路海玲 楊文君 張登山 王麗

摘要：【目的】鑒定分析核桃（Juglans regia L.）分支酸變位酶（chorismate mutase，CM）家族基因，為解析莽草酸途徑（shikimic acid pathway）代謝調(diào)控的分子機(jī)制提供參考。【方法】基于核桃全基因組數(shù)據(jù)，通過(guò)HMM搜索對(duì)CM家族成員進(jìn)行篩選鑒定，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其在核桃不同組織中的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】核桃基因組內(nèi)共鑒定到7 個(gè)CM家族基因，分布于6 條染色體上，JrCM6 與JrCM7 位于同一條染色體，其余基因分別位于不同的染色體上。各基因均含有5～6 個(gè)外顯子，結(jié)構(gòu)保守。預(yù)測(cè)表明，核桃CM均為親水性蛋白且定位于葉綠體上，其中JrCM5 含有信號(hào)肽。除JrCM4 外，其余成員均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示核桃CM家族蛋白與模板蛋白AtCM1 間具有較高的相似性。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，植物CM蛋白可分為4 個(gè)大組，核桃CM蛋白聚集在第Ⅱ和Ⅳ分支上。其中JrCM2和JrCM5 聚集在第Ⅱ支系，與胡楊CM同源蛋白Potri.T174200 的親緣關(guān)系較近；JrCM6、JrCM7、JrCM4、JrCM1 及Jr-CM3 聚集在第Ⅳ支系上；JrCM6、JrCM7 和JrCM4 與葡萄CM同源蛋白GSVIVG01010091001 的親緣關(guān)系最近；而Jr-CM1 和JrCM3 則與蝴蝶蘭CM同源蛋白PEQU04269 的親緣關(guān)系最近。對(duì)啟動(dòng)子順勢(shì)作用原件的預(yù)測(cè)表明，除CAATbox和TATA-box 外，各基因啟動(dòng)子中共發(fā)現(xiàn)光響應(yīng)、激素響應(yīng)、脅迫響應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、生長(zhǎng)和發(fā)育響應(yīng)及晝夜節(jié)律等7 大類調(diào)控元件，其中MYB、ERE、MYC、Box 4、G-box、ABRE、ARE、STRE、O2-site、TCA-element 的數(shù)量最多，這與CM基因主要受到光照、逆境脅迫調(diào)控的結(jié)論較為一致。qRT-PCR定量檢測(cè)結(jié)果表明，7 個(gè)基因在核桃葉、莖、果柄和青皮中均有表達(dá)，且其表達(dá)量與趨勢(shì)各不相同故具有組織特異性?！窘Y(jié)論】在核桃基因組中，共計(jì)鑒定得到7 個(gè)CM家族基因，該家族蛋白具有理化特征、三維結(jié)構(gòu)上的保守性，啟動(dòng)子區(qū)域具有響應(yīng)多種不同信號(hào)的順式作用元件。研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明核桃CM基因在莽草酸途徑中的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：核桃；CM基因家族；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S664.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）06-1072-13

