韓 苗,曹明磊,2,段文增,龔樹文

(1. 聊城大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 聊城 252059; 2. 山東信發(fā)瑞捷新材料科技有限公司 聊城 252000)

1 引言

氨基酸是自然界中普遍存在的重要有機(jī)分子,在化學(xué)、生物工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室中也隨處可見[1,2]。其兩種構(gòu)型中L-氨基酸是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)的基本單位,與生物體的生命活動(dòng)有著密切關(guān)系;非天然的D-氨基酸雖然不是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元,但廣泛存在于真核肽、細(xì)菌和動(dòng)物(包括人類)中[3-5]。游離氨基酸不僅可用于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充和食品加工,在生物系統(tǒng)中發(fā)揮多種功能,它們還是制備結(jié)構(gòu)多樣的有機(jī)化合物的起始材料。如在不對(duì)稱合成中,光學(xué)活性氨基酸通常被用作手性源。因此,由于氨基酸的重要作用,許多分析工具被開發(fā)用來(lái)研究氨基酸,特別是對(duì)其對(duì)映體的鑒別[6,7]。

近幾年,利用分子探針對(duì)手性氨基酸的對(duì)映選擇性熒光識(shí)別已經(jīng)成為化學(xué)家們研究的熱點(diǎn),很多探針被設(shè)計(jì)合成出來(lái)并展現(xiàn)出優(yōu)異的不對(duì)稱識(shí)別效果[8-17]。這些探針可以用于快速分析不對(duì)稱反應(yīng)或生物過(guò)程產(chǎn)生的氨基酸的對(duì)映體組成。與用熒光分子探針?lè)治龇鞘中缘孜锊煌?熒光分子探針?lè)治龇鞘中缘孜锿ǔＶ恍枰@得一個(gè)參數(shù),即底物的濃度,而手性氨基酸的分析需要確定兩個(gè)參數(shù),包括濃度和對(duì)映體組成。因?yàn)闈舛群蛯?duì)映體組成都會(huì)影響熒光響應(yīng),所以通常需要有兩種獨(dú)立的方法來(lái)確定這兩個(gè)參數(shù)。如果在不分離氨基酸對(duì)映體的情況下只使用一個(gè)熒光探針同時(shí)獲得氨基酸的濃度和對(duì)映體組成,這將是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。使用一種熒光分子探針同時(shí)進(jìn)行濃度和對(duì)映體組成測(cè)定,這種“一石二鳥”的策略存在很多優(yōu)點(diǎn):(1) 檢測(cè)方法簡(jiǎn)單,成本較低;(2) 不需要分離手性底物;(3) 高靈敏度、高選擇性;(4) 具有安全性和很強(qiáng)的復(fù)用能力。因此,本文在前期研究的基礎(chǔ)上[18],結(jié)合近幾年手性熒光分子探針手性識(shí)別氨基酸進(jìn)展,重點(diǎn)綜述了四種可同時(shí)檢測(cè)氨基酸的濃度和對(duì)映體的組成的熒光化合物,并對(duì)其設(shè)計(jì)合成理念和雙響應(yīng)識(shí)別機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)研究。第一種雙響應(yīng)熒光分子探針(R)-4,當(dāng)(R)-4在Zn(OAc)2的存在下被各種手性胺處理時(shí),會(huì)與2-萘胺發(fā)生換位反應(yīng),由于2-萘胺恢復(fù)發(fā)射,其在λ3=427 nm(I3)處顯示出較大的熒光增強(qiáng)。剩余的手性二萘基單元與手性底物結(jié)合,在λ4>500 nm(I4)處產(chǎn)生高度對(duì)映選擇性的熒光增強(qiáng)。由于I3只依賴于濃度,不依賴于手性構(gòu)型,因此它可以測(cè)定底物濃度。而I4依賴于手性構(gòu)型,所以它可以測(cè)定對(duì)映體的組成。因此,可以使用一個(gè)熒光探針和一次熒光測(cè)量,同時(shí)確定底物濃度和對(duì)映體組成[19]。第二種雙響應(yīng)熒光分子探針(R)-9,它是一種由1,1′-聯(lián)二萘酚(BINOL)和香豆素制成的新型熒光探針,其在中性緩沖溶液中,以λ5=365 nm激發(fā)時(shí),與氨基酸作用,在465 nm處顯示熒光增強(qiáng),但兩種對(duì)映體之間的差異非常小。當(dāng)在λ6=467 nm激發(fā)時(shí),在534 nm處表現(xiàn)出高度的對(duì)映選擇性熒光增強(qiáng)。這樣通過(guò)調(diào)整不同的激發(fā)波長(zhǎng)就可以同時(shí)測(cè)定氨基酸的濃度和對(duì)映體組成[20]。第三種雙響應(yīng)熒光分子探針(S)-12,當(dāng)(S)-12被組氨酸和Zn2+處理時(shí),可以產(chǎn)生一種六配位的Zn(II)配合物,限制BINOL單元的旋轉(zhuǎn),從而顯示熒光增強(qiáng)。同時(shí)由于組氨酸的L-和D-對(duì)映體可能導(dǎo)致六配位的Zn(II)配合物的穩(wěn)定性或結(jié)構(gòu)剛性不同,從而進(jìn)行不同的對(duì)映體選擇性反應(yīng)。其他氨基酸沒(méi)有組氨酸的咪唑取代基,不能產(chǎn)生六配位的配體結(jié)構(gòu),從而在不同激發(fā)波長(zhǎng)下,組氨酸的濃度和對(duì)映選擇性可以被(S)-12同時(shí)檢測(cè)到[21]。第四種雙響應(yīng)分子探針(S)-17是一種具有多個(gè)活性檢測(cè)位點(diǎn)的BINOL熒光探針。當(dāng)(S)-17被精氨酸處理時(shí),兩個(gè)醛基與精氨酸的氨基進(jìn)行縮合,丙烯酸酯提供一個(gè)額外的反應(yīng)位點(diǎn),只與特定的精氨酸對(duì)映體進(jìn)行Michael加成形成環(huán)狀化合物,雖然未反應(yīng)完全,但經(jīng)歷了強(qiáng)烈的ICT(分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光,從而可以同時(shí)檢測(cè)精氨酸濃度和對(duì)映體組成[22]。

