李航 , 林志豪 , 金彪 , 金東日

(1.延邊大學 理學院,吉林 延吉 133002;2.延邊大學 分析測試中心,吉林 延吉 133002)

小分子硫醇是生物體內(nèi)多種蛋白質(zhì)的重要組成部分,它主要包括半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)以及谷胱甘肽(GSH).研究顯示這3種硫醇化合物均具有較強的抗氧化性,在生物體內(nèi)不僅參與許多重要的生理反應,而且還能夠有效清除體內(nèi)所產(chǎn)生的過剩自由基,以及維持細胞壓的動態(tài)平衡[1].另外研究還顯示,Cys、Hcy和GSH在細胞內(nèi)的含量變化與體內(nèi)的多種疾病密切相關.例如:當人體內(nèi)的Cys含量過多或過少時都會引起兒童生長緩慢、肝臟損害、肌肉松弛和身體肥胖等疾病[2-4].健康成年人體內(nèi)血清中的Hcy超過15μmol/L(正常水平在9～13μmol/L)時,不僅會造成先天性缺陷和認知功能障礙,還會引起心血管疾病、阿爾茨海默病等[5-7].GSH 的含量對細胞的生長、代謝以及對癌癥患者放化療的耐藥性等均有顯著影響[8].因此,對Cys、Hcy和GSH 等小分子硫醇進行快速、靈敏、精準的檢測可有助于闡明疾病的發(fā)生和發(fā)展機制,并為預防和治療疾病提供新的思路.目前檢測硫醇化合物的常見方法有HPLC法[9]、毛細管電泳法[10]、電化學分析法[11]、紅外光譜法[12]、紫外-可見光譜法[13]和熒光光譜法[14]等方法.由于HPLC法具有分析速度快、檢測靈敏度高和樣品用量少等優(yōu)點,以及丙烯基可與硫醇化合物的巰基發(fā)生Michael加成反應[15],因此本文利用HPLC 法建立了一種柱前衍生化定量分析硫醇化合物的方法.實驗表明,該方法可有效測定L_半胱氨酸膠囊中半胱氨酸的含量.

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

先行者CP114電子分析天平,奧豪斯儀器上海有限公司;TGL-15B離心機,上海安亭科學儀器廠;6794-420D 磁力加熱攪拌器,CORNING公司;XW-80A 旋渦混合器,上海馳唐電子有限公司;HB-100恒溫金屬浴,杭州大和熱磁電子有限公司;SPD-16 高效液相色譜儀,日本島津公司;AV Ⅲ-Ascend 500 HD 超導傅里葉核磁共振譜儀,BRUKER 公司;N-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海愛朗儀器有限公司.

1.2 實驗試劑

2_甲氧基苯酚(分析純)、丙烯酰氯(分析純)、氘代氯仿,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;碳酸氫鈉(分析純),國藥集團化學試劑有限公司;乙腈(分析純),天津市大茂化學試劑廠;二氯甲烷(分析純)、甲醇(分析純),天津市富宇精細化工有限公司;甲酸(色譜級)、三乙胺(分析純)、無水硫酸鎂(分析純),天津市科密歐化學試劑有限公司;L_半胱氨酸,上海吉爾生化有限公司;乙腈(LC-MS級)、高半胱氨酸、谷胱甘肽,北京伊諾凱試劑有限公司;舒邦L_半胱氨酸膠囊,湖北舒邦藥業(yè)有限公司;超純水,采用Kertone Lab MINI-D儀自制.

1.3 衍生化試劑丙烯酸2′_甲氧基苯酯的合成

按照文獻[16]中的方法合成衍生化試劑丙烯酸2′_甲氧基苯酯.將鄰甲氧基苯酚(0.62g,5 mmol)、二氯甲烷(12.5mL)、三乙胺(0.75mL)置于冰水浴中的圓底燒瓶中,然后在攪拌下緩慢滴加入含有0.5mL 丙烯酰氯的2.5mL 二氯甲烷,室溫下反應過夜;反應液用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌3次,并水洗3次;用無水硫酸鎂將反應液干燥后再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉溶劑,得0.5632g淡黃色油狀液體,收率為63.2%.1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:7.25～7.18(m,1H),7.08(dd,J=7.9,1.6Hz,1H),7.01～6.93(m,2H),6.62(dd,J=17.3,1.3 Hz,1H),6.36(dd,J=17.3,10.5Hz,1H),6.01(dd,J=10.5,1.3Hz,1H),3.83(s,3H);13C NMR(125MHz,CDCl3) δ:164.1,151.2,139.6,132.4,127.6,126.9,122.8,120.8,112.5,55.9;MALDITOF-MS,m/z[M+Na]+:201.