莽草酸代謝途徑（shikimic acid pathway，SAP）是植物和微生物中的樞紐性代謝[1]，具有聯(lián)系糖代謝和次生代謝的橋梁紐帶作用。SAP途徑由7 個(gè)酶促反應(yīng)組成[2]，其中分支酸變位酶（chorismate mutase，CM）是SAP 途徑的第七步酶[3]，催化分支酸生成預(yù)苯酸。在SAP途徑的作用下，碳源由莽草酸途徑進(jìn)入苯丙烷代謝途徑，形成芳香族氨基酸（色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸）、水楊酸、吲哚乙酸（IAA）等次生代謝物合成的前體。作為莽草酸途徑的出口酶，CM控制著SAP途徑的碳源流向，其下游途徑所合成的次生代謝物與植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境防御、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要過(guò)程的關(guān)系密切[4-6]。特別是由于哺乳動(dòng)物中不存在SAP 途徑，CM對(duì)動(dòng)物的氨基酸營(yíng)養(yǎng)具有重要意義。此外，分支酸變位酶一直以來(lái)都是生物化工和制藥行業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)，該酶可作為工程菌改造的靶點(diǎn)以提高L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的產(chǎn)率[7]。與此同時(shí)，病原CM也是某些疾病（例如肺結(jié)核）治療藥物開(kāi)發(fā)的潛在靶點(diǎn)[8]。目前在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中共發(fā)現(xiàn)3 個(gè)CM編碼基因，其中AtCM1 和AtCM3 定位于葉綠體，表達(dá)受苯丙氨酸及酪氨酸的反饋調(diào)節(jié)；AtCM2 定位于細(xì)胞質(zhì)中，其活性不受芳香族氨基酸的影響[9-10]。CM的表達(dá)具有組織特異性，其活性和表達(dá)量受逆境、損傷和紫外照射誘導(dǎo)[4]，葡萄（Vitis vinifera）的VvCM1 和VvCM2基因在各器官組織中均有表達(dá)，VvCM1 在果實(shí)中表達(dá)豐度最高，VvCM2在莖中表達(dá)豐度最高，在果實(shí)中不同部位隨果實(shí)發(fā)育期表達(dá)具有特異性[4]。VvCM1活性不受芳香族氨基酸調(diào)控，但VvCM2 的催化活性受色氨酸的影響而顯著上調(diào)。矮牽牛（Petuniahybrida）中定位于質(zhì)體中的PhCM1 受色氨酸的變構(gòu)調(diào)節(jié)，但是不受苯丙氨酸和酪氨酸的反饋調(diào)節(jié)[11]。核桃（Juglans regia L.）為胡桃科胡桃屬經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，堅(jiān)果碩大且營(yíng)養(yǎng)豐富[12]。核桃富含多酚和抗氧化活性物質(zhì)，因而具有較好的保健功能[13]。目前，莽草酸代謝途徑與核桃次生代謝合成的關(guān)聯(lián)研究較少，但就核桃化感關(guān)鍵物質(zhì)胡桃醌合成途徑的研究表明[14]，胡桃醌的合成以莽草酸代謝途徑產(chǎn)生的物質(zhì)為前體。鑒于莽草酸途徑與核桃次生代謝物合成的密切聯(lián)系，開(kāi)展該合成途徑關(guān)鍵酶的研究可進(jìn)一步深化對(duì)核桃次生代謝物合成調(diào)控的認(rèn)識(shí)。筆者基于核桃的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)[15]開(kāi)展核桃CM家族基因的篩選鑒定，分析了該家族基因的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和進(jìn)化關(guān)系，并對(duì)CM家族基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行qPCR定量。本研究為探究核桃CM家族基因的功能及其在莽草酸途徑中的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

筆者在本研究中以青海省農(nóng)林科學(xué)院引種的優(yōu)良品種遼寧1 號(hào)[16]核桃為研究對(duì)象，試驗(yàn)材料采集于2016 年嫁接的貴德縣河?xùn)|鄉(xiāng)核桃良種嫁接區(qū)（東經(jīng)101°26′48″，北緯36°02′39″）。核桃果實(shí)7 月進(jìn)入硬核期，果實(shí)大小已基本定型，青皮成熟，隨機(jī)選取3 株長(zhǎng)勢(shì)均一植株進(jìn)行樣本采集。采集植株1 年生枝條的成熟葉片、莖、果實(shí)青皮及果柄，并進(jìn)行混樣處理，經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 核桃CM基因家族成員的鑒定

核桃CM 家族基因的鑒定使用HMM 搜索和BLAST 相結(jié)合的方式進(jìn)行，核桃基因組數(shù)據(jù)從EnsemblPlants 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//plants.ensembl.org/index.html）獲取。搜索使用的HMM模型CM_1（PF07736）和CM_2（PF01817）從Pfam（http：//pfam.xfam.org/）下載。本地BLAST 以擬南芥AtCM1（AT3G29200）為種子序列，E-value 閾值設(shè)定為1×10-10，經(jīng)BLASTp搜索后鑒定核桃CM蛋白。初篩序列經(jīng)比對(duì)后，濾除冗余序列。所有序列經(jīng)SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）和CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行CM 結(jié)構(gòu)域確認(rèn)后得到核桃CM家族基因。

1.3 核桃CM基因家族的特征分析

通過(guò)在線軟件ProtParam 預(yù)測(cè)CM家族蛋白結(jié)構(gòu)，分析目的基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成、蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)及穩(wěn)定性等參數(shù)。采用ExPASy 中的ProtScale 工具對(duì)核桃CM基因編碼蛋白的疏水性和親水性進(jìn)行預(yù)測(cè)。根據(jù)從基因組注釋文件中獲取的CM基因家族在染色體上的位置數(shù)據(jù)，對(duì)其染色體定位進(jìn)行可視化分析。利用在線軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant- multi/）進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)使用TMHMM Server v. 2.0 在線工具進(jìn)行。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)使用SWISS-MODEL進(jìn)行。

