馬文賢,黃 瓊,董振耀

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,在全球癌癥中排名第十,已成為世界日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。盡管放化療等治療手段在OSCC治療中取得極大的進(jìn)步,但由于其高復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率,病人的預(yù)后仍不容樂(lè)觀,因此了解其發(fā)生機(jī)制并開(kāi)發(fā)新型治療藥物十分迫切[2]。魚(yú)藤酮作為一種從豆科魚(yú)藤屬植物根中提取到的有毒黃酮類(lèi)化合物,多作為植物性殺蟲(chóng)劑使用,但近期研究[3]表明其能夠抑制肺癌、肝癌等癌細(xì)胞的增殖[3]。還有研究[4-5]表明魚(yú)藤酮類(lèi)化合物魚(yú)藤素能抑制頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的增殖。酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription 3,JAK/STAT3)信號(hào)通路已被發(fā)現(xiàn)其參與癌細(xì)胞的增殖、侵襲及腫瘤血管生成,激活該途徑可促進(jìn)OSCC的惡性表型[6]。魚(yú)藤酮已被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)細(xì)胞中能夠抑制JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[7],但其是否可通過(guò)JAK/STAT3信號(hào)通路影響OSCC細(xì)胞的增殖和凋亡還未可知,因此本研究通過(guò)對(duì)其探究,以期為魚(yú)藤酮在OSCC中治療機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 魚(yú)藤酮(貨號(hào):D2028)購(gòu)自上海寶曼生物科技有限公司;SCC25細(xì)胞系(貨號(hào):DA-C5308)購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司;青霉素-鏈霉素(貨號(hào):LM1200K)購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;胰酶溶液(貨號(hào):PYG0065)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;胎牛血清(貨號(hào):164210-500)、DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào):PM150210)購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司;AG490、MTT檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗抗體(貨號(hào):M00132-EPI、BTN111105、K12862、WE0381-QAN)購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;蛋白提取試劑盒(貨號(hào):CD-13559-ML)購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司;兔抗β-actin、caspase-3、Bax、JAK2、p-JAK2、p-STAT3、STAT3(貨號(hào):4970、9661、2772、3230、3771、9145、4904)購(gòu)自Cell Signaling Technology;兔抗c-Myc、CyclinD1抗體(貨號(hào):ab32072、ab16663)購(gòu)自abcam;Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection試劑盒(貨號(hào):A211-01/02)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。iBright蛋白免疫印跡成像系統(tǒng)購(gòu)自賽默飛世爾科技;CytoFLEX流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) OSCC SCC25細(xì)胞接種到含胎牛血清10%、100 U/mL青霉素-100 mg/mL鏈霉素DMEM培養(yǎng)基中后置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2 d更換一次培養(yǎng)基直至細(xì)胞融合至80%左右后通過(guò)胰酶消化進(jìn)行傳代。