2 第一個(gè)雙響應(yīng)熒光探針的發(fā)現(xiàn)

2012年有文章報(bào)道了1,1′-聯(lián)二萘酚(BINOL)基三氟甲基酮(S)-1(表1)在手性二胺的熒光識(shí)別中的應(yīng)用[23]。發(fā)現(xiàn)非熒光化合物(S)-1在與反式-1,2-環(huán)己二胺的兩個(gè)對(duì)映體相互作用時(shí),在λ1=370 nm和λ2=438 nm處顯示雙重?zé)晒庠鰪?qiáng),在λ1處,(S)-1對(duì)兩種對(duì)映體都有較大的熒光增強(qiáng)作用,但對(duì)映選擇性很小;在λ2處,(R,R)-反式-1,2-環(huán)己二胺對(duì)熒光的增強(qiáng)作用遠(yuǎn)大于(S,S)對(duì)映體。因此,在λ1處的熒光響應(yīng)可測(cè)定環(huán)己二胺的濃度,而在λ2處的熒光響應(yīng)可測(cè)定手性二胺的對(duì)映體組成。自此,可同時(shí)測(cè)定濃度和對(duì)映體組成的單分子熒光傳感器開始迅速發(fā)展。

表1 文中化合物名稱縮寫及結(jié)構(gòu)

盡管(S)-1可用于手性二胺的濃度和對(duì)映選擇性識(shí)別,但其不適用于檢測(cè)手性氨基酸,不過(guò)其雙重響應(yīng)檢測(cè)機(jī)制是相通的。這一發(fā)現(xiàn)促使Pu實(shí)驗(yàn)室提出了一種潛在的通用策略,將對(duì)映選擇性熒光傳感器轉(zhuǎn)化為同時(shí)測(cè)定手性化合物濃度和對(duì)映體組成的雙響應(yīng)熒光傳感器[19]。如圖1所示,將發(fā)射波長(zhǎng)為λ1的非手性熒光團(tuán)A連接到對(duì)映選擇性熒光傳感器B上。選擇B的標(biāo)準(zhǔn)是該傳感器與手性底物在不同波長(zhǎng)λ2的相互作用下顯示對(duì)映選擇性熒光增強(qiáng)。將A和B之間引入適當(dāng)?shù)逆I,以使A的熒光在[A +B]雙單元中猝滅。再結(jié)合一種連鎖裂解機(jī)制,以允許添加手性底物時(shí)釋放出A在λ1處恢復(fù)其發(fā)射。因此,在λ1處的熒光增強(qiáng)與底物濃度密切相關(guān),其受對(duì)映體組成的影響可以忽略。鍵斷裂后,得到的B與底物的對(duì)映體結(jié)合后,在λ2處應(yīng)表現(xiàn)出對(duì)映選擇性熒光增強(qiáng)。因此,[A + B]雙單元可用于測(cè)定λ1處的底物濃度和λ2處的對(duì)映體組成,即一次熒光測(cè)量可以給出兩個(gè)參數(shù)結(jié)果。