1.4 核桃CM基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子及結(jié)構(gòu)域的分析

從基因組注釋文件中提取基因結(jié)構(gòu)信息，并使用TBtools 對(duì)基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析。使用TBtools 軟件提取7 個(gè)核桃CM 基因的啟動(dòng)子序列（ATG起始密碼上游2 kb），并將序列提交至PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bioinformatics. psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）[17]進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)，結(jié)果的可視化分析使用TBtools[18]進(jìn)行。

1.5 CM蛋白序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用CLUSTALW軟件對(duì)CM基因編碼蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，使用ESPript 3 expript 查看比對(duì)結(jié)果。其余CM家族蛋白序列從PLAZA數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/versions/plaza_v4_dicots/）獲取。使用MEGA11 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，構(gòu)建采用鄰接法（neighbor- joining，NJ），Poissonmodel 模型，Bootstrap 值設(shè)為1000。進(jìn)化樹(shù)的美化采用Evolview（http：//www.evolgenius.info/evolview/#/treeview）進(jìn)行。

1.6 核桃CM基因的組織表達(dá)特異性分析

使用Oligo Architect Online 在線工具設(shè)計(jì)CM基因熒光定量引物，內(nèi)參基因選擇Walnut18S，引物序列詳細(xì)信息見(jiàn)表1。使用RNAprep Pure 試劑盒（天根）提取組織總RNA，實(shí)時(shí)定量反應(yīng)以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，使用賽默飛7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行。實(shí)時(shí)定量PCR 的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃10 min；95 ℃ 15 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 15 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，使用2-ΔΔCt法[19]計(jì)算CM基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃CM基因家族鑒定及特征分析

通過(guò)HMM搜索、序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)域確認(rèn)，最終選定7 條核桃CM家族基因序列，7 條序列的理化性質(zhì)見(jiàn)表2。核桃CM家族基因?qū)?yīng)編碼的氨基酸數(shù)為258～367 個(gè)，蛋白分子質(zhì)量為29.26～41.74 ku，理論等電點(diǎn)為5.72～8.64，不穩(wěn)定系數(shù)為47.67～57.64（＞40），表明7 個(gè)CM蛋白均為不穩(wěn)定性蛋白；其平均親/疏水性均小于0，故均為親水性蛋白；除JrCM5外其余成員均無(wú)信號(hào)肽，JrCM5 的信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于第24 和25 個(gè)氨基酸殘基之間。染色體定位分析（表2、圖1）顯示7 個(gè)成員分布在6 條染色體上，其中JrCM1、JrCM2、JrCM3、JrCM4、JrCM5 五個(gè)基因均分布于不同的染色體上；JrCM6 和JrCM7 兩個(gè)基因均位于16 號(hào)染色體上。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，核桃CM蛋白均定位于葉綠體中。

對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)顯示，核桃CM家族蛋白中僅JrCM4 蛋白N端含有1 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其余各成員均無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖2），CM 家族成員具有與模板蛋白（擬南芥AtCM1 蛋白4ppu.1.A）相似的結(jié)構(gòu)，核桃CM家族蛋白與模板蛋白的序列相似度總體較高。其中JrCM5和JrCM2 與AtCM1 的相似度最低，分別為53.10%和 55.05%；其余序列相似度均在68%以上。

2.2 核桃CM基因啟動(dòng)子順勢(shì)作用原件、基因結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)分析7 個(gè)CM家族基因的啟動(dòng)子區(qū)域（圖3），發(fā)現(xiàn)除典型的CAAT-box 和TATA-box 外，還包含光響應(yīng)（AT1-motif、G-box、GA-motif、Gap-box、AE- box 等）、激素響應(yīng)（ABRE、CGTCA- motif、TGA-element、TGACG-motif、as-1 等）、脅迫響應(yīng)（AAGAA- motif、LTR、ARE、STRE、WUN- motif等）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（AC- I、MYB、W box、MYC、AP-1 等）、生長(zhǎng)和發(fā)育響應(yīng)（CAT-box、MSAlike、GCN4-motif、RY-element、AT-rich element 等）、晝夜節(jié)律調(diào)控（circadian）等7 大類，296 個(gè)順式作用元件，部分元件的功能不明（如A-box 和BoxⅢ）。以7 個(gè)JrCM 基因的元件總數(shù)計(jì)，MYB 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量最多（表3），其次為ERE 乙烯響應(yīng)原件，但同一元件在不同JrCM 基因啟動(dòng)子中的數(shù)量不一。此外，供MYC 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（MYC）、光響應(yīng)調(diào)節(jié)（Box 4、G-box）、激素響應(yīng)（ABRE、O2-site、TCA-element）和脅迫響應(yīng)（ARE、STRE）的相關(guān)元件數(shù)量也較多?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示（圖4），核桃CM家族基因的外顯子數(shù)量變化不大，均為5～6 個(gè)。各基因長(zhǎng)度差異主要是內(nèi)含子的長(zhǎng)度差異較大導(dǎo)致的。

