翟弋焱,陳美琳,王 偉,時 銳,黃佳奇,張景媛,張繁芹,吳嘉瑞#

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院,北京 100029; 2.魯南制藥集團股份有限公司中藥共性技術國家重點實驗室,山東 臨沂 276000)

盆腔炎性疾病(pelvic inflammatory disease,PID)是女性內生殖器及其周圍結締組織、盆腔腹膜發(fā)生的炎癥病變,該病是一類婦科常見病,主要包括盆腔腹膜炎、子宮內膜炎和輸卵管炎等[1]。PID具有發(fā)病率高、病程長和病情反復等特點。相關研究結果表明,在一些發(fā)展中國家PID的發(fā)病率高達40%,嚴重影響了女性的身心健康,降低其生活質量[2]。倘若未能及時治療,則可能引起PID后遺癥或并發(fā)癥。PID后遺癥過去多稱為慢性盆腔炎,美國疾病預防控制中心(CDC)認為慢性盆腔炎實際上又是一次新的盆腔炎發(fā)作。多數(shù)學者及文獻中也已摒棄了這個術語,改為PID的后遺癥(SPID)[3]。根據(jù)臨床診斷,SPID大致分為近期與遠期2種,近期包括輸卵管卵巢膿腫、肝周圍炎等,甚至可以導致死亡;遠期后遺癥包括不孕癥、慢性盆腔結締組織炎、異位妊娠和PID反復發(fā)作等[4-5]。

西醫(yī)對PID的治療采用抗菌藥物、手術治療和理療(激光療法、微波療法)為主。在治療中,一方面普遍存在抗菌藥物濫用的情況,使患者承擔藥品不良反應和昂貴的醫(yī)療費用;另一方面,治療療程較短,容易造成PID反復發(fā)作[6]。由于PID急性期的臨床表現(xiàn)多以發(fā)熱、腹痛和帶下為主,SPID的臨床表現(xiàn)多以帶下過多、月經失調和不孕癥為主,與中醫(yī)古籍中論述的“癥瘕”“婦人腹痛”“帶下”“痛經”和“月經不調”等病證相似。中醫(yī)認為,PID發(fā)病是由于經期、產后,婦女正氣虛弱造成濕熱邪毒內侵,正邪交鋒導致氣滯血瘀、濕熱壅盛、熱毒熾盛[7]。丹白顆粒是由紅藤敗醬湯和四物湯加減而成的中成藥顆粒制劑,主要針對PID瘀熱濕阻的發(fā)病機制,其由牡丹皮、大血藤、紫花地丁、三棱、莪術、敗醬草、川芎、白花蛇舌草、白英、土茯苓、墓頭回、椿皮、白芍和當歸14味中藥組成,在臨床常被用于治療PID,但具體作用機制尚不明確,值得深入研究[8]。本研究主要使用網絡藥理學結合分子對接的方法對丹白顆粒治療PID的機制進行探索。

1 資料與方法

1.1 丹白顆?；钚猿煞值暮Y選與靶點預測

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP, http: //tcmspw.com/)中,以“牡丹皮”“大血藤”“紫花地丁”“三棱”“莪術”“敗醬草”“川芎”“白花蛇舌草”“白英”“土茯苓”“墓頭回”“椿皮”“白芍”和“當歸”為關鍵詞檢索化學成分。設置口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18,檢索中國知網、PubMed等數(shù)據(jù)庫,查詢丹白顆?；瘜W成分研究相關的文獻。最后結合二者結果使用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫查詢靶蛋白所對應的基因名[9]。

1.2 PID相關靶點的篩選

使用DisGeNET與GeneCards數(shù)據(jù)庫,以關鍵詞“pelvic inflammatory disease”or“Sequelae of Pelvic Inflammatory Disease”檢索獲得盆腔炎相關基因,合并2個數(shù)據(jù)庫的結果為PID的相關靶點。