1.2.2 MTT法檢測(cè)SCC25細(xì)胞活力 將SCC25細(xì)胞分為對(duì)照組、低濃度魚(yú)藤酮組(5 μmol/L)、中濃度魚(yú)藤酮組(10 μmol/L)、高濃度魚(yú)藤酮組(20 μmol/L)[8]、JAK2抑制劑AG490組(40 μmol/L AG490)[9],以5×103個(gè)/孔的密度(重復(fù)5孔,每孔100 μL)在96孔板中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,分別添加相應(yīng)劑量魚(yú)藤酮和AG490培養(yǎng)48 h后添加MTT(5 mg/mL,20微升/孔),4 h后棄上清液培養(yǎng)液加入DMSO 100 μL,震蕩直至MTT反應(yīng)結(jié)晶充分溶解后在490 nm處測(cè)定吸光度(OD)值,計(jì)算SCC25細(xì)胞存活率(%)=[(OD處理組-OD空白對(duì)照組)/(OD對(duì)照組-OD空白對(duì)照組)]×100%。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SCC25細(xì)胞的增殖 將各組SCC25細(xì)胞以5×102個(gè)/孔的密度(重復(fù)5孔)接種至6孔板中培養(yǎng),貼壁后添加相應(yīng)劑量魚(yú)藤酮和AG490進(jìn)行處理,直至培養(yǎng)到克隆細(xì)胞肉眼可見(jiàn)后棄上清,多聚甲醛(4%)進(jìn)行15 min固定后1%結(jié)晶紫溶液染色10 min,流水沖洗、晾干并隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行克隆細(xì)胞計(jì)數(shù)(細(xì)胞集落>50個(gè))。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SCC25細(xì)胞凋亡情況 胰酶消化各組已處理培養(yǎng)48 h后的SCC25細(xì)胞,PBS洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度(5×105個(gè)/孔),添加Annexin V-FITC和PI各5 μL后混勻并避光孵育15 min,1 h內(nèi)于流式儀觀察SCC25細(xì)胞凋亡情況(n=5)。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)SCC25細(xì)胞蛋白表達(dá)情況 RIPA裂解液于冰上裂解各組SCC25細(xì)胞后,通過(guò)BCA蛋白試劑盒檢測(cè)細(xì)胞總蛋白含量;SDS-PAGE凝膠電泳后低溫轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2 h后,一抗4 ℃(兔抗β-actin、c-Myc、CyclinD1、caspase-3、Bax、JAK2、p-JAK2、p-STAT3、STAT3,1∶2 000)孵育過(guò)夜,PBS清洗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)孵育1 h后于蛋白凝膠成像儀定量分析各蛋白含量(n=5)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析和 SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)魚(yú)藤酮對(duì)SCC25細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組比較,低濃度魚(yú)藤酮組、中濃度魚(yú)藤酮組、高濃度魚(yú)藤酮組SCC25細(xì)胞存活率顯著降低,且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05);與高濃度魚(yú)藤酮組相比,AG490組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 不同濃度魚(yú)藤酮及AG490對(duì)SCC25細(xì)胞活力的影響

2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)魚(yú)藤酮對(duì)SCC25細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較,低濃度魚(yú)藤酮組、中濃度魚(yú)藤酮組、高濃度魚(yú)藤酮組SCC25克隆細(xì)胞數(shù)顯著降低,且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05～P<0.01);與高濃度魚(yú)藤酮組相比,AG490組克隆細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖1、表2)。

表2 不同濃度魚(yú)藤酮及AG490對(duì)SCC25細(xì)胞增殖的影響

2.3 魚(yú)藤酮對(duì)SCC25細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較,低濃度魚(yú)藤酮組、中濃度魚(yú)藤酮組、高濃度魚(yú)藤酮組SCC25細(xì)胞早期和晚期凋亡率顯著增加,且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05～P<0.01);與高濃度魚(yú)藤酮組相比,AG490組細(xì)胞早期和晚期凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表3、圖2)。

表3 不同濃度魚(yú)藤酮及AG490對(duì)SCC25細(xì)胞凋亡的影響

2.4 魚(yú)藤酮對(duì)SCC25細(xì)胞中增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,低濃度魚(yú)藤酮組、中濃度魚(yú)藤酮組、高濃度魚(yú)藤酮組SCC25細(xì)胞內(nèi)c-Myc、CyclinD1表達(dá)水平均顯著降低,而caspase-3、Bax表達(dá)水平均顯著增加,且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05～P<0.01);與高濃度魚(yú)藤酮組相比,AG490組細(xì)胞內(nèi)c-Myc、CyclinD1、 caspase-3、Bax表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖3、表4)。

表4 不同濃度魚(yú)藤酮及AG490對(duì)SCC25細(xì)胞中增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 魚(yú)藤酮對(duì)JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,低濃度魚(yú)藤酮組、中濃度魚(yú)藤酮組、高濃度魚(yú)藤酮組SCC25細(xì)胞內(nèi)p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平呈劑量依賴(lài)性顯著降低(P<0.05～P<0.01);與高濃度魚(yú)藤酮組相比,AG490組細(xì)胞內(nèi)p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖4、表5)。

表5 不同濃度魚(yú)藤酮及AG490對(duì)JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

頭頸部癌癥在世界惡性腫瘤中排名第六,而OSCC占其中的95%以上,其最致命的原因是其從形成腫瘤開(kāi)始,癌細(xì)胞就可遠(yuǎn)程轉(zhuǎn)移至身體其他部位形成新腫瘤,最終導(dǎo)致病人5年預(yù)后生存率不足50%[10]。每年有近300萬(wàn)的OSCC新病人出現(xiàn),其發(fā)生發(fā)展是原癌基因的激活和抑癌基因的喪失共同作用的結(jié)果。放化療綜合治療已成為治療癌癥的主要手段,但由于化療藥物耐藥性及藥物不良反應(yīng)的出現(xiàn),導(dǎo)致OSCC病人仍出現(xiàn)五年預(yù)后生存不良現(xiàn)象,因此尋找新型治療藥物十分必要[11]。