分析7 個(gè)核桃CM的保守基序和保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示核桃CM家族基因中共得到10 種保守基序：7個(gè)核桃CM 蛋白均含有該家族特有的CM_2 結(jié)構(gòu)域，且PLN02344 和CM-plyst 亞結(jié)構(gòu)域完整（圖5）。結(jié)合基序分析結(jié)果可以看出，CM_2 的特征性結(jié)構(gòu)域主要由Motif 1、2、3、4 所構(gòu)成（圖6），特別是Jr-CM2 僅含有上述4 個(gè)基序，且上述4 個(gè)基序在所有7個(gè)核桃CM家族蛋白中都是保守的。部分基序具有一定的特異性，如Motif 8 僅存在于JrCM3 和JrCM5中；Motif 9 僅存在于JrCM3、JrCM1 和JrCM4 中，而Motif 10（289～293 bp）僅存在于JrCM7、JrCM6 和Jr-CM3 中。

2.3 核桃CM家族蛋白的多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)7 個(gè)核桃CM 家族蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該家族成員間具有較高的序列相似度和同源性（圖7）。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明（圖8）CM家族蛋白可分為4 個(gè)亞組，源自核桃的7 個(gè)CM蛋白主要分布在Ⅱ和Ⅳ兩個(gè)較大的支系上。其中JrCM2 和Jr-CM5 聚集在第Ⅱ支系，與胡楊（Populus trichocar- pa）CM 同源蛋白Potri.T174200 的親緣關(guān)系較近；JrCM6、JrCM7、JrCM4、JrCM1 及JrCM3 聚集在第Ⅳ 支系上，其中JrCM6、JrCM7 和JrCM4 與葡萄CM 同源蛋白GSVIVG01010091001 的親緣關(guān)系最近；而JrCM1 和JrCM3 則與蝴蝶蘭（Phalaenopsisaphrodite）CM同源蛋白PEQU04269 的親緣關(guān)系最近。

2.4CM家族基因的組織特異性表達(dá)分析

筆者分析了該家族7 個(gè)基因在不同組織（葉、莖、果柄、青皮）中的表達(dá)量（圖9），結(jié)果顯示：該家族基因在各組織中均有表達(dá)，但表達(dá)模式存在差異。JrCM4 在果柄中的表達(dá)量最高，顯著高于葉和青皮；JrCM2 在果柄中的轉(zhuǎn)錄水平較高，顯著高于其他3 個(gè)組織，其他各組織間不存在顯著差異；JrCM1在莖和果柄中的表達(dá)量較高，顯著高于葉和青皮；JrCM5 在葉片中的表達(dá)量最高，顯著高于莖，莖顯著高于果柄和青皮；JrCM3 的表達(dá)量在各組織間不存在顯著差異；JrCM6 在葉和莖中的表達(dá)量顯著高于果柄和青皮；JrCM7 在莖中的表達(dá)量最高，顯著高于其他3 個(gè)組織。上述結(jié)果說(shuō)明：核桃CM基因在各個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá)，預(yù)示各成員在功能上可能存在分化和差異。

