周琴 劉新月 李紹仙 張曉花 譚文涵

摘 要：目的：采用液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀建立花生油中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法。方法：樣品提取經(jīng)免疫親和柱凈化，以甲酸水和乙腈為流動(dòng)相，采用phenomenx Kinetex 2.6 μm Biphenyl 100A色譜柱

（100 mm×3.0 mm）梯度洗脫分離，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)花生油中黃曲霉毒素B1進(jìn)行定性分析，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果：黃曲霉毒素B1在1～20 ng·mL-1線性內(nèi)呈良好線性關(guān)系（R2為0.999 3），在2.0 μg·kg-1、

5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1的加標(biāo)水平下，回收率在94.1%～107.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為5.6%～9.3%，采用該方法測(cè)定花生油中黃曲霉毒素B1質(zhì)控樣，檢測(cè)結(jié)果在質(zhì)控樣范圍內(nèi)。結(jié)論：該檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快捷、無(wú)需衍生、特異性強(qiáng)，靈敏度高且線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度和精密度均滿足定量分析的要求，適用于花生油中黃曲霉毒素B1的定量分析。

關(guān)鍵詞：液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）；黃曲霉毒素B1；花生油

Determination of Aflatoxin B1 in Peanut Oil by LC-MS-MS

ZHOU Qin， LIU Xinyue*， LI Shaoxian， ZHANG Xiaohua， TAN Wenhan

（Puer Comprehensive Technical Testing Center， Puer 665000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of aflatoxin B1 in peanut oil by LC-MS/MS. Method： The sample was extracted and purified by an immunoaffinity column. Formic acid water and acetonitrile were used as mobile phases， and the gradient elution separation was carried out on the phenomenx Kinetex 2.6 μm Biphenyl 100A chromatographic column （100 mm×3.0 mm）.The qualitative analysis of aflatoxin B1 in peanut oil was carried out by multiple reaction monitoring mode， and the quantity was determined by isotope internal standard. Result： Aflatoxin B1 showed a good linear relationship in the linear range of 1～20 ng·mL-1 （R2=0.999 3）， at the spiked levels of 2.0 μg·kg-1， 5.0 μg·kg-1 and 10.0 μg·kg-1， the average recovery rate was 94.1%～107.4%， and the relative standard deviation （n=6） was 5.6%～9.3% . The method was used to determine aflatoxin B1 quality control samples in peanut oil， and the detection results were within the range of quality control samples. Conclusion： This detection method is simple， fast， does not require derivatization， has strong specificity， and has high sensitivity and good linear relationship. The accuracy and precision meet the requirements of quantitative analysis， and is suitable for the quantitative analysis of aflatoxin B1 in peanut oil.

Keywords： liquid chromatography tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）; aflatoxin B1; peanut oil

花生油含有豐富的不飽和脂肪酸，其中油酸能降低低密度脂蛋白膽固醇水平，而不會(huì)破壞高密度脂蛋白，有助于維持血脂平衡，預(yù)防心血管疾病[1]。此外，油酸還具有抗炎、預(yù)防肥胖、預(yù)防衰老、預(yù)防動(dòng)脈硬化和增強(qiáng)自身免疫力的功能[2-3]。然而，在對(duì)人體有益的同時(shí)，花生油也存在安全隱患。黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是造成花生油污染的主要原因之一[4]，在自然界中其主要以黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2存在，具有強(qiáng)毒性、致癌性、致畸性和致突變性，而黃曲霉毒素B1（AFB1）含量最高[5-6]。何景等[7]2019年在抽檢北京小包裝花生油時(shí)，黃曲霉毒素檢出率為26.67%。胡振等[8]在對(duì)2016—2017年廣西14個(gè)地級(jí)市抽檢食用植物油樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)，花生油中黃曲霉毒素B1檢出率達(dá)到8.85%，花生油合格率僅為87.83%。真菌毒素是對(duì)人和動(dòng)物有嚴(yán)重慢性毒性的物質(zhì)[9]，如果大量攝入或長(zhǎng)期少量攝入黃曲霉毒素，可能會(huì)導(dǎo)致慢性中毒、增加致癌風(fēng)險(xiǎn)。因此，研究花生油中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法具有重要意義。