圖1 將對(duì)映選擇性熒光傳感器轉(zhuǎn)換為雙重響應(yīng)傳感器的擬議一般策略[19]

圖2 雙響應(yīng)熒光分子探針(R)-4的合成路線

3 雙響應(yīng)熒光分子探針(R)-4研究進(jìn)展

3.1 雙響應(yīng)熒光分子探針(R)-4的設(shè)計(jì)與合成

圖3 在(S, S)-5和(R, R)-5存在的條件下,(R)-4 + ZnII的熒光光譜[18]

2014年研究報(bào)道了(R)-2與Zn2+結(jié)合得到的對(duì)映選擇性熒光傳感器[24],其可廣泛應(yīng)用于二胺、氨基醇和氨基酸等手性功能胺的識(shí)別研究。在Zn2+存在下,(R)-2與手性功能胺反應(yīng),在λ>500 nm(λ4)處表現(xiàn)出高度的對(duì)映選擇性熒光增強(qiáng)。根據(jù)圖1中提出的同時(shí)測(cè)定濃度和對(duì)映體組成的策略可將該化合物設(shè)計(jì)為雙響應(yīng)熒光傳感器。將(R)-2與化合物3縮合生成相應(yīng)的席夫堿(R)-4(圖2)[19],產(chǎn)率為33%。該反應(yīng)為親核加成反應(yīng),由于(R)-2有兩個(gè)醛基,會(huì)與3形成單取代的席夫堿,所以產(chǎn)率不高,但是該反應(yīng)產(chǎn)物易分離提純,實(shí)驗(yàn)操作較簡(jiǎn)單。在(R)-4生成過(guò)程中,化合物3在427 nm(λ3)處的強(qiáng)發(fā)射被猝滅,這可能是由于該化合物中雙酚羥基氫與亞胺氮之間的分子內(nèi)氫鍵作用,這表明化合物(R)-4可作為圖1中所示的雙單元[A + B]傳感器。同時(shí),在Zn2+存在下用氨基酸處理時(shí),(R)-4的2-萘胺單元可被更堿性的脂肪胺取代恢復(fù)427 nm(λ3)的發(fā)射,由此形成的新的亞胺-鋅配合物在λ>500 nm(λ4)時(shí)應(yīng)顯示對(duì)映選擇性熒光增強(qiáng)峰,可直接用于(R)-4 + ZnII對(duì)氨基酸的對(duì)映選擇性熒光識(shí)別。

3.2 雙響應(yīng)熒光分子探針(R)-4的響應(yīng)機(jī)制

Pu等人首先研究了在Zn2+的存在下,(R)-4對(duì)反式-1,2-環(huán)己二胺(S,S)-5和(R,R)-5對(duì)映體的熒光響應(yīng)[19]。當(dāng)(R)-4(在CH3OH / 2 % CH2Cl2中2.0 × 10-5mol·L-1)用Zn(OAc)2(4.0 × 10-5mol·L-1)處理時(shí),由于Zn2+與亞胺單元的相互作用,它在555 nm處發(fā)出一個(gè)微弱的發(fā)射信號(hào)。當(dāng)用(S,S)-5(1.5 × 10-2mol·L-1)處理(R)-4 + Zn(II)溶液時(shí),在λ3=427 nm和λ4=525 nm的雙發(fā)射下觀察到較大的熒光增強(qiáng)。當(dāng)使用對(duì)映體(R,R)-5與(R)-4相互作用時(shí),在λ3=427 nm處觀察到相同的熒光增強(qiáng),但在λ4處的熒光增強(qiáng)峰要小得多。因此,在λ3處的發(fā)射與手性構(gòu)型無(wú)關(guān),而λ4處的發(fā)射具有高度的對(duì)映選擇性識(shí)別(圖3),這樣就得到了一種用于識(shí)別手性胺的雙響應(yīng)熒光傳感器。

