田仁偉，張少謙，太鶴蓓，張雅婷，陳明竹，羅 超，吳文麗，吳 寧

·數(shù)據(jù)挖掘與循證醫(yī)學(xué)·

非特異性間質(zhì)性肺炎關(guān)鍵基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析及中藥預(yù)測(cè)

田仁偉，張少謙，太鶴蓓，張雅婷，陳明竹，羅 超，吳文麗，吳 寧*

貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院化學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004

探尋非特異性間質(zhì)性肺炎相關(guān)的關(guān)鍵基因、發(fā)病機(jī)制、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平和潛在治療中藥。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取基因芯片GSE110147，利用R語(yǔ)言“l(fā)imma”等相關(guān)拓展包篩選差異表達(dá)基因，通過(guò)STRING和Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選出關(guān)鍵基因。關(guān)鍵基因通過(guò)基因芯片GSE101286進(jìn)行驗(yàn)證后，利用R語(yǔ)言“clusterProfiler”等拓展包及Cytoscape軟件中的GlueGO插件進(jìn)基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，再基于CIBERSORT反卷積算法分析免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式。最后將關(guān)鍵基因?qū)隒oremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相關(guān)中藥預(yù)測(cè)。共篩選出407個(gè)差異基因和15個(gè)關(guān)鍵基因。GO分析顯示，非特異性間質(zhì)性肺炎與剪切體、翻譯過(guò)程高度相關(guān)；KEGG富集結(jié)果顯示非特異性間質(zhì)性肺炎與RNA剪接體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路聯(lián)系最為密切。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析顯示非特異性間質(zhì)性肺炎患者組織內(nèi)靜息的CD4+記憶T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等浸潤(rùn)水平較高，而CD8+T細(xì)胞、漿細(xì)胞、活化NK細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)水平較低。通過(guò)關(guān)鍵基因篩選到18味中藥，其中雷公藤和茯苓有較大治療潛力。通過(guò)生物信息學(xué)方法，篩選非特異性間質(zhì)性肺炎的關(guān)鍵基因，明確了潛在治療中藥，為非特異性間質(zhì)性肺炎發(fā)病機(jī)制、治療新靶點(diǎn)研究及新藥研發(fā)提供新的方向。

非特異性間質(zhì)性肺炎；生物信息學(xué)；關(guān)鍵基因；免疫浸潤(rùn)；雷公藤；茯苓

非特異性間質(zhì)性肺炎（nonspecific interstitial pneumonia，NSIP）屬于間質(zhì)性肺炎的一種，于2002年被單獨(dú)列出作為一種疾病[1]。NSIP臨床特征無(wú)明顯特異性，多以咳嗽和呼吸困難為主，少數(shù)病例會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、疲勞和體質(zhì)量下降等癥狀[2-3]，故容易造成誤診。目前對(duì)于NSIP的發(fā)病機(jī)制并不明確，但已有研究表明炎癥誘導(dǎo)及部分免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在其發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[4]，與肺部膠原纖維沉著致肺間質(zhì)增厚一起作為NSIP 2個(gè)已知的主要病理改變。故挖掘其關(guān)鍵基因、生物學(xué)過(guò)程、相關(guān)通路和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況有較大意義。目前對(duì)于NSIP的治療方法多以激素和免疫抑制劑為主，但其副作用較大，治療效果仍不理想[5]，故不良反應(yīng)較少的中藥或許會(huì)成為其新的治療思路。本研究主要探討與NSIP主要病理變化的發(fā)生機(jī)制相關(guān)的基因或通路，分析其免疫浸潤(rùn)模式中突出表現(xiàn)的細(xì)胞，以及針對(duì)關(guān)鍵基因預(yù)測(cè)靶向中藥，以期為NSIP的臨床診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)[6]（GEO DataSet，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中以“nonspecific interstitial pneumonia、non-specific interstitial pneumonia、NSIP”作為檢索詞，將種屬設(shè)置為“human sapiens”進(jìn)行檢索，選擇結(jié)果中2018年1月以后發(fā)表的基因芯片GSE110147為研究對(duì)象，其中包括10個(gè)NSIP患者肺組織樣本和11個(gè)正常組織樣本。GSE101286為2017年發(fā)表芯片，且質(zhì)量較好，用于驗(yàn)證關(guān)鍵基因的差異表達(dá)，研究技術(shù)路線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1 技術(shù)路線(xiàn)流程

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

運(yùn)用R Studio調(diào)用“Bioconductor”“affyPLM”等相關(guān)拓展包對(duì)GSE110147表達(dá)譜芯片進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，繪制芯片相對(duì)對(duì)數(shù)表達(dá)（relative log expression，RLE）箱線(xiàn)圖、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（normalized unscaled standard errors，NUSE）箱線(xiàn)圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理及差異基因篩選

基于“l(fā)imma”拓展包對(duì)NSIP和正常組織基因數(shù)據(jù)中的探針進(jìn)行歸一化處理，并且對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行τ檢驗(yàn)和貝葉斯檢驗(yàn)，當(dāng)1個(gè)基因?qū)?yīng)多個(gè)探針時(shí)取其平均值，箱線(xiàn)圖檢驗(yàn)其標(biāo)準(zhǔn)化和分組間聚類(lèi)情況。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后的GSE110147芯片表達(dá)譜進(jìn)行差異分析。差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）以log2(fold change, FC) 的絕對(duì)值＞2和＜0.01為篩選條件，以log2FC的正負(fù)代表該基因上調(diào)或是下調(diào)。