黃曲霉毒素檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[10]、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[11]等，酶聯(lián)免疫吸附法簡(jiǎn)單、快速、特異性高，但假陽(yáng)性較多；高效液相色譜法具有良好的準(zhǔn)確性和高靈敏度，但需要衍生，檢測(cè)周期長(zhǎng)，且較浪費(fèi)溶劑。液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）特異性強(qiáng)，定性定量準(zhǔn)確，檢出限低，從而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)殘、獸殘以及真菌毒素類的痕量檢測(cè)領(lǐng)域[12-15]。黃曲霉毒素的離子化狀態(tài)可利用電噴霧離子源實(shí)現(xiàn)，電噴霧離子源有正、負(fù)離子兩種模式，在正離子模式下效果最好[16]，因此，黃曲霉毒素離子化模式為ESI+。黃曲霉毒素凈化小柱包括兩個(gè)類型：多功能凈化柱與免疫親和柱。其中，多功能凈化柱采用復(fù)合材料，可以吸附蛋白質(zhì)、色素等[16]。盡管這種方法的凈化速度相對(duì)較快，但不能全面有效地消除干擾物質(zhì)。因此，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，多使用免疫親和柱來(lái)凈化樣品。本研究利用液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)花生油中黃曲霉毒素B1進(jìn)行定量分析，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（3200QTRAP，美國(guó)AB Scies）；色譜柱（phenomenex Kinetex 2.6 μm Biphenyl 100A，100 mm×3.0 mm）；3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；渦旋攪拌混勻器（英國(guó)Grant公司）；AL204電子天平（瑞士梅特勒）；IKA HS501振蕩器（德國(guó)IKA儀器設(shè)備有限公司）；N-EVAP-24氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）；微量可調(diào)移液槍（0.1～1.0 mL，德國(guó)Eppendorf公司）。

花生油，購(gòu)于沃爾瑪超市。黃曲霉毒素

B1（100 μg·mL-1，天津阿爾塔科技有限公司）；黃曲霉毒素B1內(nèi)標(biāo)液（0.5 μg·mL-1，天津阿爾塔科技有限公司）；乙腈（色譜純，德國(guó) Merck 公司）；黃曲霉毒素B1免疫親和柱（普瑞邦公司）；質(zhì)控樣[MRM-AO，質(zhì)控值范圍為（12.44±1.38）μg·kg-1，普瑞邦]；甲酸（分析純，阿拉丁公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)使用液配制

準(zhǔn)確移取1 mL濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇定容至10 mL，配制濃度為10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再準(zhǔn)確移取1 mL濃度為 10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇定容至10 mL，配制濃度為1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別吸取1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL和20 μL標(biāo)準(zhǔn)中間液于1 mL進(jìn)樣瓶中，并同時(shí)加入40 μL濃度為0.05 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1內(nèi)標(biāo)液，用初始流動(dòng)相定容至1 mL配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、6.0 ng·mL-1、8.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g試樣于50 mL離心管中，加入

20 μL濃度為1 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品和200 μL濃度為0.05 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1內(nèi)標(biāo)液，加入20 mL乙腈-水溶液（80+20），渦旋混勻，置于振蕩器振蕩20 min，離心，取上清液備用。準(zhǔn)確移取4 mL上清液，加入46 mL 0.1%吐溫-20 PBS溶液混勻，將待凈化液轉(zhuǎn)移至50 mL注射器筒內(nèi)，以恒定流速流經(jīng)已活化的免疫親和柱，20 mL超純水淋洗免疫親和柱，真空泵抽干。2 mL甲醇洗脫黃曲霉毒素B1免疫親和柱，真空泵抽干全部親和柱，在水浴條件下將洗脫液濃縮至近干，初始流動(dòng)相定容至

1 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，濾入樣品瓶上機(jī)測(cè)定。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：phenomenex Kinetex 2.6 μm Biphenyl-100A色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.6 ?m），進(jìn)樣量10.0 μL；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；柱溫35 ℃，梯度洗脫程序見表1。

質(zhì)譜條件：離子化模式ESI+，電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；接口溫度280 ℃；掃描方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器分析參數(shù)

將體積濃度為1 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1和內(nèi)標(biāo)單標(biāo)分別通過(guò)質(zhì)譜儀所配的外置進(jìn)樣泵進(jìn)樣，分別尋找其母離子和子離子并優(yōu)化碰撞電壓和去簇電壓。黃曲霉毒素B1及其內(nèi)標(biāo)在串聯(lián)質(zhì)譜上的檢測(cè)參數(shù)見表2，黃曲霉毒素B1及其內(nèi)標(biāo)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見圖1。

2.2 方法線性范圍和檢出限

在1.2.3儀器條件下，根據(jù)1.2.1配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、4 ng·mL-1、6 ng·mL-1、8 ng·mL-1、10 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1進(jìn)樣分析；工作曲線橫坐標(biāo)為目標(biāo)物質(zhì)量濃度C（ng·mL-1）；工作曲線縱坐標(biāo)為黃曲霉毒素B1峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比。圖2為黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線所擬合的線性方程。由圖2可知該檢測(cè)方法在1～20 ng·mL-1的質(zhì)量濃度內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3。

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

在花生油空白基質(zhì)中分別加入3個(gè)水平的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，混勻1 min，使花生油空白基質(zhì)與所加入的標(biāo)準(zhǔn)品充分接觸后，加入200 μL濃度為0.05 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1內(nèi)標(biāo)液，按1.2.2中的方法充分提取和凈化后檢測(cè)。每個(gè)進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD），以考察方法的準(zhǔn)確度和精確度，結(jié)果見表3。