1.4 溶液的配制

衍生化試劑:首先,準確稱取丙烯酸2′_甲氧基苯酯89.1mg(0.5mmol),加入乙腈溶液后將其配制成濃度為50mmol/L 的儲備液;然后,再將配 制 的 儲 備 液 依 次 稀 釋 為25、20、10、5、1 mmol/L的儲備液.

標準對照溶液:分別配置10 mmol/L 的Cys、Hcy、GSH 混合標準品儲備液.將3 種硫醇化合物用乙腈-水(體積比為22∶78)混合標準品溶液稀釋成為1mmol/L.

供試品溶液:取L_半胱氨酸膠囊1粒(0.40 g/粒),將內(nèi)容物傾出后研磨成細粉;細粉裝入離心管后加入適量乙腈-水(體積比為22∶78),超聲并離心10min(7000r/min),并取其上清液將其配制成濃度為0.5mmol/L的溶液.

1.5 衍生化反應

分別將20mmol/L 的丙烯酸2′_甲氧基苯酯(20μL)和1mmol/L 的Cys、Hcy、GSH 混合溶液(20μL)加入到1.5mL 聚丙烯離心管中,用漩渦混合器振蕩1min 后將其放入到恒溫金屬浴(55℃)中反應2h.反應結束后,取反應液3μL進行HPLC檢測.

1.6 色譜條件

色譜柱為Mightsil RP-18GP(150mm×4.6 mm,3μm);流動相A 為水溶液(含體積分數(shù)為0.1%的甲酸),流動相B 為乙腈(含體積分數(shù)為0.1%的甲酸);有機相的體積分數(shù)為26%;流速為0.3mL/min;柱溫為25℃;UV 檢測器波長為270nm;進樣量為3μL.

2 結果與分析

2.1 丙烯酸2′_甲氧基苯酯的結構確認

鄰甲氧基苯酚與丙烯酰氯發(fā)生反應生成的丙烯酸2′_甲氧基苯酯的色譜圖如圖1所示.由圖1可以看出,丙烯酸2′_甲氧基苯酯的質(zhì)量分數(shù)為95%.進一步綜合衍生化試劑的核磁共振氫譜、碳譜和基質(zhì)輔助飛行時間質(zhì)譜可知,反應所得的目標產(chǎn)物為丙烯酸2′_甲氧基苯酯.

圖1 丙烯酸2′-甲氧基苯酯的液相色譜圖

2.2 丙烯酸2′_甲氧基苯酯與含硫醇化合物發(fā)生衍生化反應的條件

為探討最佳的衍生化反應條件,分別從反應溫度、時間、摩爾比對其進行分析.

2.2.1 反應溫度對衍生化反應的影響

在25、45、55、65、75 ℃下將Cys、Hcy、GSH混合溶液與衍生化試劑進行反應.反應完成后,分別取少量反應液進行HPLC 分析.以反應溫度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制的衍生化產(chǎn)物的峰面積隨反應溫度變化的曲線如圖2所示.由圖2可知,反應溫度在25～55℃時,衍生化產(chǎn)物的峰面積隨反應溫度的升高而增加;當反應溫度高于55℃時,其變化趨勢逐漸保持平穩(wěn):因此,本文將最佳反應溫度確定為55℃.