1.3 丹白顆粒化學成分-靶點網絡圖的構建

使用Cytoscape 3.8.2軟件構建丹白顆?；瘜W成分與靶點的網絡圖。根據(jù)介數(shù)、緊密度和度值等參數(shù)篩選關鍵靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡圖的構建與模塊分析

對藥物靶點與疾病的靶點取交集,使用STRING(https://cn.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫分析得到PPI網絡,將網絡分析結果使用Cytoscape軟件可視化,使用MCODE插件進行模塊分析。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

使用R軟件對PPI網絡中的基因進行GO與KEGG分析。

1.6 分子對接

根據(jù)預測網絡結果找尋其相對應的化合物,從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中獲得化合物的SDF格式文件,通過RCSB PDB(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫篩選獲得蛋白質結構。最后使用Autodock Vina 1.1.2進行運算對接。整理分析對接結果,根據(jù)結合能進行升序排列,使用PyMol 2.3.2軟件進行可視化處理。

2 結果

2.1 成分-靶點網絡圖

成分靶點網絡圖包括460個節(jié)點,2 363條邊,其中70個化合物與377個靶點相關聯(lián),見圖1。

2.2 潛在靶點的PPI網絡圖

對化合物與疾病靶點取交集得到240個交集靶點,繪制韋恩圖,見圖2。將交集靶點導入STRING網站進行分析,使用Cytoscape軟件可視化PPI網絡圖,圖中有198個節(jié)點,1 159條邊,見圖3。使用MCODE功能進行模塊分析,見圖4。得分高的模塊意味著其中的靶點關系更密切,可能共同參與某種生物途徑。

2.3 GO功能富集與KEGG通路富集分析

對PPI網絡進行GO與KEGG富集分析。PPI網絡的分析得到186條KEGG通路和3 730條GO功能條目。在GO條目中包括3 324條生物過程相關條目、166條細胞成分和240條分子功能相關條目。P值最低的10條通路為癌癥通路、脂質與動脈粥樣硬化通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、人巨細胞病毒感染、乙型肝炎、癌癥中的蛋白多糖、卡波西肉瘤相關性皰疹病毒感染、化學致癌-受體激活信號通路、前列腺癌及血流剪切應力與動脈粥樣硬化,見圖5—6。

菱形代表化合物的靶點;正六邊形代表藥物;圓形代表藥物的化學成分;A—H代表藥物的共有成分the rhombus represents the target of the compound; the hexagon represents the drug; the circle represents the chemical composition of the drug; and the A to H represents the common composition of the drug圖1 丹白顆粒的成分-靶點網絡圖Fig 1 Components-target network diagram of Danbai granules

圖2 丹白顆粒與PID的交集靶點圖Fig 2 Intersection target map of Danbai granules and pelvic inflammatory disease

每個節(jié)點的大小代表了其度值,顏色由淺到深代表了緊密中心由大到小the size of each node represents its degree value, and the color from light to dark represents the tight center from large to small圖3 丹白顆粒相關靶點PPI網絡圖Fig 3 PPI network diagram of related targets of Danbai granules

A.模塊一(score: 6.692);B.模塊二(score: 4.444);C.模塊三(score: 4.375)A. module 1 (score: 6.692); B. module 2 (score: 4.444); C. module 3 (score: 4.375)圖4 丹白顆粒治療類風濕性關節(jié)炎的PPI網絡模塊Fig 4 PPI network module of Danbai granules in the treatment of rheumatoid arthritis

2.4 藥物-成分-靶點-通路網絡圖

對網絡進行參數(shù)篩選得到關鍵基因,分別為磷脂酰肌醇3激酶催化亞單位α異構體(PIK3CA)、肉瘤基因(SRC)、腫瘤蛋白53(TP53)、熱休克蛋白90α(HSP90AA)、蛋白激酶B1(Akt1)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、雌激素受體1(ESR1)、表皮生長因子受體(EGFR)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、v-rel 網狀內皮細胞過多癥病毒癌基因同源物A(RELA)和白細胞介素6(IL-6)。對部分分析結果進行展示(見圖7),得到藥物-成分-靶點-通路網絡圖(見圖8)。

