葉兵兵，曹岳均，劉銳蘭，吳登宇，楊創(chuàng)明，肖啟程

（四川民族學(xué)院康巴牦牛研究中心，四川康定 626001）

隨著醫(yī)學(xué)的進步，人們對生物安全越來越重視，抗生素的發(fā)現(xiàn)大大推動了醫(yī)學(xué)的進步，但濫用抗生素也帶來了耐藥性、超級細菌、藥物殘留等諸多問題。益生菌制劑作為抗生素的替代品具有較高潛力。甘孜州牦牛是高海拔地區(qū)的特有牛種，其獨特的生存環(huán)境對益生菌制劑的穩(wěn)定性要求較高。枯草芽孢桿菌分布較廣，牛羊等食草動物的糞便中均能成功分離培養(yǎng)出枯草芽孢桿菌（徐淑琴等，2022 ；王國艷等，2021）?？莶菅挎邨U菌益生菌制劑是一種綠色、無污染、無殘留的微生物制劑（湯保貴等，2007 ；郭興華，2002）。芽孢桿菌在生長過程中產(chǎn)生的多種消化酶能促進宿主胃腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收（吳孔陽等，2020）。芽孢桿菌產(chǎn)生的細菌素對常見細菌有一定的抑制作用，可以增強宿主抵抗力（Khochamit 等，2015）。因此，本試驗旨在利用選擇培養(yǎng)基從牦牛糞便中分離培養(yǎng)出抗逆性強，穩(wěn)定性好的菌種以確定牦牛源枯草芽孢桿菌使用的可行性，為甘孜州牦牛專用益生菌制劑的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)備與試劑 超凈工作臺（型號JJ-CJ-2F），高壓滅菌鍋（購自廈門致微儀器有限公司），生化培養(yǎng)箱（購自上海博迅實業(yè)有限公司），電泳儀（購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），高速離心機（天津廣豐科技有限公司），全動內(nèi)校電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司），水浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），渦旋振蕩儀等實驗儀器均由四川民族學(xué)院農(nóng)學(xué)院實驗樓提供。

營養(yǎng)瓊脂，營養(yǎng)肉湯，瓊脂，可溶性淀粉瓊脂，LB 瓊脂（Miller），沙門氏菌生化鑒定管，枯草芽孢桿菌生化鑒定管，細菌基因組DNA 小量提取試劑盒/ 離心柱型，V-P 試劑，盧戈氏碘液，硝酸鹽還原試劑（亞硝酸鹽試劑），細菌基因組提取 蛋白酶K 由齊一生物科技（上海）有限公司提供。麥康凱瓊脂，SS 瓊脂由青島海博生物技術(shù)有限公司提供。TS-GelRed 核酸染料Ver.2，MRS 瓊脂培養(yǎng)基干粉，1×TAE 速溶顆粒，瓊脂糖由擎科生物技術(shù)有限公司提供。通用引物由成都生工生物工程有限公司提供。

1.2 樣品的采集和粗處理 新鮮牦牛糞便采自甘孜州新都橋地區(qū)放牧的牦牛，將采集的樣品及時裝入無菌密封袋內(nèi)存放，作好編號以及標記。采樣結(jié)束后用冰袋保存在保溫箱運輸，24 h 內(nèi)送到實驗室-70℃左右冷凍保存。

1.3 枯草芽孢桿菌的分離 將冰箱內(nèi)冷凍保存的牦牛糞便樣品稱取5 g 放入裝有45 mL 蒸餾水的三角瓶中，振蕩混勻，小火加熱三角瓶至沸騰后維持15 min。將三角瓶靜置冷卻，待瓶中上清液澄清后吸取0.1 mL 上清液加入裝有4.5 mL 蒸餾水的試管中，配成1 ：100 濃度懸液，濃度梯度稀釋102和103，分別吸取0.2 mL 涂布到MRS 培養(yǎng)基和可溶性淀粉培養(yǎng)基中（每種稀釋度做3 個平行對照），將培養(yǎng)基置于37℃的恒溫培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)12 ～24 h 后，挑取平板上的單個、無規(guī)則、隆起、表面粗糙有褶皺的疑似菌落進行革蘭氏染色鏡檢（謝曉佩等，2021 ；辛國芹等，2021 ；白海等，2020）。

2 枯草芽孢桿菌的鑒定

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 分別觀察各類培養(yǎng)皿上的菌落形態(tài)特征，做好記錄。挑取疑似枯草芽孢桿菌的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，置于油鏡下觀察細菌形態(tài)。

2.2 生化鑒定 使用枯草芽孢桿菌套裝生化鑒定管對分離純化后的實驗菌種進行生化鑒定。

2.3 分子鑒定 使用細菌基因組DNA 提取試劑盒進行DNA 提取。

3 枯草芽孢桿菌的穩(wěn)定性試驗

3.1 高溫耐受性試驗 將待測菌液分裝于潔凈試管中，每管盛裝10 mL 菌液，每份菌液分裝4 個試管。取4 個試管中的任意3 個試管，分別置于85、90、95、100℃水浴鍋中恒溫水浴30 min，保留1 個試管置于室溫作對照組。水浴結(jié)束后分別使用移液槍吸取200 μL 菌液在LB 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進行涂布。涂布完成后將LB 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基放置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24 h。重復(fù)上述試驗3 次，計算試驗菌株分別在85、90、95、100℃下的存活率。