1.4 差異基因蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

將獲得的DEGs以medium confidence＞0.4為篩選條件，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[7]（https://string-db. org/）進(jìn)行PPI分析，再將得到的PPI互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件（Version 3.9.1），利用CytoHubba插件中的度（degree）值對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排名，篩選獲得關(guān)鍵基因（hub gene）。

1.5 關(guān)鍵基因驗(yàn)證

將基因芯片GSE101286按照“1.2”和“1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理得到各基因的表達(dá)情況，再?gòu)闹袑⒎治霁@得的關(guān)鍵基因在基因芯片GSE101286表達(dá)矩陣中進(jìn)行提取，并通過(guò)R語(yǔ)言對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行可視化分析，驗(yàn)證關(guān)鍵基因在2個(gè)基因芯片中表達(dá)趨勢(shì)是否一致。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將得到的關(guān)鍵基因以閾值＜0.05通過(guò)Cytoscape軟件的GlueGO插件進(jìn)行GO功能富集分析；再基于R Studio和“clusterProfiler”“org.Hs.eg. db”“ggplot2”“pathview”等擴(kuò)展包，設(shè)定閾值＜0.05，進(jìn)行KEGG通路富集分析，并且將排名前2的通路進(jìn)行基因定位展示。

1.7 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

將所獲得的DEGs基于CIBERSORT算法，以閾值＜0.05進(jìn)行22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析，其中包括CD8+T淋巴細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、活化的自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞。

1.8 相關(guān)中藥預(yù)測(cè)

將關(guān)鍵基因輸入到Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)[8]（http://www.coremine.com/）中，下載該基因的相關(guān)中藥信息，以＜0.05為條件得到潛在治療中藥。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化分析，并篩選出對(duì)應(yīng)2個(gè)關(guān)鍵基因及以上的關(guān)鍵中藥，再通過(guò)《中藥大辭典》《中國(guó)藥典》《中華本草》等分析其性味歸經(jīng)和功能主治，最后通過(guò)查閱文獻(xiàn)找出關(guān)鍵中藥。

1.9 關(guān)鍵中藥與對(duì)應(yīng)基因分子對(duì)接驗(yàn)證

對(duì)得到的關(guān)鍵中藥進(jìn)行分析并查找其主要成分，在PubChem（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）平臺(tái)下載主要成分的3D結(jié)構(gòu)，從PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載藥物候選靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)，通過(guò)PyMOL2.4.0進(jìn)行處理，再通過(guò)AutoDock vina進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接結(jié)果用自由結(jié)合能判定優(yōu)劣，當(dāng)自由結(jié)合能≤?5.0 kJ/mol，表示化合物與靶蛋白之間有良好的相互作用關(guān)系，結(jié)合能越低，對(duì)接模塊越穩(wěn)定，二者相互作用的可能性越大，選擇自由結(jié)合能最低的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 芯片質(zhì)量分析

對(duì)GSE110147基因芯片進(jìn)行質(zhì)量分析，結(jié)果顯示所得RLE箱線(xiàn)圖各個(gè)樣本中位數(shù)在同一條水平線(xiàn)上，整體表達(dá)水平基本趨于一致。NUSE相較于RLE則更為敏感，可以進(jìn)一步剔除降解嚴(yán)重的不可靠樣本，NUSE箱線(xiàn)圖結(jié)果顯示，整體表達(dá)水平同樣接近一致，則所有數(shù)據(jù)可納入研究，見(jiàn)圖2。

圖2 GSE110147基因芯片質(zhì)量分析箱線(xiàn)圖

2.2 DEGs獲得

通過(guò)R包對(duì)GSE110147基因芯片分析結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)化后樣本表達(dá)基線(xiàn)一致，共篩選得到407個(gè)DEGs（上調(diào)基因273個(gè)，下調(diào)基因134個(gè)），并以火山圖及熱圖展示排名前100的DEGs，見(jiàn)圖3。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因獲得

對(duì)所得DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，其中共有297個(gè)節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)間共1160個(gè)相互作用關(guān)系。根據(jù)度值評(píng)分排序，選出前15個(gè)基因，分別為含WD重復(fù)域蛋白36（WD repeat-containing protein 36，）、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白E1（ATP-binding cassette sub-family E member 1，）、（superkiller viralicidic activity 2-like 2）、核糖體蛋白S13（Ribosomal protein S13，）、90 kDa熱休克蛋白αA1（heat shock protein HSP 90-alpha1，）、真核翻譯起始因子3a（eukaryotic translation initiation factor 3 subunit A，）、（DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB2）、（RPL13A為其編碼蛋白，small nucleolar RNA，C/D box 34）、真核翻譯起始因子5B（eukaryotic translation initiation factor 5B，）、DEAD框肽21（DExD-box helicase 21，）、GTP結(jié)合蛋白4（GTP-binding protein 4，）、染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白3（structural maintenance of chromosomes protein 3，）、核仁pre-rRNA加工蛋白同系物（nucleolar pre-rRNA processing protein homolog，）、核仁素（nucleolin，）、谷氨酰脯氨酰tRNA合成酶（glutamate-tRNA ligase，），其中和為下調(diào)基因，其余為上調(diào)基因，見(jiàn)圖4和表1。

