黃紅倩,蘇家蓀,覃再隆

作者單位:530023 廣西 南寧,廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院,廣西兒童醫(yī)院,廣西婦產(chǎn)醫(yī)院,廣西出生缺陷預(yù)防控制研究所,遺傳代謝中心實驗室;廣西生殖健康與出生缺陷防治重點實驗室;廣西遺傳性疾病精準(zhǔn)診治重點實驗室

胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)畸形是由各種因素(如遺傳、環(huán)境、藥物等)作用于胚胎,使胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形,是導(dǎo)致出生缺陷的一個重要原因。CNS畸形發(fā)生率僅次于先天性心臟病,在我國胎兒先天性畸形種類中位于第二,約占全部畸形的20%～25%[1],在活產(chǎn)兒中的發(fā)病率為0.14%～0.16%[2]。

CNS畸形可分為顱腦神經(jīng)系統(tǒng)畸形和腦發(fā)育異常。顱腦神經(jīng)系統(tǒng)畸形包括:脊柱裂、腦積水、無腦畸形、露腦畸形等;腦發(fā)育異常包括:全前腦、腦發(fā)育不良、Dandy-Walker綜合征、胼胝體發(fā)育不全等[3]。產(chǎn)前超聲檢測為胎兒CNS畸形的首選檢查方法,通常在孕早期(≥11周)對胎兒顱腦神經(jīng)系統(tǒng)畸形進行篩查[4],利用三維和四維超聲可預(yù)測胎兒神經(jīng)功能發(fā)育情況[5],磁共振分辨率高,能大幅提高胎兒CNS畸形的診斷率[6-7]。但胎兒CNS畸形的致病機制復(fù)雜,環(huán)境因素及遺傳因素相關(guān)性約占40%[8],遺傳變異是重要因素之一。因此,CNS畸形胎兒的遺傳學(xué)研究有助于臨床診斷并指導(dǎo)妊娠結(jié)局。目前,國內(nèi)外對于CNS畸形胎兒的遺傳學(xué)診斷,從細胞水平逐漸發(fā)展到分子水平。本文對各檢測技術(shù)現(xiàn)狀進行綜述,分析各技術(shù)手段在胎兒CNS畸形遺傳學(xué)病因診斷中的應(yīng)用價值。

1 胎兒CNS畸形的遺傳學(xué)檢查

1.1 CNS畸形的染色體核型分析

染色體變異是導(dǎo)致CNS畸形的重要因素。核型分析作為檢查染色體變異的“金標(biāo)準(zhǔn)”,在國內(nèi)外為產(chǎn)前診斷的常規(guī)項目。核型分析可對整倍體/非整倍、>5 Mb的缺失/重復(fù)、平衡性變異(包括平衡易位、倒位和插入易位)、嵌合體等進行診斷。經(jīng)研究,不同類型的CNS畸形伴發(fā)的染色體非整倍體異常有所區(qū)別[9],脊柱裂及Dandy-Walker畸形常發(fā)生于18-三體綜合征患兒,全前腦與13-三體綜合征密切相關(guān),腦室增寬、脈絡(luò)叢囊腫等微小畸形也常發(fā)生于21-三體綜合征患兒(唐氏兒)。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn),Dandy-Walker畸形可能與9號、3號、13號染色體異常有一定的關(guān)聯(lián)[10]。

1.2 CNS畸形的染色體微陣列分析檢測

近十年來,染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis,CMA)技術(shù)逐漸成為產(chǎn)前診斷的重要手段,其分辨率高(100 Kb)、特異性高、通量大,可對微缺失/微重復(fù)染色體變異進行診斷,目前已經(jīng)在國內(nèi)外廣泛使用。