魚(yú)藤酮是從豆科植物中提取出的一種線粒體復(fù)合體Ⅰ抑制劑,其已顯示出通過(guò)誘導(dǎo)肺癌[12]、乳腺癌[13]等癌細(xì)胞凋亡而具有抗癌活性。在肺癌A549細(xì)胞中,魚(yú)藤酮通過(guò)促進(jìn)活性氧生成促進(jìn)細(xì)胞自噬及增加自噬通量[12-13]。魚(yú)藤酮在結(jié)腸癌異體移植小鼠中通過(guò)抑制PI3K/AKT途徑來(lái)抑制腫瘤增長(zhǎng)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]。神經(jīng)酰胺水平增加可激活A(yù)MP依賴(lài)的蛋白激酶,以此磷酸化Ulk1,導(dǎo)致細(xì)胞自噬的發(fā)生,而魚(yú)藤酮類(lèi)化合物魚(yú)藤素可通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺生成來(lái)促進(jìn)HNSCC細(xì)胞凋亡[15]。c-Myc、CyclinD1作為常見(jiàn)的促增殖相關(guān)蛋白,而caspase-3、Bax作為促凋亡相關(guān)蛋白,在癌細(xì)胞的增殖、凋亡過(guò)程中發(fā)揮有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),魚(yú)藤酮可呈劑量依賴(lài)性降低SCC25細(xì)胞存活率、克隆細(xì)胞數(shù)、c-Myc、CyclinD1表達(dá)水平,而增加細(xì)胞凋亡率、caspase-3、Bax表達(dá)水平。該結(jié)果表明魚(yú)藤酮在OSCC中能夠通過(guò)抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而起到抗癌作用。

細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移的紊亂是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要引發(fā)因素[16]。JAK/STAT3信號(hào)通路在腫瘤中參與細(xì)胞增殖、侵襲及血管生成已被多項(xiàng)研究所證明[6,17]。JAK作為一種酪氨酸激酶可通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活STAT,而STAT3是STAT家族成員之一,可在細(xì)胞質(zhì)中被JAK1/2所磷酸化,并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用[6,18]。JAK/STAT3激活可通過(guò)促進(jìn)結(jié)直腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化增加癌癥的發(fā)生、化學(xué)抗性及癌癥干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力[19]。甘草查爾酮H通過(guò)抑制JAK/STAT3信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)OSCC凋亡,抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[20]。有研究[21]發(fā)現(xiàn),魚(yú)藤酮在神經(jīng)細(xì)胞中可抑制干擾素-γ介導(dǎo)的JAK/STAT1的激活。本研究發(fā)現(xiàn),魚(yú)藤酮能夠顯著降低p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達(dá)。該結(jié)果表明,在OSCC中,魚(yú)藤酮可能通過(guò)抑制JAK2及STAT3的磷酸化來(lái)抑制JAK/STAT3信號(hào)通路的激活。本研究還發(fā)現(xiàn),與高濃度魚(yú)藤酮組相比,AG490組細(xì)胞存活率、克隆細(xì)胞數(shù)、c-Myc、CyclinD1、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、caspase-3、Bax表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果表明,魚(yú)藤酮與AG490作用效果相同,魚(yú)藤酮對(duì)SCC25細(xì)胞增殖的抑制和凋亡的促進(jìn)可能與其抑制JAK/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述,魚(yú)藤酮可能通過(guò)抑制JAK/STAT3信號(hào)通路來(lái)抑制OSCC細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡,以此在OSCC中起到抑癌作用。本研究不僅對(duì)魚(yú)藤酮在OSCC中的治療機(jī)制研究具有重要意義,還對(duì)疾病新型治療藥物的尋找具有一定參考價(jià)值,但關(guān)于魚(yú)藤酮在OSCC中對(duì)該通路下游機(jī)制的影響還需進(jìn)一步研究。