圖2 反應溫度對衍生化反應的影響

2.2.2 反應時間對衍生化反應的影響

將Cys、Hcy、GSH 混合溶液與衍生化試劑分別反應10、30、60、120、180min.反應完成后,取少量反應液進行HPLC分析.以反應時間為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制的衍生化產(chǎn)物的峰面積隨反應時間變化的曲線如圖3所示.由圖3可知,當反應時間在10～120min時,衍生化產(chǎn)物的峰面積隨反應時間的增加而增加,當反應時間大于120min時,其變化趨勢逐漸保持平穩(wěn):因此,本文將最佳反應時間確定為120min.

圖3 反應時間對衍生化反應的影響

2.2.3 反應摩爾比對衍生化反應的影響

將Cys、Hcy、GSH 混合溶液與衍生化試劑分別在摩爾比為1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶25下進行反應.反應完成后,取少量反應液進行HPLC分析.以反應摩爾比為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制的衍生化產(chǎn)物的峰面積隨反應摩爾比的變化曲線如圖4所示.由圖4可以看出,當反應摩爾比在小于20范圍內(nèi)時,衍生化產(chǎn)物的峰面積隨反應摩爾比的增加而增加,當反應摩爾比大于20時,其變化趨勢逐漸保持平穩(wěn):因此,本文將最佳反應摩爾比確定為1∶20.

圖4 反應摩爾比對衍生化反應的影響

2.3 色譜條件的選擇

為了完全分離3種物質(zhì)(丙烯酸2′_甲氧基苯酯分別與Cys、Hcy、GSH 進行反應所得的衍生化產(chǎn)物),本文利用不同流動相比(流動相A 與B的體積比分別為48∶52、58∶42、68∶32、74∶26、77∶23)進行分離,其中流動相A 為水溶液(含體積分數(shù)為0.1%的甲酸),流動相B 為乙腈(含體積分數(shù)為0.1%的甲酸).不同流動相比例下3種物質(zhì)的保留時間變化如圖5所示.由圖5可知,當流動相B的體積分數(shù)為26%時,3種衍生化產(chǎn)物的峰的保留時間分別為11、13、15min.當流動相A 與B的體積比為74∶26時,3種物質(zhì)的HPLC圖如圖6所示.由圖6可以看出,該條件下可快速洗脫和完全分離3種產(chǎn)物.

圖5 3種產(chǎn)物的峰的保留時間隨流動相B體積分數(shù)的變化趨勢

圖6 丙烯酸2′_甲氧基苯酯與Cys、GSH、Hcy分別反應所得衍生物的液相色譜圖

2.4 線性關系及最低檢測限

按1.5中衍生化方法將丙烯酸2′_甲氧基苯酯分別與1.0、0.5、0.2、0.1、0.05mmol/L的Cys、Hcy、GSH 標準品混合液進行衍生化反應.反應完成后,取少量反應液進行HPLC 分析.以Cys、Hcy、GSH 標準品溶液濃度為橫坐標、衍生化產(chǎn)物的峰面積為縱坐標建立的線性方程及相關系數(shù)和最低檢測限見表1.

2.5 膠囊樣品含量的測定

由于實際樣品中的其他摻雜物質(zhì)可能會消耗衍生化試劑,因此本文采用過量的衍生化試劑進行反應:在55 ℃的恒溫金屬浴條件下,將0.5 mmol/L的供試品溶液與20.0mmol/L的衍生化試劑反應2h,然后進行HPLC檢測.根據(jù)表1中Cys的線性方程計算膠囊中的半胱氨酸含量,經(jīng)計算其含量為0.02g(藥品標示成分含量為每100 g含L_半胱氨酸18.0g).

表1 3種硫醇化合物的線性方程、相關系數(shù)和最低檢測限

3 結論

本文采用柱前衍生化HPLC 法對3 種硫醇衍生物(以衍生化試劑丙烯酸2′_甲氧基苯酯與Cys、Hcy、GSH 3種硫醇進行衍生化反應所生成的硫醇衍生物)進行分離檢測顯示,該方法不僅具有良好的靈敏度(線性范圍為0.05～1.0 mmol/L,最低檢測限為0.01mmol/L),而且還具有反應條件溫和、操作簡單等優(yōu)點;因此,該方法可為實際生物樣品中的硫醇檢測提供良好參考.