3 討論

莽草酸途徑具有聯(lián)系植物初級(jí)代謝和次生代謝的樞紐作用，對(duì)次生代謝物豐富的核桃（如青皮）來(lái)說(shuō)具有重要意義。多酚類物質(zhì)的生物合成是莽草酸途徑下游的一個(gè)分支，迄今大量的研究只關(guān)注與多酚生物合成緊密相連的苯丙烷代謝途徑和類黃酮代謝途徑，對(duì)其碳供應(yīng)鏈上游的莽草酸途徑報(bào)道較少[4]。核桃作為經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種，堅(jiān)果富含多種氨基酸、多酚及高抗氧化性的次生代謝物，開(kāi)展莽草酸途徑關(guān)鍵酶的研究對(duì)提升核桃品質(zhì)具有重要意義。目前關(guān)于CM的研究多集中于微生物和植物中，如大腸桿菌（Escherichia coli）[20]、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis）[21]、葡萄[4]、玉米（Zea mays）[22]、擬南芥[10]、龍須菜（Gracilariopsis lemaneiformis）[23]等。較為有趣的是，CM不僅是動(dòng)物病原的有效靶點(diǎn)，在近期關(guān)于植物病原與宿主的相關(guān)作用研究中發(fā)現(xiàn)，核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary] 分支酸變位酶SsCm1 可直接與大豆（Glycine max）CM蛋白相互作用，抑制水楊酸的合成[24]。與此類似，黑粉菌（Ustilago maydis）的分支酸變位酶可通過(guò)與宿主CM蛋白間形成二聚體降低胞內(nèi)水楊酸水平，進(jìn)而達(dá)到抑制宿主免疫的目的[25]。目前，關(guān)于核桃CM基因的研究尚屬空白，筆者在本研究中基于核桃的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，共鑒定出7 個(gè)核桃CM家族基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。7 個(gè)CM家族蛋白中，僅JrCM5 含有信號(hào)肽，這與矮牽牛PhCM1、丹參（Salvia miltiorrhiza）SmCM1 的結(jié)構(gòu)特征一致[6]，表明JrCM5 可能為外泌蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，核桃CM蛋白均定位于葉綠體中，這與其他報(bào)道中分支酸變位酶發(fā)揮作用的部位較為一致。結(jié)合現(xiàn)有報(bào)道所闡釋的CM同源蛋白的功能，可以推測(cè)出核桃CM蛋白不僅直接參與了重要次生代謝產(chǎn)物的合成，且極有可能也是病原-宿主相互作用中的重要靶點(diǎn)。病原可能通過(guò)操縱核桃分支酸變位酶干擾植株水楊酸合成，進(jìn)而影響其防御反應(yīng)[26-27]。

核桃CM基因啟動(dòng)子區(qū)域含有光、激素、逆境脅迫以及生長(zhǎng)和發(fā)育、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、晝夜節(jié)律調(diào)控等多種順式作用元件，說(shuō)明影響核桃CM家族基因轉(zhuǎn)錄的因素是多樣的，但轉(zhuǎn)錄因子（MYB、MYC）、光照、逆境脅迫（缺氧、干旱）、ABA（ABRE）、赤霉素（O2-site）、水楊酸（TCA-element）可能是調(diào)控JrCM表達(dá)的主要因素，這與其他植物中已報(bào)道的CM基因易受逆境、光照度、紫外照射等影響和調(diào)控的結(jié)論較為一致[28-29]。李小溪[4]的研究證實(shí)環(huán)境因子可誘導(dǎo)MYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，促進(jìn)其與莽草酸途徑相關(guān)基因啟動(dòng)子順式作用原件的結(jié)合，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄和莽草酸-類黃酮途徑代謝產(chǎn)物的積累。

核桃青皮富含多酚類物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抑菌、抗氧化活性，核桃1 年生枝條和葉片的酚類物質(zhì)含量在6—7 月份呈現(xiàn)上升狀態(tài)[13]，筆者在本研究中選擇7 月份核桃生長(zhǎng)關(guān)鍵時(shí)期對(duì)核桃各組織進(jìn)行采樣，研究JrCM 家族基因的組織特異性表達(dá)，結(jié)果顯示該家族基因在各組織中均有表達(dá)，但表達(dá)模式存在差異。擬南芥的AtCM1 和AtCM3 基因在花器中表達(dá)最高，但在根和莖中表達(dá)量較低，活性受芳香族氨基酸的調(diào)節(jié)；AtCM2 基因在根中的表達(dá)量最高，其次是莖和葉，其活性基本不受芳香族氨基酸的影響[9]。丹參SmCM1 在莖和葉中的表達(dá)量分別為根中1.8 和2.8 倍，并且可受酵母和銀離子的聯(lián)合誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)[6]，進(jìn)而大量合成苯丙氨酸和酪氨酸，最終提高體內(nèi)酚酸類化合物的含量。葡萄VvCM1 和VvCM2 在果實(shí)中不同部位隨發(fā)育期表達(dá)具有特異性，VvCM1 在果實(shí)中豐度最高，而VvCM2 在莖中表達(dá)量最高，葡萄CM同源基因的差異表達(dá)可能與光合同化產(chǎn)物通過(guò)莽草酸途徑大量流向原花色素、酚酸和木質(zhì)素的合成有關(guān)[30]。