2.4 關(guān)鍵基因驗(yàn)證結(jié)果

將關(guān)鍵基因在基因芯片GSE101286進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，除基因、和以外12個(gè)基因所得驗(yàn)證結(jié)果與上述結(jié)果一致（＜0.05），見(jiàn)圖5。

2.5 GO功能富集和KEGG通路分析

關(guān)鍵基因的GO分析顯示，主要富集的生物過(guò)程（biological process，BP）為蛋白質(zhì)復(fù)性、翻譯過(guò)程、高爾基組織、細(xì)胞骨架依賴(lài)型細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、水解酶活性；細(xì)胞成分（cellular component，CC）為剪接復(fù)合體、染色體著絲粒區(qū)域、核斑點(diǎn)；分子功能（molecular function，MF）為退火活性、微管蛋白結(jié)合、RNA結(jié)合。KEGG通路分析共獲得13條富集通路，其中核心靶點(diǎn)與RNA剪接體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路聯(lián)系最為密切，除此之外還與黏著斑激酶信號(hào)通路、癌癥中蛋白多糖變化等存在聯(lián)系，見(jiàn)圖6、7。

2.6 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)

通過(guò)CIBERSORT算法所得結(jié)果（圖8）顯示，與正常組織相比，NSIP患者組織中CD8+T細(xì)胞（Tcells CD8）浸潤(rùn)水平顯著降低，漿細(xì)胞（plasma cells）、活化的NK細(xì)胞（NK cells activated）和M1巨噬細(xì)胞（macrophages M1）表達(dá)水平均較低；NSIP患者組織中靜息的CD4+記憶T細(xì)胞（T cells CD4 memory resting）浸潤(rùn)水平顯著升高，幼稚B細(xì)胞（B cells naive）、活化的CD4+記憶T細(xì)胞（T cells CD4 memory activated）、單核細(xì)胞（monocytes）、M0巨噬細(xì)胞（macrophages M0）、M2巨噬細(xì)胞（macrophages M2）、活化的樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells activated）、肥大細(xì)胞（dendritic cells activated）和嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils）的表達(dá)水平也較高。

而記憶B細(xì)胞（B cells memory）、幼稚CD4+T細(xì)胞（T cells CD4 naive）、濾泡輔助性T細(xì)胞（T cells follicular helper）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T cells regulatory，Tregs）、靜息的NK細(xì)胞（NK cells resting）、中性粒細(xì)胞（neutrophils）表達(dá)水平差異不顯著。

同時(shí)將差異最為顯著的CD8+T細(xì)胞、靜息的CD4+記憶T細(xì)胞與15個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)除和外，其余13個(gè)基因與CD8+T細(xì)胞呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，與靜息的CD4+記憶T細(xì)胞呈現(xiàn)正相關(guān)性，見(jiàn)圖9（＜0.05、＞0.3有相關(guān)性，＜0.05、＞0.8為顯著相關(guān)）。

A-GO功能富集聚類(lèi)圖 B-GO功能富集餅狀圖 C-KEGG通路富集氣泡圖 D-KEGG通路富集環(huán)狀圖

A-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路 B-RNA剪接體通路（紅色高亮為富集所得關(guān)鍵基因在通路中的位置）

A-免疫細(xì)胞浸潤(rùn)堆積圖 B-免疫細(xì)胞浸潤(rùn)箱線(xiàn)圖（*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001）

2.7 中藥預(yù)測(cè)分析

通過(guò)關(guān)鍵基因共篩選到18味中藥，分別為冬菇、玉米須、向日葵花、松葉、松香、松節(jié)油、松花粉、石刁柏、芒果核、落葵、雷公藤、葵花盤(pán)、浮小麥、茯神、茯苓、北豆根、板栗和浙貝母，其中四氣五味主要集中于平、溫、甘和苦，歸經(jīng)以肝、脾、心、腎和肺為主，功能主治偏重清熱利濕、利尿消腫。通過(guò)查閱文獻(xiàn)驗(yàn)證后雷公藤與茯苓治療潛力較大，見(jiàn)圖10和表2，性味歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)圖11。

圖9 關(guān)鍵基因與CD8+T細(xì)胞、靜息的CD4+記憶T細(xì)胞相關(guān)性分析

內(nèi)圈紅色圓為關(guān)鍵基因，中間較大藍(lán)色圓為18味關(guān)鍵中藥，外圈藍(lán)色園為其余不顯著中藥

2.8 關(guān)鍵中藥分子對(duì)接驗(yàn)證

通過(guò)查閱文獻(xiàn)以及口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、類(lèi)藥性（drug-likeness，DL），分析關(guān)鍵中藥雷公藤和茯苓主要活性物質(zhì)，并從中選擇5種主要活性物質(zhì)與對(duì)應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，得到其優(yōu)勢(shì)構(gòu)象和自由結(jié)合能。結(jié)果表明，主要活性物質(zhì)與其對(duì)應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄蛋白的自由結(jié)合能均小于?5.0 kJ/mol，并且每個(gè)有效成分均可以通過(guò)氫鍵作用于其對(duì)應(yīng)的蛋白氨基酸殘基，見(jiàn)表3和圖12、13。結(jié)果證明雷公藤與茯苓的主要活性物質(zhì)與其對(duì)應(yīng)蛋白的相互作用可能性較大，有潛在作用價(jià)值。