圖4解釋了觀察到的雙響應(yīng)熒光識(shí)別的機(jī)制。(R)-4 + Zn(II)配合物與手性胺的亞胺發(fā)生換位反應(yīng)釋放化合物3,以恢復(fù)其在λ3=427 nm處的發(fā)射,而且Zn2+的存在并沒(méi)有改變化合物3的熒光。與手性胺反應(yīng)形成的新的BINOL-亞胺-ZnII配合物(R)-6在λ>500 nm處產(chǎn)生對(duì)映選擇性發(fā)射,該發(fā)射與之前報(bào)道的在Zn2+存在下直接使用(R)-2熒光識(shí)別的情況幾乎一致,但是引入2-萘胺基后,可以產(chǎn)生雙重響應(yīng)熒光測(cè)試。

圖4 (R)-4 + ZnII與手性胺的亞胺換位反應(yīng)

在Zn2+存在下,(R)-4還可以對(duì)手性氨基酸進(jìn)行雙熒光響應(yīng)識(shí)別,這些氨基醇包括丙氨酸、谷氨酸、組氨酸、絲氨酸和苯丙氨酸。以(R)-4對(duì)苯丙氨酸的手性識(shí)別為例,如圖5a, b所示,在(R)-4(2.0 × 10-5mol·L-1/2 % CH2Cl2)的混合溶液中加入L-苯丙氨酸和四丁基銨后,在λ1=427 nm和λ2=509 nm下均產(chǎn)生熒光增強(qiáng),但是短波長(zhǎng)下熒光增強(qiáng)的幅度小于長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光增強(qiáng)。圖5c繪制了(R)-4 + ZnII在λ=427 nm下對(duì)不同濃度的L-和D-苯丙氨酸的熒光強(qiáng)度I427。結(jié)果表明,氨基酸的手性構(gòu)型對(duì)I427幾乎沒(méi)有影響,可用于檢測(cè)氨基酸濃度。圖5d繪制了I509與L-和D-苯丙氨濃度的對(duì)比圖,該圖說(shuō)明在波長(zhǎng)為509 nm下,(R)-4對(duì)苯丙氨酸顯示了優(yōu)異的對(duì)映選擇性識(shí)別效果。

同時(shí),該文章還研究了(R)-4(2.0 × 10-5mol·L-1在CH3OH / 2 %二氯甲烷)+ZnII(2當(dāng)量)傳感溶液與苯丙氨酸和氫氧化四丁基銨在不同濃度和對(duì)映體組成下的熒光響應(yīng)?？紤]到僅氨基酸的濃度影響I427,作者得到了I427、I509和L-苯丙氨酸的三維圖(圖6),其中I509與底物的手性構(gòu)型有很強(qiáng)的相關(guān)性。因此,通過(guò)對(duì)映體組成的可以確定苯丙氨酸的不同對(duì)映體組成和濃度。因此,三維圖一次熒光測(cè)試同時(shí)得到氨基酸濃度和對(duì)映體組成。

圖6 (R)-4 +ZnII對(duì)不同濃度和不同對(duì)映體組成的苯丙氨酸在I427和I527處的熒光響應(yīng)[19]。

4 雙響應(yīng)熒光分子探針(R)-9研究進(jìn)展

4.1 雙響應(yīng)熒光分子探針(R)-9的設(shè)計(jì)與合成

由BINOL衍生的手性醛與Zn2+結(jié)合,對(duì)手性氨基酸具有對(duì)映選擇性熒光增強(qiáng)[24,25]。據(jù)報(bào)道,一種非手性香豆素醛在氨基酸中不需要添加Zn2+即可增強(qiáng)熒光,但沒(méi)有對(duì)映選擇性[26]。因此,Pu課題組將BINOL的手性結(jié)構(gòu)與香豆素醛結(jié)構(gòu)[27-29]結(jié)合,在沒(méi)有Zn2+的情況下對(duì)手性氨基酸進(jìn)行對(duì)映選擇性熒光識(shí)別。9含有兩個(gè)親電位點(diǎn),分別可以與氨基酸的氨基進(jìn)行1,2-親核加成[14]和1,4-親核加成[30,31]。這兩種反應(yīng)途徑產(chǎn)生不同的熒光。其中手性聯(lián)二萘結(jié)構(gòu)可以為親核加成提供立體控制,與聯(lián)二萘基連接的吡啶基可為氨基酸提供額外的結(jié)合位點(diǎn),以增強(qiáng)手性偏倚。

