戴慶福 王玉霞 曹慧敏

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 龍巖 364000）

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，病死率極高。有研究表明，全球每年至少有610 000死亡病例，而其中約半數(shù)病例發(fā)生在中國[1]。因此，研究肝癌發(fā)生、發(fā)展和藥物作用過程中的分子機(jī)制以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)此類腫瘤，發(fā)展針對(duì)肝癌的早期診斷技術(shù)以有效提高患者生存率具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義[2]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多種生物活性分子共同作用的結(jié)果。這些重要的活性分子既包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子，又包括各種金屬離子、自由基、激素等各種小分子。在肝癌發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中，細(xì)胞內(nèi)這些物質(zhì)或者相互轉(zhuǎn)化，或者相互影響、協(xié)同作用，共同參與細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)反應(yīng)和信號(hào)通路[3]。另外，當(dāng)存在某些外界刺激或藥物作用時(shí)，多種分子參與的信號(hào)通路會(huì)被抑制甚至阻斷，或者產(chǎn)生新的信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞功能損傷乃至凋亡[4]。在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中，三結(jié)構(gòu)域蛋白28（Trim28）磷酸化發(fā)揮著極為重要的作用[5]。有研究表明[6]，細(xì)胞異染色質(zhì)DNA損傷修復(fù)和Trim28磷酸化相關(guān)，這一特性會(huì)將一些腫瘤對(duì)化療的敏感性降低。本研究探討了Trim28磷酸化在肝癌細(xì)胞DNA損傷時(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞生存能力的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 購買美國Biolegend公司生產(chǎn)的鼠β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體、鼠Trim 28單克隆抗體以及鼠Trim 28 phosphorylase S473單克隆抗體，美國Arigobio公司生產(chǎn)的辣根過氧化物酶（HRP）羊抗鼠多克隆IgG，上海Absin公司生產(chǎn)的SB203580，廣州安邦生物公司生產(chǎn)的其他主要試劑及材料，美國Spectrolinker公司生產(chǎn)的紫外交聯(lián)儀×11000，美國Biotek公司生產(chǎn)的酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 依據(jù)處理措施分為對(duì)照組、sb203580組、UV組、sb203580+UV組4組。購買武漢普諾賽公司生產(chǎn)的人肝癌Hepg2細(xì)胞，細(xì)胞使用德國賽默飛公司生產(chǎn)的0.5%雙抗+10%胎牛血清+RPMI1640培養(yǎng)基配置成的培養(yǎng)液，置于二氧化碳溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)（條件：37 ℃、5%），細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)消化道離心傳代，消化過程中將0.25%胰酶充分利用起來。

1.2.2 Western blot試驗(yàn)

1.2.2.1 分組 將4組細(xì)胞隨機(jī)設(shè)置出來，在6 cm2培養(yǎng)皿中使各組細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)90%以上，將3組細(xì)胞隨機(jī)選取出來，在100 μJ/cm2紫外線下放置照射，照射后2 h、12 h、24 h分別將細(xì)胞蛋白提取出來。另將對(duì)照組設(shè)置出來，僅將細(xì)胞蛋白提取出來，并不做任何處理。

1.2.2.2 處理 在6 cm2培養(yǎng)皿中sb203580+UV組Hepg2細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)90%以上時(shí)，將含10 μmol/L sb203580培養(yǎng)液加入試驗(yàn)組細(xì)胞中，在37 ℃的溫度下孵育1 h，然后和UV組細(xì)胞在100 μJ/cm2紫外線下同時(shí)放置照射，將10 μmol/L sb203580培養(yǎng)液加入sb203580+UV組細(xì)胞，將正常培養(yǎng)液加入U(xiǎn)V組細(xì)胞，在37 ℃的溫度下繼續(xù)孵育2 h后將蛋白提取出來。另將對(duì)照組細(xì)胞設(shè)置出來，不做任何處理，相同孵育時(shí)間后將蛋白提取出來。

1.2.2.3 蛋白提取 對(duì)細(xì)胞滴注RIPA裂解液進(jìn)行裂解，用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度；同時(shí)采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）儀進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)膜，并于室溫下用5%的牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h，之后在4 ℃溫度下孵育1∶500鼠β-actin單克隆抗體、1∶500鼠Trim 28 phosphorylase S473單克隆抗體、1∶1 000鼠Trim 28單克隆抗體過夜。常規(guī)洗膜后加入RP標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白二抗（1∶5 000稀釋），室溫下孵育2 h。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）試劑盒對(duì)蛋白顯色。