3.2 豬膽鹽試驗 使用豬膽鹽溶液配制濃度分別為0.03、0.1、0.2 和0.3 g/100 mL 的選擇培養(yǎng)基各3 個，高溫高壓蒸汽滅菌后分別接種待測菌液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。計算試驗菌株分別在濃度為0.03、0.1、0.2 和0.3 g/100 mL 豬膽鹽溶液環(huán)境下的存活率。

4 結(jié)果與分析

4.1 枯草芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 試驗發(fā)現(xiàn)，LB 培養(yǎng)基中生長出黃白色、皺襞樣、不光滑菌落，符合枯草芽孢桿菌在LB 培養(yǎng)基上的菌落特征（見圖1）。挑取符合枯草芽孢桿菌菌落特征的單個菌落，革蘭氏染色為藍色、棒狀或桿狀細菌（見圖2）（東秀珠等，2001）。

圖1 MRS 培養(yǎng)基上的枯草芽孢桿菌

圖2 革蘭氏染色為陽性

4.2 枯草芽孢桿菌的生化鑒定結(jié)果 由表1 可知，V-P 測定管、硝酸鹽測定管、淀粉水解管、檸檬酸鹽利用管、D-木糖發(fā)酵管、L-阿拉伯糖發(fā)酵管、甘露醇發(fā)酵管、7% 氯化鈉生長管和pH 5.7 生長管結(jié)果呈陽性；丙酸鹽利用管結(jié)果呈陰性。綜合試驗結(jié)果，初步鑒定試驗菌種為枯草芽孢桿菌。

表1 生化鑒定結(jié)果

4.3 枯草芽孢桿菌的分子鑒定結(jié)果 由圖3 可知，經(jīng)16SrDNA 擴增后的DNA 在瓊脂糖凝膠中條帶大小為1500 bp 左右，與枯草芽孢桿菌PCR條帶大小一致（巴翠玉等，2017）。

圖3 DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

4.4 高溫耐受性試驗結(jié)果 由圖4 可知，作用于同一溫度，不同的枯草芽孢桿菌耐受程度不同；同一枯草芽孢桿菌的存活率隨溫度上升而降低。BS-3 在高溫環(huán)境中存活率較高，高溫耐受性較好。

圖4 高溫耐受性試驗結(jié)果

4.5 豬膽鹽試驗結(jié)果 由圖5 可知，隨著豬膽鹽濃度上升，枯草芽孢桿菌存活率均有所下降，在0.3 g/100 mL 豬膽鹽濃度培養(yǎng)基的試驗環(huán)境下存活率均在50%以上。

圖5 豬膽鹽試驗結(jié)果

5 討論

枯草芽孢桿菌作為目前益生菌制劑中提取成本與提取難度較低的一種益生菌，是目前制作益生菌制劑的不二之選。本試驗從甘孜州牦牛糞便中進行菌株分離培養(yǎng)，并進行膽鹽耐受性試驗和高溫耐受性試驗，成功獲取到穩(wěn)定性較好的枯草芽孢桿菌菌株。

Fuller 等（1975）研究表明，將益生菌應(yīng)用于提取源的物種時更加有效。牦牛源枯草芽孢桿菌應(yīng)對牦牛腹瀉性疾病更有效。

本試驗最終培養(yǎng)出BS-1、BS-2、BS-3、BS-4，形態(tài)學(xué)鑒定及生化鑒定為枯草芽孢桿菌。

在膽鹽耐受性試驗中，膽鹽通過降低菌體表面張力，使其細胞膜損壞或菌體直接裂解從而達到抑菌效果。試驗選用加入0.03%，0.1%，0.2%，0.3% 濃度豬膽鹽的培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h 左右，試驗結(jié)果顯示，隨著豬膽鹽濃度上升，枯草芽孢桿菌的存活率下降。動物體內(nèi)的膽鹽含量不斷變化，但平均值一般為0.03%（周明等，2013），故篩選耐膽鹽菌種時一般以0.3% 作為標準。在本試驗中，枯草芽孢桿菌在膽鹽含量0.03% 的培養(yǎng)基上存活率約為91.1%，濃度提高至0.3% 時存活率約為58.9%，存活率均在50% 以上，具有較好的膽鹽耐受性。

在高溫耐受性試驗中，枯草芽孢桿菌存活率隨溫度升高而降低，85℃時存活率在80% 左右，但溫度升高到100℃時，耐受性最好的BS-3 存活率僅為8.3%，BS-1、BS-5、BS-6 三株菌株在100 ℃的環(huán)境下無法存活。一般微生物制劑的加工溫度為70 ～80℃（周明，2010），牛瘤胃的溫度則為37 ～40℃。試驗中，枯草芽孢桿菌在85℃高溫下處理30 min 仍能保持80%左右的存活率，由此看來，枯草芽孢桿菌可以作為飼料益生菌添加入牦牛飼料中。

6 結(jié)論

從甘孜州牦牛糞便中分離出4 株枯草芽孢桿菌，經(jīng)鑒定均為枯草芽孢桿菌，編號為BS-1，BS-2，BS-3，BS-4，其中BS-3 整體耐受特性最好，在4 株菌株中穩(wěn)定性最高、抗逆性最強，BS-3作為枯草芽孢桿菌益生菌制劑具有較高潛力。