孫悅 封佳欣 何旭 陳美華 臧皓 金莉莉

(1.延邊大學(xué) 藥學(xué)院,吉林 延吉 133002;2.通化師范學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院,吉林 通化 134002)

0 引言

肺癌(lung cancer)是常見的癌癥之一.目前,肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩類[1].近年來一些學(xué)者對狼毒大戟(Euphorbiafischeriana)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其含有二萜、三萜、黃酮、香豆素、類固醇、酚酸等241種成分[2-4],其中二萜類成分對治療乳腺癌[5-6]、前列腺癌[7-8]、肝癌[9]以及肺癌[10-13]等具有很好的療效.2008年,Yan等[14]研究發(fā)現(xiàn),狼毒大戟中的成分17-acetoxyjolkinolide B(結(jié)構(gòu)式見圖1)可有效抑制NF-κB 信號通路;2009年,Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn),狼毒大戟中的成分ingenol 3-myristinate 和ingenol 3-palmitate(結(jié)構(gòu)式見圖1)對肺癌A549細(xì)胞具有明顯的抑制作用,同時發(fā)現(xiàn)17-hydroxyjolkinolide B(結(jié)構(gòu)式見圖1)可通過抑制STAT3 信號通路治療肺癌.為了進(jìn)一步探討狼毒大戟治療肺癌的療效及其作用機(jī)制,本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對狼毒大戟治療肺癌的作用機(jī)制進(jìn)行了探討,以期為利用狼毒大戟治療肺癌提供理論依據(jù)和研究方向.

1 研究流程

1.1 潛在活性成分的篩選及其靶點(diǎn)預(yù)測

為了得到狼毒大戟抗肺癌的潛在活性成分及其靶點(diǎn),本文首先利用Chemdraw 畫出其2D結(jié)構(gòu);然后將得到的2D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissADME(http://www.swissadme.ch/)中,并以胃腸道吸收為“high”和類藥性中至少有2個“yes”為標(biāo)準(zhǔn)對狼毒大戟的化學(xué)成分進(jìn)行篩選,以此得到具有類藥性高和能夠被胃腸道吸收的潛在活性成分;最后利用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫對上述狼毒大戟的潛在活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測,并在預(yù)測結(jié)果中選取可能性≥0.1的靶點(diǎn)作為狼毒大戟的潛在活性成分靶點(diǎn).

1.2 肺癌疾病靶點(diǎn)的收集

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、Therapeutic Target Database(TTD)藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(https://db.idrblab.net/ttd/)和Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com/)中的藥物數(shù)據(jù)和藥物目標(biāo)信息對肺癌疾病靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測.預(yù)測時首先以“l(fā)ung cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,然后將檢索得到的肺癌疾病靶點(diǎn)進(jìn)行合并和去除重復(fù)項,由此即得肺癌疾病靶點(diǎn).

1.3 潛在活性成分靶點(diǎn)與肺癌疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)的預(yù)測

將狼毒大戟的潛在活性成分靶點(diǎn)和肺癌疾病靶點(diǎn)輸入到Venny2.1.0 在線平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)中,由此可得到兩者的韋恩圖.在韋恩圖中,潛在活性成分靶點(diǎn)與肺癌疾病靶點(diǎn)的相交部分即為潛在活性成分與肺癌疾病的交集靶點(diǎn),這些交集靶點(diǎn)即可認(rèn)為是狼毒大戟治療肺癌的潛在靶點(diǎn).

1.4 “藥物-潛在活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心活性成分的篩選

首先用狼毒大戟的潛在活性成分和交集靶點(diǎn)建立兩者的“網(wǎng)絡(luò)”和“類型”文件,然后將所得的文件導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2軟件中構(gòu)建狼毒大戟治療肺癌的“藥物-潛在活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),最后對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析即可得到狼毒大戟治療肺癌的潛在活性成分.將所得結(jié)果按自由度值進(jìn)行大小排序,并將排名前10的潛在活性成分作為狼毒大戟治療肺癌的核心活性成分[16].

1.5 蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和核心靶點(diǎn)的篩選

構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)的方法:將潛在活性成分與肺癌疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING v11.5數(shù)據(jù)平臺(https://cn.string-db.org/)中后,通過檢索即可得到PPI網(wǎng)絡(luò).檢索條件為:以“智人”為限定物種,置信度分?jǐn)?shù)為0.4,其他參數(shù)為默認(rèn)值.

核心靶點(diǎn)的篩選方法:首先將構(gòu)建好的PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入到Cytoscape中;然后利用CytoNCA插件計算PPI網(wǎng)絡(luò)的自由度、接近中心性(closeness centrality)和介度中心性(betweeness centrality),并同時篩選出大于其各自平均值的靶點(diǎn);最后按自由度值的大小進(jìn)行排序,并將排名前10的靶點(diǎn)作為狼毒大戟治療肺癌的核心靶點(diǎn)[17].

