孫志廣 劉艷 李景芳 周振玲 邢運高 徐波周群 王德榮 盧百關(guān) 方兆偉 王寶祥 徐大勇

（連云港市農(nóng)業(yè)科學院/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港222006；第一作者：zhiguangsun@126.com；*通訊作者：wbxrice@163.com；xudayong3030@sina.com）

隨著適宜直播水稻品種的成功培育和直播稻栽培技術(shù)水平的提高，加上種子萌發(fā)過程中提高對低氧的耐性有助于雜草的控制，資源和勞動力節(jié)約型的直播稻越來越受到種植戶的青睞[1-3]。土地的不平整和排水后的強降雨往往會導致直播稻播種后發(fā)生淹澇[4-5]。研究表明，土壤中O2含量超過3%才能滿足水稻對氧的正常吸收，O2含量超過5%水稻才能正常生長，而淹水6～10 h，稻田土壤中O2含量降至接近于0[6-7]。因此，淹澇會嚴重影響水稻種子的正常萌發(fā)，大幅降低直播稻的出苗率，進而造成稻田缺棵斷壟、苗稀苗弱，給直播稻的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)帶來嚴重威脅[8]。強萌發(fā)耐淹性種質(zhì)在低氧環(huán)境脅迫下胚芽鞘能夠迅速伸長，這種淹水誘導的胚芽鞘伸長是幫助淹水植物重新與空氣接觸的重要逃逸機制[9]。因此，提高萌發(fā)期水稻品種的耐淹性有助于改善水稻的出苗整齊度及出苗率。

如何快速準確篩選耐低氧萌發(fā)水稻種質(zhì)資源是培育萌發(fā)耐淹性水稻新品種和開展其遺傳機理研究的前提。建立簡便、高效而準確的萌發(fā)耐淹性鑒定方法，明確水稻種質(zhì)萌發(fā)耐淹性評價標準是篩選萌發(fā)耐淹性水稻種質(zhì)的重要環(huán)節(jié)。國內(nèi)外學者多采用水層隔絕空氣營造低氧環(huán)境，以淹水后的胚芽鞘長度為指標進行萌發(fā)耐淹性鑒定，該方法操作簡便、對設(shè)備要求不高，適合大規(guī)模種質(zhì)資源的篩選鑒定[10-12]。SUN 等[13]以30 ℃、10 cm 水深、萌發(fā)4 d 的胚芽鞘長為指標進行萌發(fā)耐淹性鑒定，在粳型雜草稻中克隆了決定低氧下強萌發(fā)的關(guān)鍵基因OsGF14h。王洋等[14]以30 ℃、5 cm 水深、萌發(fā)7 d 的胚芽鞘長為指標進行耐低氧萌發(fā)測定，在2 個水稻定位群體中檢測到8 個耐缺氧能力的QTL。JIANG等[15-16]以水溫30 ℃、水深20 cm、萌發(fā)5 d 后的胚芽鞘長為指標評價了359 份水稻種質(zhì)的低氧發(fā)芽能力，表明水稻種質(zhì)間存在著明顯的地域和秈粳差異。陳孫祿等[17]在28 ℃、密閉的離心管中以萌發(fā)7 d 后的胚芽鞘長為指標評價了256 份水稻種質(zhì)的萌發(fā)耐淹性，發(fā)現(xiàn)秈粳稻間的萌發(fā)耐淹性差異并不顯著。孫志廣等[18]以26 ℃、5 cm 水深、萌發(fā)7 d 的胚芽鞘長為指標完成191份種質(zhì)資源萌發(fā)耐淹性鑒定，篩選獲得12 份強萌發(fā)耐淹性種質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)種質(zhì)資源間的萌發(fā)耐淹能力沒有明顯的地域性差異。由此可見，以往評價不同水稻種質(zhì)萌發(fā)耐淹能力時，由于缺乏統(tǒng)一的萌發(fā)耐淹性評價體系，在淹水天數(shù)、淹水溫度、淹水深度等方面存在較大差異，導致各研究者之間的鑒定結(jié)果難以比較，不利于水稻萌發(fā)耐淹性研究工作的開展。因此，確立萌發(fā)耐淹性鑒定的適宜淹水深度、調(diào)查時間和環(huán)境溫度十分必要。