核桃CM家族基因在不同組織中的表達(dá)具有普遍性，這與CM的“樞紐”作用有關(guān)。核桃中含有豐富的酚類物質(zhì)，是苯丙烷代謝和類黃酮代謝途徑的產(chǎn)物或衍生物，均與莽草酸代謝途徑的關(guān)系密切。了解分支酸變位酶家族基因及其表達(dá)特性，有助于更好地理解核桃代謝產(chǎn)物（各類氨基酸、酚類和抗氧化活性物質(zhì)）的生成，但次生代謝產(chǎn)物對(duì)CM活性的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。鑒于CM在植物-病原相互作用中的重要作用，分析CM在核桃抗病中的功能也是值得探索的方向。

4 結(jié)論

筆者在本研究中鑒定得到了7 個(gè)核桃CM 家族基因，分別為JrCM1～7，均為不穩(wěn)定的親水性蛋白。其中JrCM4、JrCM2 和JrCM1 的pH 小于7，顯酸性，其余4 個(gè)顯堿性。7 個(gè)基因分布在6 條染色體上，其中JrCM6 和JrCM7 定位在同一條染色體上，且兩者的理化性質(zhì)、親緣關(guān)系及相似度均較高，故這2 個(gè)基因可能具有更為相似的生物學(xué)功能。分析各基因的啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)，核桃CM 的轉(zhuǎn)錄受控于7 個(gè)大類多種不同類型的順式作用原件，其中轉(zhuǎn)錄因子（MYB、MYC）、光照、激素（ABA、赤霉素、水楊酸）和逆境脅迫（缺氧、干旱）可能是調(diào)控JrCM 表達(dá)的關(guān)鍵因素。表達(dá)分析結(jié)果顯示，JrCM 在核桃的不同組織中表達(dá)量各不相同，顯示具有組織特異性。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，植物CM 蛋白可分為4 個(gè)大組，其中核桃CM蛋白主要聚集在第Ⅱ和Ⅳ分支上。本研究結(jié)果豐富和深化了對(duì)核桃CM家族基因的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步開(kāi)展基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)References：

[1] RUAN J，HAERDTER R，GEREND?S J. Impact of nitrogensupply on carbon/nitrogen allocation：A case study on amino acidsand catechins in green tea [Camellia sinensis （L.） O. Kuntze]plants[J]. Plant Biology，2010，12（5）：724-734.

[2] CHEN K，DOU J，TANG S R，YANG Y S，WANG H，F(xiàn)ANG HQ，ZHOU C L. Deletion of thearoK gene is essential for highshikimic acid accumulation through the shikimate pathway inE.coli[J]. Bioresource Technology，2012，119：141-147.

[3] OSBORNE A，THORNELEY R N F，ABELL C，BORNEMANNS. Studies with substrate and cofactor analogues provideevidence for a radical mechanism in the chorismate synthasereaction[J]. Journal of Biological Chemistry，2000，275（46）：35825-35830.

[4] 李小溪. 葡萄果實(shí)莽草酸途徑和類黃酮代謝協(xié)同調(diào)節(jié)機(jī)制的研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

LI Xiaoxi. Collaborative expression mechanism between shikimatepathway and flavonoid metabolism[D]. Beijing：China AgriculturalUniversity，2016.

[5] ZHANG Z Z，LI X X，CHU Y N，ZHANG M X，WEN Y Q，DUAN C Q，PAN Q H. Three types of ultraviolet irradiation differentiallypromote expression of shikimate pathway genes andproduction of anthocyanins in grape berries[J]. Plant Physiologyand Biochemistry，2012，57：74-83.

[6] 王亞君，黃璐琦，蔣超，申業(yè). 丹參分支酸變位酶基因的克隆和生物信息學(xué)分析[J]. 中國(guó)中藥雜志，2013，38（11）：1697-1702.

WANG Yajun，HUANG Luqi，JIANG Chao，SHEN Ye. Cloningand bioinformatics analysis of chorismate mutase gene fromSalviamiltiorrhiza[J]. China Journal of Chinese Materia Medica，2013，38（11）：1697-1702.

[7] CH?VEZ-B?JAR M I，LARA A R，L?PEZ H，HERN?NDEZCH?VEZG，MARTINEZ A，RAM?REZ O T，BOL?VAR F，GOSSET G. Metabolic engineering ofEscherichia coli for L-tyrosineproduction by expression of genes coding for the chorismatemutase domain of the native chorismate mutase- prephenatedehydratase and a cyclohexadienyl dehydrogenase fromZymomonas mobilis[J]. Applied and Environmental Microbiology，2008，74（10）：3284-3290.