1.2.2.4 圖像分析 采用Image J軟件進(jìn)行蛋白表達(dá)量的半定量檢測(cè)分析，用灰度值表示，并計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，即目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值，重復(fù)3次。

1.2.3 MTT試驗(yàn)

1.2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 種板6 cm2培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)90%時(shí)常規(guī)消化，離心3 min，半徑、速率分別為16 cm、1 000 r/min，計(jì)數(shù)細(xì)胞。依據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，在96孔板上接種懸液，每孔200 μL，細(xì)胞數(shù)為4 000個(gè)左右。

1.2.3.2 細(xì)胞處理 細(xì)胞貼壁后1 d處理細(xì)胞，組別的劃分與Western blot試驗(yàn)相同，依據(jù)處理措施分為對(duì)照組、sb203580組、UV組、sb203580+UV組4組，每組6孔，分別不做處理、將含10 μmol/L sb203580培養(yǎng)液加入、10 μJ/cm2紫外線照射處理、將含10 μmol/L sb203580培養(yǎng)液加入并10 μJ/cm2紫外線照射處理。

1.2.3.3 細(xì)胞生存率 處理后1 d、2 d、3 d分別將MTT加入到各組細(xì)胞中，孵育4 h后將二甲基亞砜（DMSO）加入，每孔100 μL。采用酶標(biāo)儀對(duì)各孔570 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值進(jìn)行測(cè)定。比較對(duì)照組和sb203580組同時(shí)間點(diǎn)的A值，細(xì)胞生存率=UA組和sb203580+UV組與對(duì)照組A值比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料（符合正態(tài)分布）用（）來描述，組間行t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫外線照射Hepg2細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)p-Trim28表達(dá)比較 UV組紫外線照射Hepg2細(xì)胞后2 h、12 h、24 h的p-Trim28表達(dá)逐漸降低（P＜0.05），照射后2 h、12 h的p-Trim28表達(dá)量均高于對(duì)照組（P＜0.05），但照射后24 h的p-Trim28表達(dá)量和對(duì)照組之間的差異不顯著（P＞0.05）。見表1。

表1 紫外線照射Hepg2細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)p-Trim28表達(dá)比較（）

表1 紫外線照射Hepg2細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)p-Trim28表達(dá)比較（）

2.2 不同處理?xiàng)l件下Trim28表達(dá)比較 對(duì)照組、UV組和sb203580+UV組Trim28表達(dá)量之間的差異均不顯著（P＞0.05）。見表2。

表2 不同處理?xiàng)l件下Trim28表達(dá)比較（）

表2 不同處理?xiàng)l件下Trim28表達(dá)比較（）

2.3 不同處理?xiàng)l件下p-Trim28（ser473）表達(dá)比較 UV組p-Trim28（ser473）表達(dá)量高于sb203580+UV組、對(duì)照組（P＜0.05），但sb203580+UV組、對(duì)照組p-Trim28（ser473）表達(dá)量之間的差異不顯著（P＞0.05）。見表3。

表3 不同處理?xiàng)l件下p-Trim28（ser473）表達(dá)比較（）

表3 不同處理?xiàng)l件下p-Trim28（ser473）表達(dá)比較（）

2.4 Trim28（ser473）磷酸化在Hepg2細(xì)胞DNA損傷時(shí)對(duì)細(xì)胞生存能力的影響分析 sb203580組、對(duì)照組處理后1 d、2 d、3 d的A值均逐漸升高（P＜0.05）；處理后1 d、2 d、3 d，sb203580組、對(duì)照組A值之間的差異均不顯著（P＞0.05）。sb203580+UV組、UV組照射后1 d、2 d、3 d的細(xì)胞存活率均逐漸降低（P＜0.05）；照射后1 d、2 d、3 d，sb203580+UV組細(xì)胞存活率均低于UV組（P＜0.05）。見表4、表5。