1.6 GO 富集 和KEGG 富集分析

Metascape數(shù)據(jù)庫是一個數(shù)據(jù)豐富且可對基因功能進(jìn)行注釋的數(shù)據(jù)庫,因此本研究利用其對交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO(gene ontology)和KEGG(kyoto encylopaedia of genes and genomes)富集分析,以此獲取交集靶點(diǎn)的生物信息以及分析狼毒大戟治療肺癌的潛在作用通路.為了便于對富集分析的結(jié)果進(jìn)行分析,本文對富集分析的結(jié)果進(jìn)行了可視化,即利用微生信(bioinformatics)在線作圖平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)對P值最小的10個富集分析結(jié)果進(jìn)行了作圖.

1.7 狼毒大戟對肺癌相關(guān)靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證

首先,在PPI網(wǎng)絡(luò)中將自由度值排名前5的核心靶點(diǎn)TP53(5o1f)、TNF(7jra)、EGFR(5ug9)、STAT3(6njs)和MAPK3(6ges)作為分子對接的受體;然后,在藥物-潛在活性成分-交集靶點(diǎn)中將自由度值排名前5 的核心活性成分[araucarone(LD11,d=35)、ent-13S-hydroxy-16-atisene-3,14-dione(LD14,d=33)、ent-3β-(13S)-dihydroxyatis-16-en-14-one(LD8,d=31)、ent-(13S)-13-hydroxyatis-16-ene-3,14-dione(LD18,d=31)、caudicifolin(LD12,d=30)]和4個已被證明具有抗肺癌活性的化學(xué)成分[17-acetoxyjolkinolide B(LD6,d=25)、ingenol 3-myristinate(LD36)、ingenol3-palmitate(LD37)和17-hydroxyjolkinolide B(LD39)]作為分子對接的配體;最后,將上述得到的潛在活性成分的2D 結(jié)構(gòu)導(dǎo)入到Chem3D 中進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,由此得到能量最小的3D 結(jié)構(gòu).本文利用AutoDockVina1.1.2軟件對配體和受體進(jìn)行分子對接.在進(jìn)行分子對接操作時,首先在AutoDockTool中對配體和受體進(jìn)行去水和加氫等操作,然后設(shè)置對接grid參數(shù)(LD6-TP53(centerx=115.577,centery=87.131,centerz=-30.174;sizex=74.0,sizey=62.0,sizez=52.0);LD36-EGFR(centerx=-2.109,centery=18.808,centerz=-25.616;sizex=44.0,sizey=50.0,sizez=60.0);LD37-EGFR(centerx=-2.109,centery=18.808,centerz=-25.616;sizex=44.0,sizey=50.0,sizez=60.0);LD39-MAPK3(centerx=46.391,centery=4.48,centerz=-8.116;sizex=87.0,sizey=68.0,sizez=102.0);對接次數(shù)為10次),最后運(yùn)行Vina進(jìn)行分子對接.為了更直觀地展示配體和受體的結(jié)合情況,本文采用Pymol軟件將對接結(jié)果進(jìn)行了可視化(以3D 圖的形式).

1.8 操作流程

本研究的具體操作流程見圖2.

圖2 研究狼毒大戟治療肺癌作用機(jī)制的流程圖

2 結(jié)果與分析

2.1 潛在活性成分的篩選和靶點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果

利用SwissADME數(shù)據(jù)庫對已分離出的狼毒大戟中的化學(xué)成分進(jìn)行篩選后得到38個潛在活性成分,見表1.利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫對狼毒大戟的潛在活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,由此共得到1493個靶點(diǎn).

表1 狼毒大戟的潛在活性成分

2.2 肺癌疾病靶點(diǎn)的收集結(jié)果

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫、TTD 藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫和Drugbank數(shù)據(jù)庫檢索肺癌疾病靶點(diǎn),對所得的靶點(diǎn)進(jìn)行去重后共得到1561個靶點(diǎn).

2.3 交集靶點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果

將去重后的419 個潛在活性成分靶點(diǎn)與1561 個肺癌疾病靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩分析后獲得了139個交集靶點(diǎn)(占潛在活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)總數(shù)的7.6%),如圖3所示.

圖3 狼毒大戟的潛在活性成分靶點(diǎn)與肺癌疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

2.4 “藥物-潛在活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果

利用Cytoscape,以139個肺癌靶基因(作為抗癌靶點(diǎn))和38個狼毒大戟的潛在活性成分(作為狼毒大戟抗肺癌的潛在活性成分)構(gòu)建“藥物-潛在活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果如圖4所示.圖4中:綠色代表狼毒大戟,粉色代表狼毒大戟的潛在活性成分,紫色代表交集靶點(diǎn);節(jié)點(diǎn)體積越大,表示自由度值越大,即其在治療肺癌中的作用越大.由圖4 可見,圖中共有176 個節(jié)點(diǎn),576條相互作用的邊.由該網(wǎng)絡(luò)可知,狼毒大戟治療肺癌的核心活性成分為LD11(d=35)、LD14(d=33)、LD18(d=31)、LD8(d=31)、LD12(d=30)、LD10(d=27)、LD16(d=26)、LD20(d=26)、LD6(d=25)和LD9(d=25).