有研究表明,使用CMA技術(shù)對超聲結(jié)構(gòu)異常、核型正常的胎兒進行檢測,陽性檢出率約為6%[11]。對于腦結(jié)構(gòu)異常胎兒,CMA較核型分析額外增加了6.6%的檢出率[12]。有學(xué)者報道ECHS1基因引起的腦電圖異常、NDE1基因(無腦畸形)、YWHAE基因單倍劑量不足導(dǎo)致腦結(jié)構(gòu)異常、1q21.1微缺失綜合征都與腦結(jié)構(gòu)異常有關(guān)[13]。另有研究表明,前腦無裂畸形的發(fā)生與SHH、ZIC2、SIX3、TGIF基因突變有關(guān)[14],純合子CCDC88C基因突變可能為腦積水產(chǎn)生的原因[15]。

因此,美國于2013年發(fā)布了基因芯片的應(yīng)用指南[16],指出胎兒在生長過程中發(fā)生一個或多個超聲結(jié)構(gòu)異常時,應(yīng)首選CMA技術(shù)進行產(chǎn)前診斷。我國也于2014年8月發(fā)表了CMA技術(shù)在產(chǎn)前診斷中應(yīng)用的專家共識,明確胎兒結(jié)構(gòu)異常是進行CMA檢測的適應(yīng)證,并建議同時進行染色體核型分析[17]。

1.3 CNS畸形的全外顯子組測序檢測

研究表明,許多單基因疾病在宮內(nèi)即可導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)異常,這些異常可通過超聲檢查發(fā)現(xiàn),但染色體核型分析和CMA均無異常,使其未得到明確診斷。隨著技術(shù)的進步和研究的深入,通過全外顯子組測序(whole-exome sequencing,WES)可分析絕大部分單基因遺傳病的致病變異,為染色體核型及CMA結(jié)果正常的結(jié)構(gòu)畸形胎兒額外提高6.2%～80.0%的診斷率[18-20]。由于遺傳異質(zhì)性,具有相同或相似臨床表現(xiàn)的疾病,其致病基因卻不同,給臨床診斷帶來較高難度。因此,WES得益于其通量高的特點逐漸被應(yīng)用于產(chǎn)前診斷[21-22]。目前,已有國外學(xué)者對產(chǎn)前超聲結(jié)構(gòu)異常胎兒進行大規(guī)模的WES分析研究[23],國內(nèi)也有多家醫(yī)院對CNS畸形的胎兒進行WES分析,例如廣州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院通過WES檢測確定了胎兒L1CAM、ISPD和GRIN2B基因的致病性和可能致病性變異[24],這些變異在妊娠22～25周時出現(xiàn)CNS異常。綜合文獻報道,WES分析在中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形胎兒中的檢出率為22.0%～71.7%[24-26]。

2 技術(shù)現(xiàn)狀及面臨的挑戰(zhàn)

目前,大多數(shù)產(chǎn)前診斷中心已聯(lián)合染色體核型分析技術(shù)與染色體微陣列分析技術(shù)對CNS畸形胎兒進行遺傳學(xué)檢測。染色體核型分析技術(shù)雖檢驗周期長、分辨率低(>5 Mb)、形態(tài)學(xué)檢測存在主觀判斷差異,但其具有檢測平衡性變異的特點,并且可直觀分析染色體的結(jié)構(gòu)異常,因此仍不能完全被分子技術(shù)取代。CMA技術(shù)的優(yōu)點是可在全基因組范圍內(nèi)檢測染色體拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs),因其分辨率高(100 Kb)、通量大,在國內(nèi)外已經(jīng)成熟運用。根據(jù)探針設(shè)計原理的不同,可將CMA技術(shù)分為兩大類:一類是比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)技術(shù),另一類是單核苷酸多態(tài)性微陣列芯片(single nucleotide polymorphism array,SNP array)技術(shù)[27]。我院采用SNP array作為基因芯片檢測的手段,相比較于aCGH,SNP array的優(yōu)點是能檢測特定的基因型或相關(guān)的等位基因,發(fā)現(xiàn)近親血緣、單親二倍體、三倍體以及嵌合體(>15%)。根據(jù)基因組中CNVs的致病程度,可分為致病性、可能致病性、臨床意義不明(VOUS)、可能良性和良性CNVs[28]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常的各種類型中,后顱窩畸形(包括Dandy-Walker畸形和小腦發(fā)育不良)和前腦無裂畸形在致病性CNVs中的檢出率最高。而顱內(nèi)架構(gòu)異常的預(yù)后較為良好,如臨界的腦室擴張、后顱窩增寬、Blake囊腫等疾病,遺傳學(xué)診斷對其病因的判斷起著重要的作用[29]。因此,聯(lián)合使用核型分析和CMA技術(shù)可達到檢測范圍廣、提高陽性檢出率的目的,還可以起到雙線核對的作用,對嵌合體的診斷更準(zhǔn)確。但隨著CMA技術(shù)的廣泛應(yīng)用,VOUS結(jié)果給臨床咨詢醫(yī)師帶來巨大的挑戰(zhàn),如何對此類患者進行科學(xué)合理的遺傳學(xué)建議,這需要更多的數(shù)據(jù)積累。