表4 sb203580對(duì)細(xì)胞生存能力的影響分析（）

表4 sb203580對(duì)細(xì)胞生存能力的影響分析（）

表5 sb203580抑制Trim28（ser473）磷酸化在Hepg2細(xì)胞DNA損傷時(shí)對(duì)細(xì)胞存活率的影響分析（）

表5 sb203580抑制Trim28（ser473）磷酸化在Hepg2細(xì)胞DNA損傷時(shí)對(duì)細(xì)胞存活率的影響分析（）

3 討 論

目前，細(xì)胞內(nèi)活性分子的檢測(cè)很多是基于細(xì)胞勻漿，這種檢測(cè)不能得到分子在細(xì)胞內(nèi)的空間信息，而且在進(jìn)行多組測(cè)定時(shí)無法針對(duì)同一個(gè)樣品或者同一個(gè)細(xì)胞，因此同一生物過程中多種分子之間精準(zhǔn)的關(guān)聯(lián)會(huì)被群體細(xì)胞的平均信息所掩蓋。活細(xì)胞熒光成像技術(shù)為觀察及認(rèn)識(shí)細(xì)胞內(nèi)多種活性分子參與的生物過程提供了重要工具。它可以實(shí)時(shí)原位的觀察細(xì)胞內(nèi)某一分子的含量、分布及其隨時(shí)間的變化。如果對(duì)細(xì)胞內(nèi)多種生物分子實(shí)現(xiàn)同時(shí)熒光標(biāo)記和成像，不僅能對(duì)細(xì)胞異質(zhì)性有所認(rèn)識(shí)，更重要的是可以在同一細(xì)胞內(nèi)對(duì)多種分子的相互作用進(jìn)行研究，進(jìn)而獲取群體細(xì)胞研究所掩蓋的真實(shí)精準(zhǔn)的多分子間關(guān)聯(lián)信息[7]。針對(duì)細(xì)胞內(nèi)多種生物分子熒光標(biāo)記，研究人員已設(shè)計(jì)開發(fā)了多種多樣的熒光探針，如基于靶標(biāo)識(shí)別產(chǎn)生熒光信號(hào)變化的有機(jī)小分子探針已被廣泛用于細(xì)胞內(nèi)活性氧簇、金屬離子、巰基化合物、NO和H2S等氣體分子的熒光成像；基于基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的多色熒光蛋白被用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的標(biāo)記和成像研究，該技術(shù)也因其對(duì)化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的卓越貢獻(xiàn)而獲得了2008年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；此外，基于納米材料和多種組裝技術(shù)的納米熒光探針因?yàn)槠鋬?yōu)異的發(fā)光性能和靈活多樣的組裝形式也被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)分子的標(biāo)記和熒光檢測(cè)。這些探針通過與靶標(biāo)分子的特異性作用，不斷點(diǎn)亮細(xì)胞內(nèi)的各種分子，使研究者看見了大量分子在細(xì)胞內(nèi)的含量和時(shí)空變化，并且不斷認(rèn)識(shí)了它們的生物功能[8]。然而，不管是對(duì)肝癌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路研究還是對(duì)其進(jìn)行早期診斷，所涉及的多種生物分子濃度差異很大，當(dāng)研究者用這些探針直接標(biāo)記含量較低的分子時(shí)，發(fā)現(xiàn)所得到的熒光信號(hào)往往很弱或者難以與背景區(qū)分。當(dāng)某種條件下這些分子濃度產(chǎn)生下調(diào)時(shí)，就更加難以獲取它們的熒光信號(hào)[9]。因此，發(fā)展基于信號(hào)放大的肝癌細(xì)胞內(nèi)多種活性分子同時(shí)高靈敏熒光成像方法具有十分重要的意義。