將香豆素氯化物(8)[32,33]與(R)-聯(lián)二萘酚和2-溴甲基吡啶的氫溴酸鹽(7)在乙腈中,K2CO3的存在下混合反應(yīng),回流,制備得到(R)-9(圖7)

圖7 雙響應(yīng)熒光分子探針(R)-9的合成路線

4.2 雙響應(yīng)熒光分子探針(R)-9的響應(yīng)機(jī)制

以(R)-9在HEPES緩沖溶液(pH=7.4)中對(duì)D/L-纈氨酸的熒光響應(yīng)為例(圖8)。在HEPES溶液中,(R)-9在λ5=365 nm處激發(fā)后在λ=554 nm處顯示出一個(gè)寬發(fā)射,表明由于λ<500 nm的發(fā)射減少,聯(lián)二萘單元對(duì)萘酚-香豆素偶聯(lián)物的有效能量轉(zhuǎn)移減少。當(dāng)用纈氨酸(50.0當(dāng)量)處理,在365 nm處激發(fā)時(shí),在λ=465 nm處出現(xiàn)較大的熒光增強(qiáng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),D-纈氨酸和L-纈氨酸在這種激發(fā)下都引起了類似的熒光增強(qiáng)。長(zhǎng)波長(zhǎng)(λ=554 nm)的發(fā)射減少,而短波長(zhǎng)(λ=465 nm)的發(fā)射大大增強(qiáng),表明1,4-加成會(huì)破壞萘酚單元與香豆素環(huán)的結(jié)合[30,31]。

圖8 (R)-9與D/L-Val作用的熒光譜圖[20]

當(dāng)(S)-9的HEPES緩沖溶液在λ6=467 nm處被激發(fā)時(shí),在λ=558 nm處出現(xiàn)了寬發(fā)射。結(jié)果表明,該發(fā)射帶在與纈氨酸反應(yīng)時(shí)表現(xiàn)出高度的對(duì)映選擇性響應(yīng)。如圖9(a,b)所示,L-Val的加入增強(qiáng)了(S)-9的熒光,而D-Val的加入則導(dǎo)致了558 nm處的熒光猝滅,而且在氨基酸存在的情況下,發(fā)射峰最大值出現(xiàn)了輕微的藍(lán)移。圖9(c)比較了(S)-9與100當(dāng)量D-Val和L-Val反應(yīng)后的熒光光譜,得到了在λ=534 nm時(shí)的熒光比IL/ID為12.5。從圖9d可以看出,IL/ID所代表的對(duì)映選擇性隨著氨基酸濃度的增加而增加,在氨基酸為100當(dāng)量時(shí)達(dá)到最大值。具體反應(yīng)過(guò)程是:(S)-9(1.0 mmol/L在DMSO中,1.0當(dāng)量)與L-Val和D-Val(5.0～100.0當(dāng)量)在HEPES緩沖液中反應(yīng)2 h,然后用HEPES稀釋至1.0 × 10-5mol·L-1。將得到的溶液放置1小時(shí)后,觀察并記錄了相對(duì)穩(wěn)定的熒光響應(yīng)。這種增強(qiáng)的長(zhǎng)波長(zhǎng)發(fā)射[λ=467(激發(fā)) / 534(發(fā)射) nm]與短波長(zhǎng)的熒光響應(yīng)[λ=365(激發(fā))/465(發(fā)射) nm]對(duì)比表明,這兩種熒光響應(yīng)于(S)-9與氨基酸的不同反應(yīng)。也就是說(shuō),在萘酚單位和香豆素環(huán)之間的結(jié)合保留過(guò)程中,加入的氨基酸促進(jìn)了在探針上的1,2-加成反應(yīng)形成了亞胺。

圖9 (S)-9與(a)L-Val,(b)D-Val,(c)L-和D-Val及(d)534 nm時(shí)的熒光強(qiáng)度比IL/ID與纈氨酸濃度的熒光譜圖[20]

圖10 (R)-9和(S)-9在534 nm處的熒光強(qiáng)度與纈氨酸對(duì)映體組成的對(duì)應(yīng)關(guān)系[20]