[8] SCHNEIDER C Z，PARISH T，BASSO L A，SANTOS D S. Thetwo chorismate mutases from bothMycobacterium tuberculosisandMycobacterium smegmatis：Biochemical analysis and limitedregulation of promoter activity by aromatic amino acids[J].Journal of Bacteriology，2008，190（1）：122-134.

[9] MOBLEY E M，KUNKEL B N，KEITH B. Identification，characterizationand comparative analysis of a novel chorismate mutasegene inArabidopsis thaliana[J]. Gene，1999，240（1）：115-123.

[10] WESTFALL C S，XU A，JEZ J M. Structural evolution of differentialamino acid effector regulation in plant chorismate mutases[J]. The Journal of Biological Chemistry，2014，289（41）：28619-28628.

[11] COLQUHOUN T A，SCHIMMEL B C J，KIM J Y，REINHARDTD，CLINE K，CLARK D G. A petunia chorismate mutasespecialized for the production of floral volatiles[J]. ThePlant Journal，2010，61（1）：145-155.

[12] 劉暢，周家春. 植物多酚抗氧化性研究[J]. 糧食與油脂，2011，24（2）：43-46.

LIU Chang，ZHOU Jiachun. Research on antioxidation of plantpolyphenols[J]. Cereals & Oils，2011，24（2）：43-46.

[13] 周曄，王偉，王成章，裴東. 核桃屬（Juglans）植物多酚類物質(zhì)研究進(jìn)展[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，37（5）：146-152.

ZHOU Ye，WANG Wei，WANG Chengzhang，PEI Dong. Researchprogress on polyphenols fromJuglans plants[J]. Journalof Nanjing Forestry University （Natural Sciences Edition），2013，37（5）：146-152.

[14] MCCOY R M，UTTURKAR S M，CROOK J W，THIMMAPURAMJ，WIDHALM J R. The origin and biosynthesis ofthe naphthalenoid moiety of juglone in black walnut[J]. Horticul- ture Research，2018，5：67.

[15] MART?NEZ-GARC?A P J，CREPEAU M W，PUIU D，GONZALEZ-IBEAS D，WHALEN J，STEVENS KA，PAULR，BUTTERFIELDT S，BRITTON M T，REAGAN R L，CHAKRABORTYS，WALAWAGE S L，VASQUEZ-GROSS H A，CARDENO C，F(xiàn)AMULA R A，PRATT K，KURUGANTI S，ARADHYA M K，LESLIE C A，DANDEKAR A M，SALZBERG S L，WEGRZYNJ L，LANGLEY C H，NEALE D B. The walnut （Juglansregia） genome sequence reveals diversity in genes codingfor the biosynthesis of non-structural polyphenols[J]. The PlantJournal，2016，87（5）：507-532.

[16] 劉小利，魏海斌，顧文毅，廖東. 五個(gè)早實(shí)薄皮核桃品種的區(qū)域引種試驗(yàn)[J]. 北方園藝，2017（22）：67-70.

LIU Xiaoli，WEI Haibin，GU Wenyi，LIAO Dong. Regional introductionexperiment of five early walnut varieties[J]. NorthernHorticulture，2017（22）：67-70.

[17] LESCOT M，D?HAIS P，THIJS G，MARCHAL K，MOREAUY，VAN DE PEER Y，ROUZ? P，ROMBAUTS S. PlantCARE，a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal totools for in silico analysis of promoter sequences[J]. Nucleic AcidsResearch，2002，30（1）：325-327.

[18] CHEN C J，CHEN H，ZHANG Y，THOMAS H R，F(xiàn)RANK MH，HE Y H，XIA R. TBtools：An integrative toolkit developedfor interactive analyses of big biological data[J]. MolecularPlant，2020，13（8）：1194-1202.

[19] VANDESOMPELE J，DE PRETER K，PATTYN F，POPPE B，VAN ROY N，DE PAEPE A，SPELEMAN F. Accurate normalizationof real-time quantitative RT-PCR data by geometric averagingof multiple internal control genes[J]. Genome Biology，2002，3（7）：0034.

[20] 錢晉. 大腸桿菌莽草酸代謝途徑的相關(guān)研究[D]. 上海：華東理工大學(xué)，2011.

QIAN Jin. The study of shikimic acid pathway ofEscherichiacoli[D]. Shanghai：East China University of Science and Technology，2011.