本研究利用20 份水稻種質(zhì)資源分析低氧環(huán)境不同梯度處理下（溫度、調(diào)查時間、淹水深度）水稻胚芽鞘的長度，明確了水稻萌發(fā)耐淹性鑒定適宜的淹水深度、溫度和最佳調(diào)查時間，建立了一種簡便高效的水稻萌發(fā)耐淹性鑒定評價方法，并利用該方法進行水稻萌發(fā)耐淹性種質(zhì)資源篩選，為水稻萌發(fā)耐淹性優(yōu)異種質(zhì)資源的發(fā)掘和創(chuàng)新利用提供有效方法和材料支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料共計160 份，其中20 份種質(zhì)用于水稻萌發(fā)耐淹性鑒定方法的建立，分別來自我國江蘇、浙江、天津、廣東、安徽、江西以及印度的具有不同萌發(fā)耐淹能力的水稻品種（表1）。其余140 份材料用于種質(zhì)資源篩選。這些水稻種質(zhì)資源于2020年5 月15 日播種于連云港市農(nóng)業(yè)科學院東辛農(nóng)場試驗基地（東經(jīng)119°32′，北緯34°56′），10 月15 日同時收獲，為減少種子休眠帶來的影響，所有供試材料均在50 ℃條件下處理1周以打破種子休眠。本實驗于2021年7—9 月在連云港市農(nóng)業(yè)科學院中心實驗室進行。

表1 參試品種名稱及來源

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻萌發(fā)耐淹性鑒定方法確立

每品種挑選飽滿均一的干種子36 粒，分3 次重復，在1.5%（v/v）次氯酸鈉溶液中處理12 min，并用純水沖洗8 次，將種子置于20 cm 深的透明塑料杯中，隨后將純水小心的倒入杯中，確保種子沉入杯底。共設(shè)3個溫度梯度（20 ℃、25 ℃和30 ℃）、7 個時間梯度（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d）和6 個水深梯度（3 cm、6 cm、9 cm、12 cm、15 cm 和18 cm），將這些杯子根據(jù)不同處理置于不同參數(shù)的人工氣候培養(yǎng)箱（海博RX-500DH）中，每天傍晚檢查水位線刻度并補充相應水分，每3 d 更換1 次純水。按照預定處理天數(shù)測量胚芽鞘長，精確到1 mm，隨機區(qū)組排列，剔除雙極值后，取3 次胚芽鞘長度的平均值作為表型值進行比較分析。

1.2.2 種質(zhì)資源篩選

參照本研究確立的方法進行水稻萌發(fā)耐淹性種質(zhì)資源篩選，溫度設(shè)置為30 ℃，淹水深度為20 cm（容器深度為20 cm，方便注水），在淹水后第11 d 測量胚芽鞘長度，其余步驟同上。

1.3 統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)錄入，利用GraphPad Prism 8.3.0 軟件進行折線圖、箱線圖、頻率分布直方圖繪制和不同處理條件下參試種質(zhì)胚芽鞘長的描述性統(tǒng)計分析，利用萬深SC-E 種子大米外觀品質(zhì)檢測分析儀系統(tǒng)進行參試種質(zhì)資源稻谷籽粒性狀分析，利用Origin 2021 軟件，根據(jù)Pearson’s 相關(guān)系數(shù)檢驗籽粒性狀與萌發(fā)耐淹性的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 描述性統(tǒng)計分析

本研究發(fā)現(xiàn)，在各處理間粳稻的平均胚芽鞘長度均高于秈稻，除淹水6 cm 時粳稻的胚芽鞘長最小值低于秈稻外，其余各處理粳稻的胚芽鞘長最小值均大于秈稻；在16 個處理中，粳稻胚芽鞘長最大值低于秈稻的處理有5 個（淹水天數(shù)3 d、13 d、淹水深度6 cm、溫度20 ℃、25 ℃）；在各處理中，秈稻品種的標準差和變異系數(shù)均高于粳稻，說明秈稻品種的個體之間差異大，離散程度高（表2）。