圖10研究了在不同對(duì)映體組成下(S)-9和(R)-9對(duì)纈氨酸的熒光響應(yīng)。圖中繪制了該對(duì)映體探針在534 nm處的熒光強(qiáng)度與纈氨酸的對(duì)映體過(guò)量值[ee=([L]-[D])/([L]+[D])]的關(guān)系,結(jié)果顯示了該對(duì)映體探針與對(duì)映體過(guò)量值間的鏡像關(guān)系,可用于確定氨基酸的對(duì)映體組成。

當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm時(shí),氨基酸的兩個(gè)對(duì)映體與探針作用;然而,當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為467 nm時(shí),氨基酸的一個(gè)對(duì)映體增強(qiáng)了探針的熒光,而另一個(gè)對(duì)映體則。因此,對(duì)于該熒光探針,當(dāng)在365 nm處激發(fā)時(shí)可以測(cè)定氨基酸的濃度,在467 nm處激發(fā)可以測(cè)定對(duì)映體的組成。

5 雙響應(yīng)熒光分子探(S)-12研究進(jìn)展

5.1 雙響應(yīng)熒光分子探針(S)-12的設(shè)計(jì)與合成

此前,研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)BINOL的二醛(R)-2與Zn(II)結(jié)合后通過(guò)胺-醛縮合反應(yīng),Zn(II)離子配位和分子間結(jié)合,產(chǎn)生了像配合物13這樣的二聚體配合物產(chǎn)生了對(duì)映選擇性熒光增強(qiáng)[23]。針對(duì)這一過(guò)程,作者提出了一種兩步驟的熒光增強(qiáng)機(jī)制:(1) Zn(II)與亞胺的配位限制了激發(fā)態(tài)C=N鍵的異構(gòu)化;(2) 大環(huán)二聚體產(chǎn)物13的形成使結(jié)構(gòu)僵化,并限制了BINOL單元圍繞其1,1-鍵的旋轉(zhuǎn)[22,32]。(R)-2可以對(duì)幾種氨基酸表現(xiàn)出對(duì)映選擇性的熒光識(shí)別,但它對(duì)特定的氨基酸底物卻不能進(jìn)行化學(xué)選擇性識(shí)別。為了對(duì)組氨酸等特定氨基酸進(jìn)行同時(shí)具有化學(xué)選擇性和對(duì)映選擇性的熒光識(shí)別,該文章對(duì)BINOL-醛基探針的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)的修飾(圖11)。

圖11 熒光探針(R)-2與氨基酸和Zn(II)的反應(yīng)

該文章設(shè)計(jì)制備了單醛探針(S)-12,用于在Zn(II)存在下對(duì)組氨酸進(jìn)行選擇性識(shí)別。當(dāng)(S)-12與組氨酸和Zn2+反應(yīng)后,可以產(chǎn)生一個(gè)像13這樣的六配位的Zn(II)配合物14,以限制BINOL單元的旋轉(zhuǎn),從而增強(qiáng)熒光信號(hào)。同時(shí)因?yàn)榻M氨酸的L-和D-對(duì)映體會(huì)導(dǎo)致14的穩(wěn)定性或結(jié)構(gòu)剛性不同,從而產(chǎn)生不同的對(duì)映體選擇性響應(yīng)。其他的氨基酸因?yàn)闆](méi)有組氨酸的咪唑取代基不能產(chǎn)生類似配合物14的結(jié)構(gòu),從而使得組氨酸可以被(S)-12化學(xué)選擇性地檢測(cè)。因此,(S)-12和Zn(II)可以作為一種高化學(xué)選擇性和高對(duì)映選擇性識(shí)別組氨酸的熒光探針(圖12)。

圖12 (S)-12與組氨酸和Zn(II)反應(yīng)形成(S)-14的反應(yīng)。

探針(S)-12是在80 ℃堿存在條件下,由(S)-10[25]與11[35]反應(yīng)先得到MOM保護(hù)的中間體,再用無(wú)水乙醚的氯化氫溶液去除該MOM保護(hù)基團(tuán)得到的(圖13)

圖13 雙響應(yīng)熒光分子探針(S)-12的合成路線

5.2 雙響應(yīng)熒光分子探針(S)-12的響應(yīng)機(jī)制

化合物(S)-12在378 nm激發(fā)時(shí)在470 nm處顯示發(fā)射峰〔圖14(a)〕。對(duì)于該發(fā)射峰,Zn(II)離子的加入對(duì)熒光強(qiáng)度沒(méi)有顯著影響。但是,當(dāng)D-或L-組氨酸逐漸加入后均降低了(S)-12 + Zn(II)溶液在λ7=470 nm處的熒光強(qiáng)度〔圖14(a～d)〕。也就是說(shuō),在這個(gè)波長(zhǎng)下的熒光猝滅過(guò)程與氨基酸的手性結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān),可用于檢測(cè)不同組氨酸的濃度變化。