[21] FONSECA I O，SILVA R G，F(xiàn)ERNANDES C L，DE SOUZA ON，BASSO L A，SANTOS D S. Kinetic and chemical mechanismsof shikimate dehydrogenase fromMycobacterium tuberculosis[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，2007，457（2）：123-133.

[22] SODERLUND C，DESCOUR A，KUDRNA D，BOMHOFF M，BOYD L，CURRIE J，ANGELOVA A，COLLURA K，WISSOTSKIM，ASHLEY E，MORROW D，F(xiàn)ERNANDES J，WALBOTV，YU Y. Sequencing，mapping，and analysis of 27，455maize full- length cDNAs[J]. PLoS Genetics，2009，5（11）：e1000740.

[23] 林麗春，呂燕，孫鵬，孫雪，徐年軍. 龍須菜（Gracilariopsis lemaneiformis）中兩種分支酸代謝酶對(duì)溫度和水楊酸的響應(yīng)及其原核表達(dá)研究[J]. 海洋與湖沼，2019，50（1）：220-227.

LIN Lichun，L? Yan，SUN Peng，SUN Xue，XU Nianjun. Responsesof two chotismate metabolic enzymes to temperatureand salicylic acid in gracilariopsis lemaneiformis and their prokaryoticexpression analysis[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica，2019，50（1）：220-227.

[24] 楊鳳. 核盤菌分支酸變位酶SsCm1 的作用機(jī)制研究[D]. 長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2021.

YANG Feng. Pathogenic mechanism of chorismate mutase Ss-Cm1 in theSclerotinia sclerotiorum[D]. Changchun：Jilin University，2021.

[25] HAN X W，ALTEGOER F，STEINCHEN W，BINNEBESELL，SCHUHMACHER J，GLATTER T，GIAMMARINARO P I，DJAMEI A，RENSING S A，REISSMANN S，KAHMANN R，BANGE G. A kiwellin disarms the metabolic activity of a secretedfungal virulence factor[J]. Nature，2019，565（7741）：650-653.

[26] 劉耀，何其光，廖小淼，徐良向，劉文波，林春花，李瀟，鄭服叢，繆衛(wèi)國(guó). 橡膠樹(shù)白粉菌分支酸變位酶基因克隆及蛋白表達(dá)純化[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2020，39（3）：1120-1127.

LIU Yao，HE Qiguang，LIAO Xiaomiao，XU Liangxiang，LIUWenbo，LIN Chunhua，LI Xiao，ZHENG Fucong，MIAOWeiguo. Cloning，prokaryotic expression and purification of chorismatemutase fromOidium heveae[J]. Genomics and AppliedBiology，2020，39（3）：1120-1127.

[27] 盛寅生，任愛(ài)芝，常雪，趙培寶. 核盤菌一分支酸變位酶同源效應(yīng)蛋白的亞細(xì)胞定位[J]. 植物保護(hù)，2018，44（5）：176-180.

SHENG Yinsheng，REN Aizhi，CHANG Xue，ZHAO Peibao.Subcellular localization of an effector homologous with chorismatemutase inSclerotinia sclerotiorum[J]. Plant Protection，2018，44（5）：176-180.

[28] 李小溪，問(wèn)亞琴，李春蘭，潘秋紅. 低溫對(duì)葡萄果實(shí)莽草酸途徑入口酶及后分支酸途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)，2011，2（3）：250-255.

LI Xiaoxi，WEN Yaqin，LI Chunlan，PAN Qiuhong. Effects oflow temperature on expression of genes encoding entrance enzymeof grape shikimate pathway and key enzymes of postchorimate pathway[J]. Journal of Tropical Organisms，2011，2（3）：250-255.

[29] 初英娜，張珍珍，潘秋紅. 紫外照射對(duì)葡萄果實(shí)莽草酸途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響[J]. 植物生理學(xué)通訊，2010，46（9）：902-908.

CHU Yingna，ZHANG Zhenzhen，PAN Qiuhong. Effects of ultravioletradiation on expression of shikimate pathway- relatedgenes in grape （Vitis vinifera L.） berries[J]. Plant PhysiologyCommunications，2010，46（9）：902-908.

[30] 張晨，陳靈婧，李小溪，王軍. 葡萄果實(shí)分支酸變位酶基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 中外葡萄與葡萄酒，2014（1）：6-11.

ZHANG Chen，CHEN Lingjing，LI Xiaoxi，WANG Jun. Cloningand expression of gene encoding chorismate mutase in grapeberries[J]. Sino-Overseas Grapevine &Wine，2014（1）：6-11.