表2 不同處理下胚芽鞘長描述性統(tǒng)計分析

2.2 低氧脅迫對水稻胚芽鞘長度的影響

在30 ℃條件下，淹水深度為3 cm 時參試粳稻的平均胚芽鞘長為50.8 mm，淹水深度≥6 cm 時參試粳稻的胚芽鞘長顯著降低，平均為43.5 mm，各處理之間差異不顯著；當淹水深度為3 cm 和6 cm 時，參試秈稻的平均胚芽鞘長分別為45.5 mm 和40.1 mm，淹水深度≥9 cm 時參試秈稻的胚芽鞘長顯著降低，平均為35.4 mm，各處理間差異不顯著（圖1A）。在淹水深度20 cm 條件下，溫度分別為20 ℃和25 ℃時，粳稻種質(zhì)的平均胚芽鞘長分別為29.1 mm 和28.4 mm，兩者間差異不顯著；當溫度升高至30 ℃，粳稻種質(zhì)的平均胚芽鞘長升高到42.5 mm，與20 ℃和25 ℃溫度處理存在極顯著差異；溫度為20 ℃、25 ℃和30 ℃時，參試秈稻的平均胚芽鞘長分別為23.7 mm、24.4 mm 和36.5 mm，變化趨勢與粳稻一致（圖1B）。調(diào)查時期梯度處理結(jié)果表明，隨著處理時間的延長，所有參試材料的胚芽鞘長度均呈不斷增加的趨勢（圖1C）。

圖1 不同低氧條件下秈粳稻胚芽鞘長的比較

2.3 水稻萌發(fā)耐淹性最適溫度、淹水深度、調(diào)查時期確定

從圖1A 可見，當淹水深度≥6 cm 時，參試粳稻種質(zhì)的平均胚芽鞘長不再降低，維持在一個比較穩(wěn)定的水平，因此，認為粳稻種質(zhì)萌發(fā)耐淹性鑒定的臨界水深為6 cm；同理，參試秈稻種質(zhì)萌發(fā)耐淹性鑒定的臨界水深為9 cm。由圖2A 可見，無論是秈稻還是粳稻，其胚芽鞘長的四分位差均在30 ℃處理時達到最大，因此，推測在30 ℃下進行萌發(fā)耐淹性鑒定能夠較好將不同水稻品種的低氧發(fā)芽能力予以區(qū)分。從圖2B 可見，隨著調(diào)查時間的增加，參試種質(zhì)胚芽鞘長的四分位差呈先增加后降低的趨勢，秈粳稻均在第11 d 達到峰值，因此認為淹水處理11 d 是水稻萌發(fā)耐淹性鑒定調(diào)查的最佳時期。

圖2 不同低氧脅迫下秈粳稻胚芽鞘長的四分位差

2.4 籽粒性狀與萌發(fā)耐淹性的相關(guān)性分析

為了解析水稻籽粒性狀對萌發(fā)耐淹性的影響，本研究對參試種質(zhì)的籽粒性狀與低氧下的胚芽鞘長進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，參試種質(zhì)的萌發(fā)耐淹性與千粒重、粒寬呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.69、0.68；與籽粒長寬比、粒長呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.65、-0.46（圖3A）；將秈粳亞種單獨分析，發(fā)現(xiàn)粳稻的萌發(fā)耐淹性僅與千粒重呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.65，而秈稻的萌發(fā)耐淹性與籽粒性狀不相關(guān)（圖3B 和圖3C）。

圖3 籽粒性狀與萌發(fā)耐淹性的相關(guān)性分析

2.5 萌發(fā)耐淹性種質(zhì)資源篩選

利用上述確立的鑒定方法，對140 份地方種質(zhì)資源進行萌發(fā)耐淹性鑒定，結(jié)果表明，參試種質(zhì)在低氧條件下的胚芽鞘長呈連續(xù)性分布，變化范圍為13.6～56.8 mm，平均值為41.8 mm，變異系數(shù)為19.0%，說明這些品種的低氧萌發(fā)能力具有廣泛的遺傳多樣性（圖4）；其中處于40～45 mm 范圍內(nèi)的品種最多，達到35份，占比25.0%，其次是45～50 mm 和35～40 mm 范圍，分別為29 個和23 個，三者合計占總數(shù)的62.1%。參試品種中達到強萌發(fā)耐淹性的品種有6 份（胚芽鞘長≥55 mm），分別為二郎早、九月黃、穞稻、山紫糯、紅殼糯和興國，可作為親本資源進行強萌發(fā)耐淹性水稻新品種的培育。