由表3可知，在不同加標(biāo)水平下，黃曲霉毒素B1的回收率在94.1%～107.4%，相對(duì)偏差（RSD）為5.6%～9.3%，回收率滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）食品理化檢驗(yàn)中回收率要求即加標(biāo)量小于0.1 mg·kg-1時(shí)回收率為60%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%。表明該方法的回收率和精密度滿足花生油中黃曲霉毒素B1殘留檢測(cè)的要求。

2.4 質(zhì)控樣測(cè)定

將所購(gòu)質(zhì)控樣采用該方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為13.12 μg·kg-1，質(zhì)控樣質(zhì)控值為（12.44±1.38）μg·kg-1，測(cè)定值在質(zhì)控值范圍內(nèi)，表明該方法對(duì)花生油中黃曲霉毒素B1陽(yáng)性樣品的測(cè)定具有較高的準(zhǔn)確性，適用于實(shí)驗(yàn)室中花生油中黃曲霉毒素B1的準(zhǔn)確定量分析。

3 結(jié)論

本研究建立了花生油中黃曲霉毒素B1的LC-MS/MS測(cè)定方法，樣品前處理采用免疫親和柱技術(shù)，該方法無(wú)需進(jìn)行衍生，簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高，特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度和精密度均滿足定量分析的要求。在1～

20 ng·mL-1線性內(nèi)呈良好線性關(guān)系（R2為0.999 3），在2.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1的加標(biāo)水平下，回收率在94.1%～107.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為5.6%～9.3%，采用該方法測(cè)定花生油中黃曲霉毒素質(zhì)控樣，檢測(cè)結(jié)果在質(zhì)控樣質(zhì)控值范圍內(nèi)。因此，該方法可用于花生油中黃曲霉毒素B1的快速檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)

[1]STEPHENS A M，DEAN L L，DAVIS J P，et al.Peanuts， peanut oil， and fat free peanut flour reduced cardiovascular disease risk factors and the development of atherosclerosis in syrian golden Hamsters[J].Journal of Food Science，2010，75（4）：116-122.

[2]SALES-CAMPOS H，PATRICIA R D S，CREMA PEGHINI B，et al.An overview of the modulatory effects of oleic acid in health and disease[J].Mini Reviews in Medicinal Chemistry，2013，13（2）：201-210.

[3]VASSILIOU E K，GONZALEZ A，GARCIA C，et al.Oleic acid and peanut oil high in oleic acid reverse the inhibitory effect of insulin production of the inflammatory cytokine TNF-α both in vitro and in vivo systems[J].Lipids in Health and Disease，2009，8（1）：25.

[4]BHAT R R，KASA R N.Challenges and issues concerning mycotoxins contamination in oil seeds and their edible oils： updates from last decade[J].Food Chemistry，2017，215（15）：425-437.

[5]勞文艷，林素珍.黃曲霉毒素對(duì)食品的污染及危害[J].北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，25（1）：64-69．

[6]齊惠萍，呂建明，李常青.ELISA法檢測(cè)食醋中黃曲霉毒素B1方法的改進(jìn)[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2008，20（4）：313-315．

[7]何景，楊丹.北京市地區(qū)小包裝食用油中真菌毒素污染狀況調(diào)查[J].中國(guó)油脂，2019，44（6）：79-82.

[8]胡振，周芳華，韋波.2016—2017年廣西食用植物油質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)分析[J].中國(guó)油脂，2020，45（2）：91-94.

[9]孫嘉笛，徐洪文，徐一達(dá)，等.食用植物油中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素的污染狀況及特征分析[J].中國(guó)油脂，2022，47（9）：35-43.

[10]江濤，柳楨，鄭佳，等.總黃曲霉毒素ELISA定量檢測(cè)方法的研制[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2006，18（4）：292-296.

[11]高秀芬，計(jì)融，李燕俊，等.高效液相色譜法測(cè)定玉米中的黃曲霉毒素[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2007，19（2）：105-108.

[12]李優(yōu)，盛永剛，伊雄海，等.固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定果蔬中草銨膦的殘留量[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2015，34（9）：993-998.

[13]郭欣妍，王娜，郝利君，等.超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水、土壤及糞便中25種抗生素[J].分析化學(xué)，2015，43（1）：13-20.

[14]羅輝泰，黃曉蘭，吳惠勤，等.分散固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定飼料中87種藥物殘留[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2015，34（9）：979-985.

[15]曾濤，羅曉燕，胡國(guó)媛，等.茶葉中黃曲霉毒素的碘柱后衍生化和光化學(xué)柱后衍生化-高效液相色譜法比較[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，26（3）：323-325.

[16]邢天一.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食品中的黃曲霉毒素實(shí)踐探討[J].農(nóng)民致富之友，2017（23）：244.