3 討論

NSIP屬于間質(zhì)性肺炎的一種，是一種慢性肺部疾病，肺泡壁均勻增厚、炎癥與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維沉著是其主要的病理變化，常見(jiàn)癥狀為咳嗽與呼吸困難[9]。

表2 關(guān)鍵基因預(yù)測(cè)中藥分析

圖11 中藥四氣(A)、五味(B)、歸經(jīng)(C) 統(tǒng)計(jì)分析

目前發(fā)病機(jī)制、診斷依據(jù)并不十分清楚，并且治療方案副作用較多，治療效果并不理想。生物信息學(xué)是多學(xué)科交叉融合的一門(mén)綜合學(xué)科，而高通量技術(shù)是生物信息學(xué)中新一代的測(cè)序技術(shù)，能以更高通量、更低成本快速完成基因組和轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序[10-11]。因此，使用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)NSIP的關(guān)鍵基因、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)等情況進(jìn)行分析，可以對(duì)尋找NSIP發(fā)病機(jī)制起到推動(dòng)作用。同時(shí)基于該技術(shù)，為NSIP尋找潛在治療靶點(diǎn)，并進(jìn)一步以此預(yù)測(cè)潛在治療中藥，不僅可以推動(dòng)傳統(tǒng)中藥發(fā)展達(dá)到老藥新用的目的，以期對(duì)臨床治療提供一定研究基礎(chǔ)。

3.1 關(guān)鍵基因與NSIP內(nèi)在聯(lián)系

本研究通過(guò)對(duì)基因芯片GSE110147進(jìn)行分析，得到273個(gè)上調(diào)基因和134個(gè)下調(diào)基因。并且通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選出15個(gè)與NSIP發(fā)病機(jī)制相關(guān)的關(guān)鍵基因。分別為下調(diào)基因、和上調(diào)基因、、、、、、、、、、、，與基因芯片GSE101286驗(yàn)證結(jié)果基本一致（除基因、和以外）。

表3 關(guān)鍵中藥主要活性物質(zhì)與對(duì)應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄蛋白分子對(duì)接結(jié)果

圖12 雷公藤有效活性物質(zhì)與對(duì)應(yīng)基因分子對(duì)接驗(yàn)證

圖13 茯苓有效活性物質(zhì)與對(duì)應(yīng)基因分子對(duì)接驗(yàn)證

15個(gè)關(guān)鍵基因中部分基因已有研究表明與肺部疾病有較大關(guān)聯(lián)：可以作為抗肺纖維化的治療靶標(biāo)，并且通過(guò)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1，TGFβ1）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號(hào)通路調(diào)節(jié)間充質(zhì)標(biāo)志物和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)，因此可作為治療特發(fā)性肺纖維化的潛在靶標(biāo)[12]。在肺癌患者中高表達(dá)還與較差的生存預(yù)后相關(guān)，并且可作為輔助診斷指標(biāo)[13-14]。在肺癌中表達(dá)較高且預(yù)后不良，可以通過(guò)激活程序性死亡配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）而抑制T細(xì)胞活性，可作為干預(yù)肺癌的靶標(biāo)[15]。在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)水平較高，在敲低的小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低[16]。在人的肺腺癌組織中，表達(dá)水平較高，與臨床的分期也有聯(lián)系，在敲低后可以減緩癌細(xì)胞的增殖，并且與降低靶向藥物的耐藥性有關(guān)[17-18]，而在非小細(xì)胞肺癌中，可以通過(guò)細(xì)胞趨化因子7（C-C motif chemokine 7，CCL7）信號(hào)通路參與肺癌的進(jìn)展[19]。在人肺癌A549細(xì)胞中敲低之后會(huì)抑制該細(xì)胞的增殖和遷移能力[20]。通過(guò)參與肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用而影響肺纖維化的進(jìn)程，通過(guò)抑制表達(dá)可以改善肺纖維化程度，目前已有針對(duì)該靶點(diǎn)進(jìn)行治療藥物的研究[21-23]。

肺纖維化為NSIP重要的病理變化，且預(yù)后不理想。如上所述，本研究篩選出的關(guān)鍵基因與肺部纖維化有所關(guān)聯(lián)。因此，在NSIP的進(jìn)展中，對(duì)這些基因的關(guān)注可能會(huì)給NSIP的防治帶來(lái)新的研究方向。