以DNA與目標(biāo)分子的特異性相互作用構(gòu)建生物分子的檢測(cè)方法已得到國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注和研究。此類方法可通過DNA堿基互補(bǔ)反應(yīng)、序列切割及構(gòu)型變換等實(shí)現(xiàn)多種類型生物分子的特異性識(shí)別[10]。如通過堿基互補(bǔ)原則設(shè)計(jì)可得到針對(duì)DNA、mRNA及miRNA的靶向探針，通過體外篩選技術(shù)（SELEX技術(shù)）可分別得到與不同蛋白質(zhì)、肽、激素等分子特異性結(jié)合的核酸適配體Aptamer或?qū)饘匐x子特異性識(shí)別的DNAzyme；利用細(xì)胞內(nèi)某些離子可引發(fā)特定DNA產(chǎn)生構(gòu)型變化。以此為基礎(chǔ)，通過對(duì)DNA探針的進(jìn)一步改造，使其除了能對(duì)目標(biāo)分子實(shí)現(xiàn)靶向識(shí)別外，還能夠參與后續(xù)各種DNA擴(kuò)增反應(yīng)如滾環(huán)擴(kuò)增（RCA），雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）等。這些反應(yīng)可以使目標(biāo)分子信號(hào)產(chǎn)生線性或者指數(shù)放大，提高檢測(cè)的靈敏度。由此可以看出，DNA探針和以此為基礎(chǔ)的各種DNA擴(kuò)增反應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)多種類型生物分子的特異性識(shí)別、信號(hào)放大具有很大的優(yōu)勢(shì)和潛力[11]。但是目前此類信號(hào)擴(kuò)增的檢測(cè)方法大多是基于細(xì)胞勻漿的檢測(cè)，而在活細(xì)胞水平上進(jìn)行生物分子成像的研究則報(bào)道較少。這主要是因?yàn)殒湢罱Y(jié)構(gòu)的DNA難以直接被細(xì)胞攝取，而且一些DNA的擴(kuò)增反應(yīng)涉及很多酶類分子，這些大分子也很難以直接進(jìn)入細(xì)胞，造成細(xì)胞對(duì)探針的有效攝取困難；另外，即使探針能夠借助某些方法進(jìn)入細(xì)胞，探針的細(xì)胞穿膜過程及定位，探針在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和傳感過程是否對(duì)細(xì)胞功能造成損傷等問題仍需詳細(xì)探究；當(dāng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)多組分進(jìn)行成像時(shí)，多個(gè)熒光信號(hào)光譜分辨問題及其輸出時(shí)間、強(qiáng)度差異性問題也是目前面臨的重大挑戰(zhàn)[12]。因此，針對(duì)以上問題和挑戰(zhàn)，構(gòu)建新型的基于DNA擴(kuò)增反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)生物分子信號(hào)放大和多組分同時(shí)熒光成像新方法，在活細(xì)胞水平上監(jiān)控肝癌細(xì)胞內(nèi)多種生物分子尤其是低濃度生物分子的濃度、時(shí)空變化和相互關(guān)聯(lián)信息，對(duì)進(jìn)一步研究此類疾病發(fā)生、發(fā)展的信號(hào)通路，藥物治療相關(guān)的分子機(jī)制以及進(jìn)行精準(zhǔn)的早期診療具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

有文獻(xiàn)顯示，Trim28的過度表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。目前，臨床還沒有完全弄清楚其機(jī)制[14]。Trim28是一種促癌因子，其異染色質(zhì)蛋白（HP1）結(jié)合域正常情況下可結(jié)合異染色質(zhì)，并形成異染色體固縮狀態(tài)，有利于保持基因組及轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性，在細(xì)胞DNA雙鏈損傷時(shí)，ser473（在HP1結(jié)合域分布）磷酸化會(huì)在激酶及ATM/Chkl/Chk2、p38/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/MK2等因子作用下松解異染色質(zhì)，暴露受損的DNA雙鏈，ATM對(duì)TopBP1、BRCA1等DNA修復(fù)蛋白進(jìn)行招募，修復(fù)DNA損傷，如在黑素瘤中MAGE C2和Trim28蛋白復(fù)合物形成，引發(fā)Trim28磷酸化，進(jìn)而對(duì)凋亡的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，從而為腫瘤發(fā)展提供有利條件[15]。本研究結(jié)果表明，UV組紫外線照射Hepg2細(xì)胞后2 h、12 h、24 h的p-Trim28表達(dá)逐漸降低，照射后2 h、12 h的p-Trim28表達(dá)量均高于對(duì)照組。UV組p-Trim28（ser473）表達(dá)量高于sb203580+UV組、對(duì)照組。sb203580組、對(duì)照組處理后1 d、2 d、3 d的A值均逐漸升高。sb203580+UV組、UV組照射后1 d、2 d、3 d的細(xì)胞存活率均逐漸降低；照射后1 d、2 d、3 d，sb203580+UV組細(xì)胞存活率均低于UV組，說明在肝癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)過程中，Trim28磷酸化可能參與其中，從而降低肝癌細(xì)胞對(duì)DNA損傷的敏感性。證實(shí)Trim28（set473）磷酸化在肝癌細(xì)胞Hep92細(xì)胞DNA損傷的情況下可能在DNA損傷修復(fù)中介入，對(duì)其進(jìn)行抑制能夠?qū)⒓?xì)胞的生存率進(jìn)一步降低。

綜上所述，對(duì)Trim28磷酸化進(jìn)行抑制，在肝癌細(xì)胞DNA損傷時(shí)可降低肝癌細(xì)胞的生存能力，值得重視。