張亞南,葉飛,魏家靜,劉偉信,曾玖芝,侯明霞,熊東升

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球不孕不育夫婦數(shù)量逐年上升,目前已達(dá)6 000萬～8 000萬對(duì)。我國不孕不育患者已占到育齡夫婦的15%[1],輔助生殖技術(shù)逐漸成為不孕夫婦治療的重要手段。為了進(jìn)一步提高胚胎移植妊娠率,胚胎學(xué)家通過延長胚胎體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胚胎進(jìn)行早期篩選,從卵裂期到形成囊胚的過程中只有發(fā)育潛能較好的胚胎才有最終被移植或者冷凍的機(jī)會(huì),發(fā)育不好的胚胎則在培養(yǎng)過程中被淘汰。研究表明,細(xì)胞凋亡是胚胎早期發(fā)育停滯的主要方式,也是導(dǎo)致輔助生殖技術(shù)不良結(jié)局的重要因素[2]。本文將對(duì)胚胎發(fā)育停滯的影響因素做以下綜述。

1 胚胎發(fā)育停滯的機(jī)制

著床前胚胎在體外培養(yǎng)過程中往往會(huì)發(fā)生“發(fā)育停滯”現(xiàn)象,并且發(fā)生的時(shí)間節(jié)點(diǎn)不盡相同,胚胎體外培養(yǎng)發(fā)育到1-2細(xì)胞之前一直處于從生殖細(xì)胞分化到胚胎細(xì)胞、由母型過渡到合子型的轉(zhuǎn)變過程,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)及機(jī)制也在不停轉(zhuǎn)換[3]。植入前胚胎基因組的激活發(fā)生在2細(xì)胞晚期。因此,胚胎從受精卵到2細(xì)胞階段主要依賴的是母源因子[4]。

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)眾多的抗氧化反應(yīng),調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抗性。有研究表明,鴉膽子苦醇(brusatol)可以抑制Nrf2信號(hào)通路,并且下調(diào)Nrf2蛋白的表達(dá),抑制細(xì)胞周期由G2到M期的轉(zhuǎn)變,進(jìn)而抑制胚胎的發(fā)育[5]。

另有研究指出,用35S標(biāo)記2細(xì)胞期體外發(fā)育停滯的胚胎,結(jié)果顯示蛋白質(zhì)合成圖譜有改變,在正常情況下2細(xì)胞期應(yīng)該表達(dá)的蛋白在停滯的胚胎中沒有表達(dá)。胚胎發(fā)育越過2細(xì)胞期后,新合成蛋白的總量及合子型產(chǎn)物占其中的比例也隨之增加。對(duì)2細(xì)胞停滯胚胎和經(jīng)茵香霉素(一種蛋白合成抑制劑)處理的胚胎進(jìn)行比較分析還發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)合成的速率直接影響胚胎的發(fā)育潛能[6-7]。

2 胚胎發(fā)育停滯的多因素分析

2.1 線粒體功能異常對(duì)胚胎發(fā)育的影響

線粒體是所有哺乳動(dòng)物卵子和植物早期細(xì)胞組織中含量最豐富的一類細(xì)胞器,其功能特點(diǎn)是經(jīng)氧化磷酸化作用產(chǎn)生三磷酸腺甘醇(ATP)等,為胚胎細(xì)胞分裂、代謝合成過程提供能量物質(zhì)。受精過程結(jié)束后由精子攜帶的線粒體發(fā)生退化,后期胚胎在發(fā)育過程中所需的能量均由卵母細(xì)胞內(nèi)的線粒體提供[8-9]。

線粒體的功能一旦發(fā)生異常就可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯。Thouas GA等[10]用若丹明-123使鼠受精卵線粒體滲透性增加、功能喪失,受精卵發(fā)育停滯;又用環(huán)孢霉素A抑制線粒體滲透性,受精卵的發(fā)育部分恢復(fù)。Tarazona AM等[11]先用熒光探針直接測量牛卵母細(xì)胞線粒體活性,并將牛MⅡ期卵母細(xì)胞中線粒體熒光規(guī)定為100%,發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育到16細(xì)胞以上時(shí),線粒體活性僅保持在大約16%～50%,發(fā)育較差的胚胎線粒體活性不足15%。與線粒體功能低下相反,鼠胚在2-4細(xì)胞期ATP產(chǎn)量異常增多,到桑葚胚ATP反而下降,從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因是ATP產(chǎn)生過多時(shí),自由基等有害物質(zhì)也大量產(chǎn)生,使線粒體晶體(由兩個(gè)陽離子和無機(jī)磷酸組成)出現(xiàn),線粒體晶體可以阻礙氧化磷酸化反應(yīng),使8細(xì)胞胚胎線粒體功能減退、發(fā)育停滯。