3.2 富集結(jié)果與NSIP的內(nèi)在聯(lián)系

對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能富集分析結(jié)果顯示，NSIP與剪切體、翻譯過(guò)程高度相關(guān)，而KEGG通路富集分析結(jié)果顯示NSIP與RNA剪接體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路聯(lián)系最為密切。其中剪切體出現(xiàn)于2項(xiàng)富集結(jié)果中，提示其與NSIP可能存在緊密聯(lián)系，針對(duì)剪切體進(jìn)行檢索后，發(fā)現(xiàn)目前研究中，剪切體與肺癌的發(fā)病過(guò)程有較大關(guān)聯(lián)性[24-25]，并且剪切體的相關(guān)蛋白130在特發(fā)性肺纖維化中的纖維化病灶中高表達(dá)，并且與肺部纖維化程度呈正相關(guān)，與其發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)[26]，這提示剪切體可能會(huì)在NSIP進(jìn)展過(guò)程中與其纖維化程度有所關(guān)聯(lián)。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在間質(zhì)性肺炎纖維化的過(guò)程中也起到一定的作用[27-28]，表明這些生物結(jié)構(gòu)過(guò)程和通路為NSIP潛在的治療靶點(diǎn)和研究方向。

結(jié)合前文對(duì)關(guān)鍵基因的分析，關(guān)鍵基因與富集結(jié)果相互印證彼此的可靠性。而目前在NSIP中尚未有對(duì)高爾基體、微管蛋白結(jié)合、黏著斑激酶信號(hào)通路的研究，也許在NSIP的發(fā)展過(guò)程中有著一定的作用，可為后續(xù)的研究提供方向來(lái)揭示NSIP尚不明確的發(fā)病過(guò)程。

3.3 免疫浸潤(rùn)結(jié)果分析

對(duì)基因芯片進(jìn)行22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析顯示，NSIP患者組織內(nèi)靜息的CD4+記憶T細(xì)胞、活化的CD4+記憶T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、幼稚B細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞等浸潤(rùn)水平較高，但靜息的CD4+記憶T細(xì)胞浸潤(rùn)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于活化的CD4+記憶T細(xì)胞，而CD8+T細(xì)胞、漿細(xì)胞、活化NK細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)水平較低。提示免疫細(xì)胞在NSIP的浸潤(rùn)模式有特異性，多種具有免疫應(yīng)答或促炎功能的細(xì)胞浸潤(rùn)水平顯著提升，故免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在NSIP的發(fā)展過(guò)程中起到重要的作用。

免疫細(xì)胞浸潤(rùn)同樣是NSIP重要的發(fā)病過(guò)程，通過(guò)文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞浸模式與肺纖維化密切相關(guān)。而本研究中所得CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在肺纖維化的進(jìn)程中已被證實(shí)存在緊密聯(lián)系，外周血中的T淋巴細(xì)胞可分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞能夠通過(guò)釋放多種細(xì)胞因子，使病原體清除率增加，在抗纖維化的免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵作用；而CD8+T細(xì)胞則可以識(shí)別被感染的細(xì)胞，使其凋亡，達(dá)到清除病毒的目的同時(shí)引起炎癥反應(yīng)，二者相互作用，與其他免疫細(xì)胞共同維持著機(jī)體免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)行。而CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的數(shù)量對(duì)肺纖維化的發(fā)展非常重要，可通過(guò)提升二者比值增強(qiáng)體內(nèi)的免疫功能，降低肺纖維化的發(fā)生[29]，同時(shí)通過(guò)抑制程序性死亡因子-1增加CD8+T細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞的水平來(lái)改善肺纖維化水平也被多次證實(shí)有效[30-32]。本研究結(jié)果顯示NSIP患者體內(nèi)靜息的CD4+記憶T細(xì)胞水平增加多于活化的CD4+記憶T細(xì)胞，轉(zhuǎn)化為效應(yīng)T細(xì)胞的能力受到影響。而CD8+T細(xì)胞數(shù)量則顯著減少，反映NSIP患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，免疫功能減弱，抗肺纖維化的能力下降，更易發(fā)生肺纖維化。而其余臨床細(xì)胞浸潤(rùn)模式的改變，可能會(huì)使得NSIP發(fā)病過(guò)程中出現(xiàn)有別于其他肺病中肺纖維化的特性。

從關(guān)鍵基因與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析可知，13個(gè)關(guān)鍵基因與最為顯著的靜息的CD4+記憶T細(xì)胞呈現(xiàn)正相關(guān)，與CD8+T細(xì)胞呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。不僅提示了分析結(jié)果的可靠性與一致性，還反映出針對(duì)關(guān)鍵基因與免疫細(xì)胞用藥來(lái)減輕肺纖維化程度值得深入研究。

目前NSIP診斷仍存在一些問(wèn)題，難以與其他間質(zhì)性肺炎區(qū)別，而對(duì)于免疫浸潤(rùn)模式及其相關(guān)基因的深入研究，可以找出NSIP獨(dú)特的浸潤(rùn)模式，得到新的依據(jù)幫助診斷疾病，并針對(duì)免疫細(xì)胞的差異性和肺纖維化的內(nèi)在聯(lián)系制定治療方案，彌補(bǔ)臨床上診斷困難和治療效果不理想的現(xiàn)狀。

