976, 8(3): 209-213.

[31] Brookes P C, Landman A, Pruden G,. Chloroform fumigation and the release of soil nitrogen: A rapid direct extraction method to measure microbial biomass nitrogen in soil [J]., 1985, 17(6): 837-842.

[32] 關松蔭. 土壤酶及其研究法 [M]. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1986: 56.

[33] Gil-Sotres F, Trasar-Cepeda C, Leirós M C,. Different approaches to evaluating soil quality using biochemical properties [J]., 2005, 37(5): 877-887.

[34] Bokulich N A, Kaehler B D, Rideout J R,. Optimizing taxonomic classification of marker-gene amplicon sequences with QIIME 2’S q2-feature-classifier plugin [J]., 2018, 6(1): 90.

[35] Sloan W T, Lunn M, Woodcock S,. Quantifying the roles of immigration and chance in shaping prokaryote community structure [J]., 2006, 8(4): 732-740.

[36] Moon K G, Um I S, Jeon S H,. Effect of organic fertilizer application on growth characteristics and saponin content in[J]., 2018, 59(1): 125-130.

[37] Zhang F X. Spatial pattern and seasonal variation of alkaline precipitation observed in the Gansu Province, NW China [J]., 2019, 78(14): 1-11.

[38] Zhang Y, Dong S K, Gao Q Z,. Soil bacterial and fungal diversity differently correlated with soil biochemistry in alpine grassland ecosystems in response to environmental changes [J]., 2017, 7: 43077.

[39] 孫建波, 暢文軍, 李文彬, 等. 香蕉不同生育期根際微生物生物量及土壤酶活的變化研究 [J]. 生態(tài)環(huán)境學報, 2022, 31(6): 1169-1174.

[40] Dong L L, Li Y, Xu J,. Biofertilizers regulate the soil microbial community and enhanceyields [J]., 2019, 14: 20.

[41] Xiao X A, Chen W M, Zong L,. Two cultivated legume plants reveal the enrichment process of the microbiome in the rhizocompartments [J]., 2017, 26(6): 1641-1651.

[42] Wang P P, Yang L F, Sun J L,. Structure and function of rhizosphere soil and root endophytic microbial communities associated with root rot of[J]., 2022, 12: 752683.

[43] Murphy C, Foster B, Gao C L. Temporal dynamics in rhizosphere bacterial communities of three perennial grassland species [J]., 2016, 6(1): 17.

[44] Backer R, Rokem J S, Ilangumaran G,. Plant growth-promoting rhizobacteria: Context, mechanisms of action, and roadmap to commercialization of biostimulants for sustainable agriculture [J]., 2018, 9: 1473.

[45] Bhandari P, Garg N. Plant-microbe communication: New facets for sustainable agriculture [A] // Singh D, Gupta V, Prabha R.[M]. Singapore: Springer, 2019: 547-573.

[46] Wang J J, Shen J, Wu Y C,. Phylogenetic beta diversity in bacterial assemblages across ecosystems: Deterministic versus stochastic processes [J]., 2013, 7(7): 1310-1321.

[47] Jiao S, Yang Y F, Xu Y Q,. Balance between community assembly processes mediates species coexistence in agricultural soil microbiomes across Eastern China [J]., 2020, 14(1): 202-216.

[48] Salah A M A, Prasse R, Marschner B. Intercropping with native perennial plants protects soil of arable fields in semi-arid lands [J]., 2016, 130: 1-13.

[49] Zboralski A, Filion M. Genetic factors involved in rhizosphere colonization by phytobeneficialspp. [J]., 2020, 18: 3539-3554.

[50] 黃濤. 玉米根際促生細菌的篩選及其促生機理初步研究 [D]. 沈陽: 沈陽農(nóng)業(yè)大學, 2019.

[51] 曾廣娟, 馮陽, 吳舒, 等. 基于高通量測序的有機種植蔬菜地土壤微生物多樣性分析 [J]. 南方農(nóng)業(yè)學報, 2022, 53(9): 2403-2414.

[52] Li H Y, Qiu Y Z, Yao T,. Nutrients available in the soil regulate the changes of soil microbial community alongside degradation of alpine meadows in the northeast of the Qinghai-Tibet Plateau [J]., 2021, 792: 148363.

[53] 任氫欣, 曾齊, 張必弦, 等. 基于高通量測序的大豆根際真菌群落動態(tài)變化分析 [J]. 分子植物育種, 2021, 19(14): 4836-4845.

[54] 李燕, 張玉鳳, 林海濤, 等. 木醋液對小麥根腐病致病菌及小麥發(fā)芽的影響 [J]. 山東農(nóng)業(yè)科學, 2017, 49(4): 96-99.

[55] Ibrahim N F, Mohd M H, Mohamed Nor N M I,. Characterization ofspp. associated with pineapple fruit rot and leaf spot in[J]., 2017, 165(11/12): 718-726.

[56] 姚凡, 王喜剛, 郭成瑾, 等. 繩狀青霉P-19不同固體發(fā)酵浸提液對馬鈴薯鐮刀菌根腐病病原菌的抑制作用 [J]. 植物保護, 2022, 48(6): 368-373.

[57] Loit K, Soonvald L, Astover A,. Temporal and cultivar-specific effects on potato root and soil fungal diversity [J]., 2020, 10(10): 153.

Root microbial community structure and diversity ofin different growth years

MENG Tong-tong1, 3, CUI Xing-shuai2, ZHU Ning2, LENG Fei-fan2, WANG Yong-gang2, CHEN Ji-xiang1, 2

1. College of Energy and Power Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China 2. School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China 3. Gansu Water Conservancy Research Institute, Lanzhou 730050, China

To explore the changes of root microbial community structure of Dangshen [(Franch.) Nannf.] in different growth years and its correlation with soil environmental factors in order to improve the quality of.The soil, rhizosphere soil and roots ofin the first, second and third years were analyzed by high-throughput sequencing and bioinformatics.With the increase of growth years of, theof dominant bacteria in soil and rhizosphere soil was in dynamic balance, while the abundance of bacterialin root was decreased. The abundance of fungalin soil and rhizosphere soil decreased year by year, while the abundance of pathogenic fungusinroot increased year by year. The microbial community assembly ofroots with different growth years is more affected by random processes, and the functional stability of root bacteria is higher than that of fungi. Protease, total nitrogen, available potassium, water content, available phosphorus and soil organic matter are the main factors affecting the bacterial community structure and diversity ofroots in different growth years. Total nitrogen and total potassium are main factors affecting the structure and diversity of fungal community.The composition and diversity of root microbial community ofchanged with the growth years, and responded to different soil environmental factors, which provided a theoretical basis for the later in-depth study ofdisease control and improving its quality.

(Franch.) Nannf.; high-throughput sequencing; environmental factors; root system; microbial diversity

R286.12

A

0253 - 2670(2023)15 - 4992 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.024

2022-12-03

國家自然科學基金資助項目（32160066）；甘肅省自然科學基金項目（20JR5RA475）；蘭州理工大學青年人才支持計劃項目（2018）

孟彤彤，男，博士研究生，研究方向為水資源利用與環(huán)境工程。E-mail: 61734210@qq.com

通信作者：陳吉祥，博士，教授，博士研究生導師，主要從事環(huán)境工程研究。E-mail: chenjixiang@lut.edu.cn

王永剛，博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事微生態(tài)效應對藥用植物生長及代謝物研究。E-mail: wangyg@lut.edu.cn

[責任編輯 時圣明]