由此可見,當(dāng)細(xì)胞線粒體內(nèi)呼吸酶功能不足時(shí),不能產(chǎn)生足夠的ATP來維持細(xì)胞基本生命活動(dòng);而由于線粒體功能降低,在傳遞大量電子過程中線粒體所釋放出的負(fù)活性氧、自由基等有害物也隨之增多[12]。

2.2 絨毛染色體數(shù)目異常與胚胎發(fā)育停滯的關(guān)系

在人類胚胎非整倍性篩查中發(fā)現(xiàn),許多采用輔助生殖技術(shù)助孕的患者妊娠失敗的原因是胚胎的非整倍性[13]。染色體分離過程中數(shù)目異常是由于雙親中有一方的配子在形成或者受精卵在卵裂初期出現(xiàn)染色體不分離,因此出現(xiàn)了單倍體或者三倍體[14]。研究表明,胚胎停滯患者絨毛染色體數(shù)目的異常分離與胎兒性別無關(guān),但是累計(jì)流產(chǎn)3次或5次以上的嚴(yán)重習(xí)慣性流產(chǎn)者,胎兒染色體數(shù)目異常發(fā)生率顯著升高[15]。隨著女性年齡增加,雖無不良孕產(chǎn)史,卵子質(zhì)量也呈下降趨勢,卵子退化及畸形現(xiàn)象的發(fā)生率越來越高[16]。另外,受精卵細(xì)胞內(nèi)紡錘絲老化,會(huì)導(dǎo)致卵子受精后功能減退,導(dǎo)致早期胚胎發(fā)生停滯[17]。

2.3 MTOR信號(hào)通路與胚胎發(fā)育停滯的關(guān)系

MTOR(the mammalian target of rapamycin)即來源于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的雷帕米松霉素的靶源蛋白,最早在酵母屬生物中被發(fā)現(xiàn),隨后人們又相繼在其他某些低等哺乳動(dòng)物細(xì)胞組織中發(fā)現(xiàn)[18]。MTOR信號(hào)通路主要調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、遷移及自我復(fù)制等功能,不僅參與胚胎分裂整個(gè)生理過程,對(duì)胎兒出生后的生長發(fā)育也有調(diào)節(jié)作用[19]。MTOR信號(hào)通路在酵母體細(xì)胞中的一項(xiàng)基本調(diào)控功能是通過感受外界營養(yǎng)狀況控制酵母細(xì)胞正常生長,當(dāng)培養(yǎng)條件比較適合生長時(shí),MTOR通路可被激活,從而調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞生長、出芽[20]。

在一些關(guān)于哺乳動(dòng)物的研究中,MTOR通路可以整合細(xì)胞外的信號(hào),從而調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖、分化和發(fā)育等生理功能,同時(shí)參與細(xì)胞蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程,若此通路失調(diào)可能導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖,甚至發(fā)生癌變[21]。一定程度上抑制MTOR通路,可以有效調(diào)控胚胎相應(yīng)區(qū)域的蛋白質(zhì)合成,以及磷酸化與修飾反應(yīng)的抑制程度,導(dǎo)致哺乳動(dòng)物體內(nèi)的胚胎生長發(fā)育受阻[22]。

2.4 活性氧水平對(duì)胚胎發(fā)育停滯的影響

活性氧(reactive oxygen species,ROS)主要是指體內(nèi)所產(chǎn)生的氧自由基及氧化作用較強(qiáng)的非自由基和含氧產(chǎn)物的總稱,主要有氧負(fù)離子、超氧離子、羥基自由基及過氧化物等。線粒體是ROS產(chǎn)生的主要細(xì)胞器,參與細(xì)胞代謝及能量供應(yīng),若ROS產(chǎn)生過多則會(huì)抑制細(xì)胞內(nèi)生長因子的作用,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

ROS能夠增強(qiáng)腫瘤蛋白因子P53的表達(dá),ROS聚集越多,腫瘤蛋白因子P53表達(dá)量越高,使胚胎在體外生長過程中質(zhì)量下降,導(dǎo)致發(fā)育停滯并最終死亡[23]。

體外培養(yǎng)條件下ROS能夠誘導(dǎo)胚胎細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激因子,增加氧化應(yīng)激反應(yīng)和其他異常成份,降低胚胎自我修復(fù)功能,同時(shí)使正常胚胎發(fā)育能力受到影響,被臨床認(rèn)為是影響胚胎發(fā)育的重要因素。

2.5 基因突變對(duì)胚胎發(fā)育停滯的影響

早期胚胎發(fā)育是成熟的卵母細(xì)胞與精子結(jié)合形成合子,通過減數(shù)分裂和有絲分裂形成卵裂期胚胎及囊胚。在此過程中同源染色體通過紡錘體的牽引向兩級(jí)分化,微管蛋白在分裂過程中發(fā)揮著重要功能[24]。TUBB8基因是一種特殊的微管蛋白亞型,該基因的突變有可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟障礙及胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)發(fā)育停滯現(xiàn)象[25]。