3.4 中藥預(yù)測(cè)結(jié)果分析

NSIP在中醫(yī)學(xué)中并未有詳細(xì)準(zhǔn)確的介紹，且間質(zhì)性肺炎在中醫(yī)理論中也沒(méi)有統(tǒng)一病名，但有理論認(rèn)為該病主要累及肺、脾、腎3臟，致3臟皆虛。又根據(jù)其癥狀將其歸為肺瘺、肺痹，前者病因歸結(jié)為先天腎之真陰不足、后天外邪犯肺，后者病因歸結(jié)為肺氣虧虛。本研究針對(duì)關(guān)鍵基因篩選治療NSIP的潛在中藥，得到冬菇、玉米須、向日葵花、松葉、松香、松節(jié)油、松花粉、石刁柏、芒果核、落葵、雷公藤、葵花盤(pán)、浮小麥、茯神、茯苓、北豆根、板栗和浙貝母共18味中藥，主要?dú)w為心、肝、脾、肺、腎經(jīng)，與NSIP中醫(yī)理論高度符合，其中除與肺、脾、腎經(jīng)直接關(guān)聯(lián)以外，心經(jīng)和肝經(jīng)同樣有關(guān)，肺氣虧虛，金虛木侮，加重病情。氣為血之帥，血為氣之母，肺氣虧虛，宗氣不足，則心血運(yùn)行不暢。故其治療方案針對(duì)不同證候，以清熱化痰、活血化瘀、溫陽(yáng)補(bǔ)氣和祛瘀解毒為主。18味中藥中，浙貝母、北豆根、茯苓、茯神和雷公藤歸經(jīng)功效較為符合。

進(jìn)一步通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)雷公藤和茯苓在肺部疾病上已有不少研究，與NSIP更為符合。茯苓對(duì)應(yīng)基因?yàn)楹停坠賹?duì)應(yīng)基因?yàn)楹?，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路密切相關(guān)。茯苓利水滲濕、健脾寧心，在慢性阻塞性肺疾病[33]、放射性肺損傷[34]等肺部相關(guān)疾病中有一定治療作用，并且可以提升CD4+T細(xì)胞的數(shù)量與CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞水平[35]。雷公藤清熱解毒、祛風(fēng)通絡(luò)，已有研究表明雷公藤可以通過(guò)多途徑影響肺纖維化、哮喘、肺腺癌等肺部相關(guān)疾病[36-39]，除此之外還有研究表明雷公藤對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也有影響，與其對(duì)應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工通路有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)[40]，并且還可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的表達(dá)[41-42]。

通過(guò)分子對(duì)接也初步證明雷公藤與茯苓有效成分與其對(duì)應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄蛋白自由結(jié)合能較低，說(shuō)明有較大的相互作用可能性，故雷公藤與茯苓對(duì)NSIP的潛在治療價(jià)值更具有說(shuō)服力。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究以探究NSIP的關(guān)鍵基因和免疫浸潤(rùn)模式為主，通過(guò)關(guān)鍵基因富集得到NSIP相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，完善其發(fā)病機(jī)制。通過(guò)已有研究推測(cè)關(guān)鍵基因在NSIP主要病理過(guò)程中的作用。分析得到NSIP主要的免疫浸潤(rùn)模式后，找到最為顯著的免疫細(xì)胞與關(guān)鍵基因做相關(guān)性研究，從基因與免疫浸潤(rùn)的角度共同闡述NSIP的主要病理過(guò)程。最后通過(guò)關(guān)鍵基因分析得到潛在治療中藥，分析其性味歸經(jīng)和功能主治，通過(guò)中醫(yī)理論和已有文獻(xiàn)分析其中最有潛在治療價(jià)值的中藥。研究結(jié)果有助于進(jìn)一步闡釋NSIP的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展過(guò)程，為NSIP后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究、藥物開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供一定的研究基礎(chǔ)。但本研究仍然存在不足，NSIP相關(guān)基因芯片數(shù)量較少，后續(xù)研究應(yīng)關(guān)注其發(fā)展，及時(shí)補(bǔ)充納入，除此之外本研究還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)鍵基因及相關(guān)中藥的治療效果。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] American Thoracic Society, European Respiratory Society. American Thoracic Society/European Respiratory Society international multidisciplinary consensus classification of the idiopathic interstitial pneumonias. This joint statement of the American Thoracic Society (ATS), and the European Respiratory Society (ERS) was adopted by the ATS board of directors, June 2001 and by the ERS Executive Committee, June 2001 [J]., 2002, 165(2): 277-304.

[2] Belloli E A, Beckford R, Hadley R,. Idiopathic non-specific interstitial pneumonia [J]., 2016, 21(2): 259-268.

[3] 王增智, 高楊, 李杰, 等. 非特異性間質(zhì)性肺炎6例臨床分析 [J]. 心肺血管病雜志, 2022, 41(10): 1066-1070.

[4] Hansell D M, Bankier A A, MacMahon H,. Fleischner Society: Glossary of terms for thoracic imaging [J]., 2008, 246(3): 697-722.

[5] Li X, Chen C, Xu J F,. Nonspecific interstitial pneumonia and usual interstitial pneumonia: Comparison of the clinicopathologic features and prognosis [J]. J, 2014, 6(10): 1476-1481.