2.5 分子對接

使用AutoDockTools 1.5.6 軟件對關鍵靶點及其相對應的化合物進行分子對接。將部分對接結果進行可視化,見圖9。一般來說,結合能越小,配體化合物與受體蛋白的結合效果越好。

圖5 丹白顆粒治療PID的PPI網絡模塊GO和KEGG富集分析結果Fig 5 Results of GO and KEGG enrichment analysis of Danbai granules in the treatment of PID PPI network module

圖6 丹白顆粒治療PID的PPI網絡GO和KEGG富集分析結果Fig 6 Results of GO and KEGG enrichment analysis of Danbai granules in the treatment of PID PPI network

五角星代表丹白顆粒的作用位點the pentagram represents the check point of Danbai granules圖7 丹白顆粒作用于PI3K-Akt信號通路示意圖Fig 7 Schematic diagram of Danbai granules acting on PI3K-Akt signaling pathway

橢圓形代表藥物,菱形代表關鍵化合物,V形代表關鍵靶點,矩形代表通路;hsa05167(卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染),hsa05161(乙肝通路),hsa05205(癌癥中的蛋白多糖),hsa05163(人巨細胞病毒感染),hsa05417(脂質與動脈粥樣硬化信號通路),hsa04668(TNF信號通路),hsa04625(C型凝集素受體信號通路信號通路),hsa05135(耶爾森氏菌感染信號通路),hsa05152(肺結核信號通路),hsa05166(人T細胞白血病病毒1型感染信號通路)oval represents drugs, rhombus represents key compounds, V represents key targets, and rectangles represent pathways. Hsa05167 (Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection), hsa05161 (hepatitis B pathway), hsa05205 (proteoglycans in cancer), hsa05163 (human cytomegalovirus infection), hsa05417 (lipids and atherosclerosis signaling pathway), hsa04668 (TNF signaling pathway), hsa04625 (C-type lectin receptor signaling pathway signaling pathway), hsa05135 (Yersinia infection signaling pathway), hsa05152 (pulmonary tuberculosis signaling pathway), hsa05166 (human T-cell leukemia virus type 1 infection signaling pathway)圖8 藥物-成分-靶點-通路網絡圖Fig 8 Drug-component-target-pathway network diagram

A.木犀草素作用于IL-6(結合能:-35.15 kJ/mol);B.槲皮素作用于Akt1(結合能:-26.36 kJ/mol);C.槲皮素作用于IL-6(結合能:-33.89 kJ/mol);D.木犀草素作用于TNF-α(結合能:-30.12 kJ/mol);E.槲皮素作用于TNF-α(結合能:-29.71 kJ/mol);F.槲皮素作用于MAPK1(結合能:-35.98 kJ/mol);G.柚皮素作用于ESR1(結合能:-36.82 kJ/mol);H.木犀草素作用于RELA(結合能:-38.49 kJ/mol)A. luteolin act on IL6 (affinity: -35.15 kJ/mol); B. quercetin on Akt1 (affinity: -26.36 kJ/mol); C. quercetin act on IL6 (affinity: -33.89 kJ/mol); D. luteolin act on TNF-α (affinity: -30.12 kJ/mol); E. quercetin act on TNF-α (affinity: -29.71 kJ/mol); F. quercetin act on MAPK1 (affinity: -35.98 kJ/mol); G. naringenin act on ESR1 (affinity: -36.82 kJ/mol); H. luteolin act on RELA (affinity: -38.49 kJ/mol)圖9 分子對接Fig 9 Molecular docking