TUBB8基因只存在于靈長類動(dòng)物中,目前已發(fā)現(xiàn)的有82種TUBB8突變基因型,且臨床表型各不相同,如發(fā)生突變,可導(dǎo)致未成熟卵母細(xì)胞發(fā)育停滯、受精卵無法正常卵裂及早期胚胎發(fā)育停滯和反復(fù)著床失敗等[26]。出現(xiàn)以上現(xiàn)象的原因是由于TUBB8基因突變影響了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中紡錘體的形成和組裝,導(dǎo)致染色體分離不均勻,形成非整倍體胚胎,繼而無法正常發(fā)育,或者可以形成MII期卵母細(xì)胞,能正常受精和卵裂,但在2-8細(xì)胞期就不再繼續(xù)發(fā)育[27]。

2.6 不同培養(yǎng)基成分對(duì)胚胎發(fā)育停滯的影響

一些國外學(xué)者在早期研究中采用的M16培養(yǎng)液是直接對(duì)小鼠胚胎細(xì)胞體外培養(yǎng),但由于對(duì)遠(yuǎn)交系小鼠進(jìn)行胚胎發(fā)育研究容易導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯的異?，F(xiàn)象,為了克服這種停滯現(xiàn)象,研究者通過對(duì)培養(yǎng)液的成分進(jìn)行優(yōu)化、調(diào)整得到了KSOM培養(yǎng)液,直接將胚胎在KSOM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),有效降低了小鼠胚胎在體外發(fā)育時(shí)的停滯率[28]。

KSOM培養(yǎng)液相對(duì)于M16培養(yǎng)液來說在Na+、K+、Ca2+的配比上進(jìn)行了平衡優(yōu)化,Na+、K+、Ca2+主要通過與環(huán)境介質(zhì)中氣體分子中的電子相作用,從而保持細(xì)胞質(zhì)中電子平衡,在此過程中O2發(fā)揮著不可替代的作用。由此證明,小鼠胚胎體外發(fā)育是否正常與培養(yǎng)液成份及溫度條件有著直接關(guān)系[29]。

2.7 男性精子異常對(duì)胚胎發(fā)育停滯的影響

隨著輔助生殖技術(shù)的進(jìn)步,男性因素導(dǎo)致的不育受到廣泛關(guān)注[30]。以往關(guān)于生育障礙的因素大都集中在女性,往往忽略了男性因素。男性精子濃度、活動(dòng)力、存活率、形態(tài)等都是衡量男性生育力的重要指標(biāo)[31]。精子活力和形態(tài)異常,精子畸形率偏高,可能會(huì)造成女性自然流產(chǎn)及胚胎發(fā)育停滯[32]。Hrsfilan S等[33]研究結(jié)果也提示男性精子染色體異常也可能導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。

近年來,男性精液質(zhì)量檢測技術(shù)也逐步提升。2001年Bartoov B等[34]發(fā)明了運(yùn)動(dòng)精子細(xì)胞器形態(tài)學(xué)的檢查儀器(MSOME)技術(shù),在高倍鏡下對(duì)精子細(xì)胞核進(jìn)行實(shí)時(shí)的檢測。隨后,在此技術(shù)基礎(chǔ)上又創(chuàng)新融合了數(shù)位光學(xué)成像技術(shù),其總體放大的倍數(shù)約6 600倍,能直接對(duì)精子頂體、頂體的后端致密膜層、細(xì)胞核、頸部、尾部和線粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行精細(xì)分辨,該技術(shù)通過與ICSI技術(shù)結(jié)合后而被發(fā)明者命名為胞漿內(nèi)形態(tài)學(xué)篩選精子注射[35],可用于人工通過顯微鏡篩選精子,有效提高了受精率、著床率,降低了流產(chǎn)率[36]。

3 展望

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,胚胎發(fā)育停滯的機(jī)理也日漸清晰。目前研究顯示,胚胎發(fā)育停滯的因素主要集中在胚胎自身基因突變、染色體異常和產(chǎn)生的ROS及胚胎內(nèi)部的信號(hào)通路等方面,由于胚胎發(fā)育機(jī)制較為復(fù)雜,目前未能準(zhǔn)確分析胚胎發(fā)育停滯的具體原因。近些年雖然在胚胎發(fā)育停滯的機(jī)制研究上取得了一定成果,但仍有更多空間有待發(fā)現(xiàn)和挖掘,只有綜合考慮多方面因素,才能降低胚胎發(fā)育停滯率。