[6] Barrett T, Wilhite S E, Ledoux P,. NCBI GEO: Archive for functional genomics data sets: Update [J]., 2013, 41: D991-D995.

[7] Szklarczyk D, Gable A L, Lyon D,. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets [J]., 2019, 47(D1): D607-D613.

[8] Gorji-Bahri G, Moghimi H R, Hashemi A. RAB5A is associated with genes involved in exosome secretion: Integration of bioinformatics analysis and experimental validation [J]., 2021, 122(3/4): 425-441.

[9] Kono M, Nakamura Y, Yoshimura K,. Nonspecific interstitial pneumonia preceding diagnosis of collagen vascular disease [J]., 2016, 117: 40-47.

[10] Aldridge S, Teichmann S A. Single cell transcriptomics comes of age [J]., 2020, 11(1): 4307.

[11] Ouzounis C A, Valencia A. Early bioinformatics: The birth of a discipline: A personal view [J]., 2003, 19(17): 2176-2190.

[12] Song D G, Kim D, Jung J W,Glutamyl-prolyl-tRNA synthetase regulates epithelial expression of mesenchymal markers and extracellular matrix proteins: Implications for idiopathic pulmonary fibrosis [J]., 2018, 9: 1337.

[13] 董曉玉, 鐘濤, 葉元滋, 等. 血清HSP90α和癌組織基因HSP90AA1在肺癌中的高表達(dá)及預(yù)后價(jià)值 [J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2022, 57(7): 1034-1040.

[14] Niu M Y, Zhang B, Li L,. Targeting HSP90 inhibits proliferation and induces apoptosis through AKT1/ERK pathway in lung cancer [J]., 2021, 12: 724192.

[15] Suresh S, Chen B B, Zhu J F,. eIF5B drives integrated stress response-dependent translation of PD-L1 in lung cancer [J]., 2020, 1(5): 533-545.

[16] Wu J L, Chen G F, Wang W W,. GTPBP4: A new therapeutic target gene promotes tumor progression in non-small cell lung cancer via EMT [J]., 2022, 2022: 2164897.

[17] Ren Y, Li Y H, Tian D L. Role of the ABCE1 gene in human lung adenocarcinoma [J]., 2012, 27(4): 965-970.

[18] Wang L H, Lv X Y, Fu X H,. miR-153 inhibits the resistance of lung cancer to gefitinib via modulating expression of ABCE1 [J]., 2019, 25(4): 361-369.

[19] Wu Z, Tian Y, Yu Q,. The expression and correlation between chemokine CCL7 and ABCE1 in non-small cell lung cancer [J]., 2018, 16(4): 3004-3010.

[20] 余冬梅, 黃穎, 安輸, 等. SMC3對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和成球能力的影響 [J]. 中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 39(10): 1320-1325.

[21] Guo R, Lv Y, Ouyang Y,. The role of miR-497/EIF3A axis in TGFβ1-induced epithelial-mesenchymal transition and extracellular matrix in rat alveolar epithelial cells and pulmonary fibroblasts [J]., 2017, 118(10): 3401-3408.

[22] Li X W, Li X H, Du J,. Calcitonin gene-related peptide down-regulates bleomycin-induced pulmonary fibrosis [J]., 2016, 94(12): 1315-1324.

[23] 李先偉, 左東澤, 沈媛媛, 等. 降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)肺纖維化大鼠肺組織eIF3a、p27表達(dá)的影響 [J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2017, 33(1): 16-21.

[24] Yang Y, Huang T Y, Fan Y H,. Significance of spliceosome-related genes in the prediction of prognosis and treatment strategies for lung adenocarcinoma [J]., 2022, 2022: 1753563.

[25] Blijlevens M, Komor M A, Sciarrillo R,. Silencing core spliceosome Sm gene expression induces a cytotoxic splicing switch in the proteasome subunit beta 3 mRNA in non-small cell lung cancer cells [J]., 2020, 21(12): 4192.

[26] Liu K X, Liu D, Feng Y,. Spliceosome-associated protein 130: A novel biomarker for idiopathic pulmonary fibrosis [J]., 2020, 8(16): 986.

[27] Dobrinskikh E, Hennessy C E, Kurche J S,. Epithelial endoplasmic reticulum stress enhances the risk of Muc5b-associated lung fibrosis [J]., 2023, 68(1): 62-74.

[28] Deng J L, He Y Q, Sun G C,. Tanreqing injection protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis via inhibiting STING-mediated endoplasmic reticulum stress signaling pathway [J]., 2023, 305: 116071.

[29] 李瑞琴, 金艷, 李偉, 等. 桂附地黃丸抗大鼠肺纖維化的作用及對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2016, 34(12): 2938-2940.

[30] Barber D L, Wherry E J, Masopust D,. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection [J]., 2006, 439(7077): 682-687.

[31] Ji M, Liu Y, Li Q,. PD-1/PD-L1 pathway in non-small-cell lung cancer and its relation with EGFR mutation [J]., 2015, 13: 5.