WES是利用序列捕獲技術(shù)將人基因組的外顯子區(qū)域DNA捕獲并富集后進行高通量測序的基因組分析方法,雖然外顯子區(qū)域僅占全基因組1%～2%左右,卻包含了85%的致病變異[30]。該技術(shù)既可檢測已知致病基因突變位點,又可發(fā)現(xiàn)新的疾病相關(guān)基因[33]。在積累了產(chǎn)后WES的豐富經(jīng)驗后,對于核型分析與CMA結(jié)果均正常的嚴(yán)重發(fā)育異常胎兒,WES運用于一線臨床產(chǎn)前診斷技術(shù)逐漸成熟。但WES在臨床應(yīng)用過程中存在幾個問題:① 產(chǎn)前檢查胎兒表型有一定的局限性,表型描述可能不夠全面,給數(shù)據(jù)分析帶來較大的困難,如產(chǎn)前樣本容易漏診相關(guān)孟德爾遺傳病導(dǎo)致的風(fēng)險[31];② 由于WES的覆蓋范圍和測序深度有限,不能完全分析到基因的內(nèi)含子區(qū)域,便存在假陰性結(jié)果的風(fēng)險,導(dǎo)致漏診[32];③ 對于偶然發(fā)現(xiàn)和VOUS的變異,在對產(chǎn)前胎兒的處置時會有很大的影響,因此是否對其報告,或怎樣的方式報告,實驗室應(yīng)有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)定,并充分做好知情同意。

3 遺傳咨詢

如何對患者進行科學(xué)合理的遺傳學(xué)建議,這需要更多的數(shù)據(jù)積累。WES的遺傳咨詢通常比CMA難度更大,由于WES具有更強的專業(yè)性,個體差異影響較大,結(jié)果解釋更為復(fù)雜,指導(dǎo)胎兒的醫(yī)療決策(如是否繼續(xù)妊娠、宮內(nèi)治療方法的選擇、分娩方式、下次妊娠選擇等)受主觀影響較大,因此需要多學(xué)科團隊參與,包括遺傳咨詢師、數(shù)據(jù)分析人員、影像科醫(yī)師等專業(yè)的團隊,建議給患者充分的解釋[33],并且了解產(chǎn)前測序的優(yōu)勢及局限性,做好詳細地知情告知,醫(yī)師與患者達成共識。

綜上所述,目前對CNS畸形胎兒的診斷,以細胞水平的染色體核型分析、分子水平的CMA、全外顯子技術(shù)為主,有些醫(yī)院還會運用這些技術(shù)進行輔助診斷,根據(jù)不同妊娠情況的臨床需求,更準(zhǔn)確地進行妊娠指導(dǎo)。分子技術(shù)仍然在發(fā)展階段,無論技術(shù)上或咨詢上還處在積累經(jīng)驗的過程。階段性的總結(jié)與分析可以更好地提高診斷水平,給孕婦提供更準(zhǔn)確的診斷意見。