圖4 “藥物-潛在活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果

首先將139個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING 數(shù)據(jù)庫中,以此獲取肺癌疾病的蛋白互作信息和構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖.為了更直觀地展示PPI網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果,本文利用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行了篩選和優(yōu)化,并將蛋白按自由度值從大到小進(jìn)行了排序(見圖5).由圖5可見,PPI網(wǎng)絡(luò)圖中含有139個相互作用的節(jié)點(diǎn),2074條相互作用的邊,平均節(jié)點(diǎn)度為29.8.由圖5得出的核心靶點(diǎn)見表2.

表2 核心靶點(diǎn)的名稱及其相關(guān)信息

圖5 按自由度值大小排列的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 GO 富集和KEGG 富集的分析結(jié)果

GO 富集包括生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)3部分.對潛在活性成分與肺癌疾病的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析顯示:BP共有1684個條目(P<0.05),主要涉及蛋白磷酸化、對激素反應(yīng)、細(xì)胞遷移的正調(diào)節(jié)等;CC共有78個條目(P<0.05),主要涉及薄膜筏、膜微區(qū)部分等;MF共有161個條目(P<0.05),主要涉及蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性等.圖6為對狼毒大戟進(jìn)行GO 富集分析得到的三合一柱狀圖.由圖6可以看出,狼毒大戟可通過調(diào)控多種生物學(xué)過程來發(fā)揮其治療肺癌的作用.對潛在活性成分與肺癌疾病的交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析顯示,其共有182條KEGG 條目(P<0.05).圖7為對狼毒大戟進(jìn)行KEGG 富集分析得到的氣泡圖(圖中的圓點(diǎn)越大,表示在通路上富集的靶點(diǎn)越多;圖中的圓點(diǎn)越紅,表示P值越小).由圖7可知,交集靶點(diǎn)主要富集在癌癥通路、AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路以及癌細(xì)胞的蛋白聚糖的表達(dá)上.

圖6 GO 富集分析的三合一柱狀圖

圖7 KEGG 富集分析的氣泡圖

2.7 肺癌相關(guān)靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果的驗(yàn)證

研究[18-19]表明,結(jié)合能越低表明配體-受體的結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定.圖8為核心活性成分與靶點(diǎn)分子對接的結(jié)合能圖(圖中的顏色塊越紅,表示結(jié)合能的值越小,即結(jié)合效果越好).由圖8可以看出,根據(jù)分子對接所選取的核心活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能均小于-5.0kJ/mol,由此說明這些成分與靶點(diǎn)形成了良好的對接.

圖8 核心活性成分與靶點(diǎn)分子對接的結(jié)合能圖

由圖9 可以看出,LD12-TP53 中的LD12與TP53中的MET793和CYS797,LD39-TP53中的LD39 與TP53 中 的THR-256、ARG267、SER99,LD39-MAPK3中的LD39與MAPK3中的ALA369和PRO315,LD39-STAT3中的LD39與STAT3中的ALA241和ASN485,LD39-EGFR中 的LD39 與EGFR 中 的ALA722、ASN842、ARG841,LD39-TNF 中 的LD39 與TNF 中 的PRO176、GLU192都各形成了1條氫鍵.由此進(jìn)一步表明,狼毒大戟的核心活性成分與核心靶點(diǎn)形成了良好的對接.

圖9 肺癌靶點(diǎn)分子對接的3D 圖(A 為LD12-EGFR;B為LD39-TP53;C 為LD39-TNF;D 為LD39-EGFR;E為LD39-STAT3;F為LD39-MAPK3)

研究表明:TP53為抑癌基因[20-21],且其高表達(dá)對癌基因BIRC5 具有明顯的抑制作用[22];TNF-α可促進(jìn)Th9細(xì)胞的生長(Th9具有抗腫瘤的作用)[23-24];EGFR 可通過IL-6/STAT3信號通路對肺癌細(xì)胞的增殖和凋亡產(chǎn)生影響[25-26];STAT3對肺癌具有明顯的抑制作用[27-28].在圖8中,由于LD12與EGFR 的結(jié)合能最低(為-36.8 kJ/mol),因此可推測狼毒大戟極有可能通過影響IL-6/STAT3信號通路發(fā)揮其抗肺癌活性.

3 結(jié)論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討了狼毒大戟治療肺癌的作用機(jī)制,研究結(jié)果表明:狼毒大戟的抗癌作用主要是通過其araucarone、ent-13S-hydroxy-16-atisene-3,14-dione、ent-3β-(13S)-dihydroxyatis-16-en-14-one、ent-(13S)-13-hydroxyatis-16-ene-3,14-dione和caudicifolin等核心活性成分與TP53、TNF、EGFR、STAT3、MAPK3等靶點(diǎn)共同作用(通過調(diào)節(jié)癌癥通路、AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路以及抑制癌細(xì)胞的蛋白聚糖的表達(dá))來實(shí)現(xiàn)的.本研究可為后續(xù)深入研究狼毒大戟在肺癌治療中的應(yīng)用提供良好參考.但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)存在一定的局限性,所以在今后的研究中我們將通過實(shí)驗(yàn)對其作用機(jī)制做進(jìn)一步探討.