圖4 140 份種質(zhì)資源萌發(fā)耐淹性頻率分布直方圖

3 討論與結(jié)論

在淹水脅迫下，“拿住苗”是直播水稻生產(chǎn)的關(guān)鍵問題，因此，選用低氧發(fā)芽能力強的水稻品種對直播水稻的安全生產(chǎn)十分重要。相對于其他谷類作物，水稻具有較強的低氧發(fā)芽能力，但是品種間仍存在較大差異，如何高效、準確評價水稻種質(zhì)的萌發(fā)耐淹性成為培育適宜直播水稻新品種和開展水稻低氧萌發(fā)遺傳機理研究的限制性因素[19]。利用水層隔絕空氣營造低氧環(huán)境，以淹水后的胚芽鞘長度作為指標被認為是水稻萌發(fā)耐淹性鑒定簡便、可靠的方法，為大規(guī)模種質(zhì)資源篩選、定位群體的表型鑒定奠定了重要的方法基礎(chǔ)。

本研究利用梯度試驗的方法，運用四分位差法分析，確定了水稻萌發(fā)耐淹性鑒定的臨界淹水深度、最適溫度和最佳調(diào)查時期，為水稻萌發(fā)耐淹性研究提供了有據(jù)可依的鑒定方法。利用本研究確立的方法，穞稻、南粳46 的胚芽鞘長分別為56.3 mm 和49.5 mm，表現(xiàn)出較強的萌發(fā)耐淹性，與前人研究結(jié)果一致[20-21]。ANGAJI 等[22]利用強萌發(fā)耐淹性水稻品種Khao Hlan On的BC2F2群體定位到5 個萌發(fā)耐淹性QTL，在該研究中，來自國際水稻研究所的2 個秈稻品種IR42 和IR64被列為感性對照；在本研究種質(zhì)資源篩選中，R42、IR64的胚芽鞘長分別為28.6 mm 和32.0 mm，表現(xiàn)為低氧敏感，這與ANGAJI 等的研究結(jié)果一致。侯名語等[16]利用耐水淹品種Kinmaze 的重組自交系進行萌發(fā)耐淹性QTL 定位，在水稻第1、2、5 和7 染色體上共檢測到5個QTL，低氧敏感秈稻品種DV85 淹水5 d 后的胚芽鞘長僅為3 mm，表現(xiàn)為極感。利用本研究確立的方法，DV85 淹水11 d 后的胚芽鞘長為13.6 mm，在所有參試種質(zhì)中最短，同樣表現(xiàn)為極感。以上這些結(jié)果證明了本研究確立的萌發(fā)耐淹性鑒定方法是可靠的。

由于淹水后的氧氣含量急劇下降，碳水化合物的分解代謝從有氧途徑轉(zhuǎn)變?yōu)閰捬跬緩剑@一過程中，ATP的產(chǎn)生效率比有氧呼吸低18 倍，因此強萌發(fā)耐淹性水稻種質(zhì)需要更多的能量儲存來滿足胚芽鞘的伸長[23-25]。由此我們推測籽粒性狀可能與水稻種質(zhì)的萌發(fā)耐淹能力存在一定關(guān)聯(lián)，因此，本研究對供試材料的籽粒性狀與萌發(fā)耐淹性進行了相關(guān)性分析，探討萌發(fā)耐淹性與籽粒性狀的關(guān)系，以期為強萌發(fā)耐淹性水稻新品種選育提供參考。經(jīng)過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，粳稻淹水后的胚芽鞘長度與籽粒的千粒重呈顯著的正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.65），而秈稻的籽粒性狀與萌發(fā)耐淹性不相關(guān)，因此育種家在選育適宜輕簡栽培的粳稻新品種過程中，應注意加強對大粒重單株的選擇。