[32] 陳則圣, 吳一鳴, 周婷, 等. PD-1分子調(diào)控肺纖維化的機(jī)制進(jìn)展及其在矽肺病研究中的展望 [J]. 公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué), 2022, 33(4): 118-123.

[33] 陳云坤, 劉煌, 張鳳, 等. 小柴胡湯合桂枝茯苓丸治療慢性阻塞性肺疾病急性加重期的臨床研究 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2022, 33(2): 422-424.

[34] 楊依, 陳凡, 馮瑞興, 等. 茯苓酸對(duì)小鼠急性放射性肺損傷的防護(hù)作用機(jī)制 [J]. 中國(guó)高原醫(yī)學(xué)與生物學(xué)雜志, 2022, 43(4): 268-274.

[35] 張海琴, 劉瑞芬. 桂枝茯苓膠囊對(duì)慢性盆腔炎大鼠T細(xì)胞亞群和紅細(xì)胞免疫功能的影響 [J]. 中藥藥理與臨床, 2013, 29(2): 6-8.

[36] 周禹, 隗雅姿, 楊天明, 等. 雷公藤紅素作用于HSP60抗肺纖維化的靶點(diǎn)研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2023, 58(3): 688-694.

[37] 呂秀紅, 郭瑞珍, 刁路明, 等. 雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的體外抑制作用的研究 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2007, 23(2): 207-210.

[38] 馬秀琴, 黃茂, 郭錫熔, 等. 雷公藤多甙對(duì)哮喘大鼠肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶9及其抑制劑1表達(dá)的影響 [J]. 中國(guó)臨床康復(fù), 2005, 9(43): 117-119.

[39] 徐資怡, 石金鳳, 鮮靜, 等. 雷公藤紅素單用和聯(lián)用抗腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4372-4385.

[40] 徐成波, 鄭瑞璣, 廖斌, 等. 雷公藤內(nèi)酯醇通過(guò)CHOP/BCL-2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡 [J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2022, 38(7): 1274-1282.

[41] Abdin A A, Hasby E A. Modulatory effect of celastrol on Th1/Th2 cytokines profile, TLR2 and CD3+T-lymphocyte expression in a relapsing-remitting model of multiple sclerosis in rats [J]., 2014, 742: 102-112.

[42] Ji W, Li H, Gao F,. Effects ofglycosides on interleukin-17 and CD4+CD25+CD127 low regulatory T-cell expression in the peripheral blood of patients with ankylosing spon-dylitis [J]., 2014, 2(4): 517-520.

Analysis of key genes and immune cell infiltration of nonspecific interstitial pneumonia and prediction of traditional Chinese medicine

TIAN Ren-wei, ZHANG Shao-qian, TAI He-bei, ZHANG Ya-ting, CHEN Ming-zhu, LUO Chao, WU Wen-li, WU Ning

Laboratory of Chemistry and Biochemistry, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China

To explore the key genes, pathogenesis, immune cell infiltration level and potential treatment of non-specific interstitial pneumonia.The gene chip GSE110147 was obtained from GEO database, and the differentially expressed genes were screened by R language “l(fā)imma” and other related expansion packages. The protein interaction network map was constructed by STRING and Cytoscape software, and the key genes were screened. After the key genes were verified by gene chip GSE101286, GO function enrichment and KEGG pathway analysis were carried out by using expansion packages such as R language "clusterProfiler" and GlueGO plug-ins in Cytoscape software, and the immune cell infiltration pattern was analyzed based on CIBERSORT deconvolution algorithm. Finally, the key genes were introduced into Coremine Medical Database to predict the related traditional Chinese medicine.A total of 407 differential genes and 15 key genes such as HSP90AA1, EIF5B and RPS13 were screened. GO analysis showed that nonspecific interstitial pneumonia was highly correlated with shearing body and translation process, while KEGG enrichment showed that nonspecific interstitial pneumonia was most closely related to RNA splice body pathway and endoplasmic reticulum protein processing pathway. Immune cell infiltration analysis showed that the infiltration levels of resting CD4+memory T cells and eosinophils in patients with nonspecific interstitial pneumonia were higher, while the infiltration levels of CD8+T cells, plasma cells, activated NK cells and M1 macrophages were lower. Through the screening of key genes, 18 kinds of traditional Chinese medicine were screened, among which Leigongteng (Hook. f.) and Fuling [(Schw.) Wolf] have great therapeutic potential.This study screened the key genes of non-specific interstitial pneumonia through bioinformatics methods, identified the potential treatment of traditional Chinese medicine, and provided a new direction for the pathogenesis of non-specific interstitial pneumonia, new treatment targets and new drug research and development.

nonspecific interstitial pneumonia; bioinformatics; key genes; immune infiltration;Hook. f.;(Schw.) Wolf

R285

A

0253 - 2670(2023)15 - 4934 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.019

2023-04-11

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（S202210660105）

田仁偉，男，本科在讀，主要從事肺部疾病的分子機(jī)制研究。E-mail: 1181930691@qq.com

通信作者：吳 寧，女，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事貴州特色藥用植物防病抗病機(jī)制的研究、肺部相關(guān)疾病的藥物治療。E-mail: wuning@gmc.edu.cn

[責(zé)任編輯 潘明佳]