3 討論

PID病情較為反復,中醫(yī)藥由于其多靶點、多通路的作用機制,能在一定程度上更好地干預該類慢性疾病[10]。研究結果表明,PID的發(fā)生、發(fā)展過程主要包括病原微生物的感染、免疫系統(tǒng)的激活與炎癥因子的釋放等階段。然而,當機體的免疫系統(tǒng)被激活后,炎癥因子過度釋放會加重感染部位的損傷,長期反復導致了PID的產生[11-12]。

本研究通過網絡藥理學結合分子對接的方法對丹白顆粒治療PID的作用機制進行了探討。通過文獻檢索結合數(shù)據(jù)庫挖掘的方法獲得丹白顆粒中的70個化合物與377個靶點。使用分子對接技術對預測的關鍵化合物與靶點進行了驗證。如槲皮素是處方中牡丹皮、敗醬草、土茯苓、白花蛇舌草、墓頭回和椿皮中的化學成分,具有抗炎、抗菌和抗腫瘤等多種藥理活性[13]。司麗君等[14]觀察了槲皮素對伴刀豆球蛋白A誘導的T細胞和脂多糖誘導的B細胞增殖的影響,結果顯示,經槲皮素處理后的T細胞數(shù)量、B細胞數(shù)量以及炎癥因子數(shù)量均顯著降低,表明槲皮素具有良好的抗炎作用,能促進小鼠脾淋巴細胞的增殖,抑制T細胞、B細胞的增殖和炎癥因子的產生。木犀草素是處方中敗醬草的化學成分,具有抗炎、抗菌、抗糖尿病和抗過敏等多種藥理作用。木犀草素可以減少自由基的生成,通過影響核因子κB(NF-κB )信號通路、MAPK信號通路、JAK-STAT信號通路等炎癥通路以及花生四烯酸的代謝抑制炎癥因子的產生與表達[15]。周霄楠等[16]通過細胞實驗進一步驗證了木犀草素對于脂多糖誘導的細胞炎癥模型的調控作用,結果顯示,木犀草素可以顯著抑制脂多糖誘導的細胞內一氧化氮(NO)、TNF-α、白細胞介素1β(IL-1β)以及IL-6含量的升高,具有良好的抗炎效果。山柰酚是處方中牡丹皮、敗醬草、白芍和椿皮的化學成分,具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種藥理活性。如山柰酚可通過抑制炎癥因子IL-1β誘導的前列腺素E2和NO的產生,進一步抑制炎癥反應[17-18]。柚皮素具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗纖維化和抗心律失常等藥理活性[19]。研究結果表明,柚皮素能抑制環(huán)氧化酶2的表達進而減少前列腺素的合成,還能減少炎癥因子TNF-α、NF-κB等的生成,從而減輕炎癥反應[20-21]。上述化合物都是通過網絡藥理學預測結合分子對接驗證得到的關鍵化合物,因此其可能是丹白顆粒發(fā)揮治療PID作用的核心成分。

PPI網絡的預測結合文獻挖掘結果顯示,PIK3CA、SRC、TP53、HSP90AA、Akt1、MAPK3、MAPK1、ESR1、EGFR、TNF-α、RELA和IL-6可能是丹白顆粒治療PID的關鍵靶點。費紅梅[22]對124例盆腔炎患者進行了血清炎癥因子檢測,發(fā)現(xiàn)患者血清中TNF-α、IL-1β等水平顯著高于正常對照組,血清IL-4以及CD4+/CD8+水平明顯低于對照組,由此可見,TNF-α等炎癥因子可能是導致PID反復的原因之一。生殖系統(tǒng)感染后,Toll樣受體(TLR)首先在免疫系統(tǒng)中被激活,其是一種模式識別受體,可以識別病原相關的分子模式[23]。輸卵管炎是PID的一種,陳曉等[24]建立了輸卵管炎小鼠模型,使用熒光定量聚合酶鏈反應檢測小鼠輸卵管組織中TLR2的mRNA水平,以及使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測小鼠血清TNF-α的表達,結果顯示,模型組血清TNF-α水平顯著高于空白組,而TLR2 mRNA的表達在28 d時顯著低于3 d時,表明輸卵管炎可能是由TLR2通過一系列信號轉導產生大量TNF-α所誘發(fā)的。IL-6與PID密切相關,可能會導致盆腔局部組織粘連,加重原有損傷[25]。畢海平等[26]將60例婦科就診患者分為對照組與盆腔炎組,檢測兩組患者血清IL-6水平,結果顯示,盆腔炎組患者血清IL-6水平遠高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義。RELA是NF-κB的亞單位之一,它能精準地調控NF-κB信號通路,在一系列免疫反應和炎癥反應相關的疾病中發(fā)揮著重要作用[27]。子宮內膜炎同樣也是PID的一種,馬紅霞等[28]、尤昭玲等[29]使用革蘭菌制作恒河猴子宮內膜炎模型,發(fā)現(xiàn)其血清炎癥因子TNF-α、IL-1的表達水平升高,而二者表達水平升高后會促使NF-κB的激活,從而形成正向反饋導致原有炎癥加重,接著使用藥物進行干預后發(fā)現(xiàn)治療組的NF-κB水平顯著低于模型組,進一步得出結論,通過調控NF-κB的活化可以有效保護子宮內膜組織,有效緩解PID。EGFR是受體酪氨酸激酶中的表皮因子生長受體家族的成員之一,屬于酪氨酸激酶型受體,在細胞信號傳導、細胞生理過程中發(fā)揮重要作用[30]。EGFR表達量增多會增強上皮細胞對生長因子的敏感度,因此使生長因子受體更容易與生長因子配體結合形成絡合物,從而影響輸卵管上皮的增殖分化,導致炎癥進一步加重[31]。胡曉玲等[32]使用自擬方通關湯對輸卵管炎模型大鼠進行治療,發(fā)現(xiàn)治療前后輸卵管上皮細胞中B細胞淋巴瘤2(Bcl-2)、EGFR表達的差異均有統(tǒng)計學意義,表明該藥的作用機制可能是通過下調Bcl-2、EGFR的過表達來達到治愈輸卵管炎的作用。丹白顆?？赡苁峭ㄟ^調節(jié)上述關鍵靶點來發(fā)揮治療PID的作用。

GO功能與KEGG通路富集分析結果顯示,丹白顆粒治療PID的靶點集中在多條炎癥相關通路中。如PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路等。PI3K-Akt信號通路可以調節(jié)多種細胞因子,參與細胞分化、增殖、凋亡與新血管的生成等生物學過程[33-34]。當上游信號激活PI3K后,下游的Akt開始啟動磷酸化進程,進而激活一系列的靶基因如COX-2、Caspase-9,促進細胞新陳代謝、凋亡和增殖等。研究結果表明,PI3K-Akt信號通路與子宮內膜癌的不良預后相關[35]。近年來,炎-癌轉化的病理機制一直是研究的熱點。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中,炎癥反應參與腫瘤的各個階段,炎癥因子與惡性腫瘤細胞周圍的基質產生交互作用,炎癥型腫瘤微環(huán)境不斷促進腫瘤的生長[36-37]。因此,PI3K-Akt信號通路同樣也會影響子宮內膜炎等炎癥反應引發(fā)的疾病。網絡藥理學靶點預測結果發(fā)現(xiàn),PIK3CA是丹白顆粒作用于PID的關鍵靶點,因此,本研究推測丹白顆?？赡芡ㄟ^調控PIK3CA,進而影響PI3K-Akt信號通路的生物學功能。

綜上所述,丹白顆粒可能是通過NF-κB信號通路、MAPK信號通路和PI3K-Akt信號通路等通路作用于TNF-α、IL-6和EGFR等關鍵靶基因,發(fā)揮其治療PID的作用。本研究主要采用數(shù)據(jù)挖掘開展,與已發(fā)表的基礎研究具有很大程度的一致性,因此對后續(xù)的實驗研究提供了借鑒并奠定了基礎。