同時(shí),當(dāng)(S)-12 + Zn2+被組氨酸處理時(shí),在λ8=560 nm(λexc=450 nm)處出現(xiàn)了一個(gè)新的發(fā)射峰。如圖15所示,加入D-組氨酸后該波長(zhǎng)下熒光急劇增強(qiáng),但加入L-組氨酸后熒光變化不大。因此,熒光探針(S)-12 + Zn(II)在λ8波長(zhǎng)對(duì)組氨酸表現(xiàn)出較高的對(duì)映選擇性識(shí)別。當(dāng)加入10當(dāng)量組氨酸后,對(duì)映選擇性熒光增強(qiáng)比值[ef=(ID-I0) /(IL-I0),I0:未加D-和L-組氨酸的的熒光強(qiáng)度]為24.3〔圖15(a)〕0 。

圖14 (S)-12 + Zn(OAc)2與(a)D-和L-組氨酸,(b)不同濃度的D-組氨酸,(c)不同濃度的L-組氨酸的熒光譜圖,(d)在470 nm處的熒光強(qiáng)度與逐漸加入的D-和L-組氨酸當(dāng)量之比[21]

圖15 (S)-12 + Zn(OAc)2與(a)D-和L-組氨酸,(b)不同當(dāng)量的D-組氨酸,(c)不同當(dāng)量的L-組氨酸的熒光譜圖,(d)在560 nm處的熒光強(qiáng)度與D-和L-組氨酸的當(dāng)量之比[21]

當(dāng)(S)-12 + Zn(II)對(duì)17對(duì)常見氨基酸(包括組氨酸)的進(jìn)行熒光響應(yīng)研究時(shí),在相同的條件下,所有17個(gè)氨基酸都降低了探針在λ7=470 nm(λexc=378 nm)處的熒光強(qiáng)度,沒(méi)有對(duì)映選擇性響應(yīng)。然而,在λ8=560 nm(λexc=450 nm)時(shí),只有L-組氨酸顯示出顯著熒光增強(qiáng)(圖16)。因此,該探針(S)-12 + Zn(II)對(duì)組氨酸的熒光識(shí)別具有高度的化學(xué)選擇性。

圖16 (S)-12 + Zn(OAc)2對(duì)17種氨基酸的熒光響應(yīng)[21]

6 雙響應(yīng)熒光分子探(S)-17研究進(jìn)展

6.1 雙響應(yīng)熒光分子探針(S)-17的設(shè)計(jì)與合成

2022年,研究報(bào)道了一種基于雙BINOL的熒光傳感器,它可以化學(xué)選擇性地識(shí)別精氨酸(Arg),但它沒(méi)有表現(xiàn)出良好的對(duì)映選擇性識(shí)別效果。作者推測(cè)當(dāng)加入一個(gè)活性更高的反應(yīng)位點(diǎn)時(shí),可以獲得一種新的、更簡(jiǎn)化的熒光識(shí)別機(jī)制。作為候選基團(tuán),丙烯酸酯因在邁克爾加成反應(yīng)中作為良好的親電試劑,廣泛應(yīng)用于聚合物合成中[37,38],因此其也可用作熒光識(shí)別基團(tuán)。

圖17 雙響應(yīng)熒光分子探針(S)-17的合成路線

圖17提出了一種基于BINOL的熒光探針(S)-17的高效合成方法。該方法為先在氫化鈉存在的情況下,用過(guò)量的MOMBr處理(S)-BINOL,得到了雙MOM保護(hù)的BINOL(S)-15。隨后用過(guò)量的正丁基鋰脫質(zhì)子化和DMF甲?；?得到中間體(S)-16。后在酸性條件下去除MOM保護(hù)基團(tuán),得到(S)-2,最后在弱有機(jī)堿二異丙基乙胺的存在下,(S)-2與丙烯酰氯反應(yīng),在BINOL環(huán)的一側(cè)得到一個(gè)丙烯酸酯,反應(yīng)產(chǎn)率為39%。

圖18 (S)-17對(duì)20種氨基酸對(duì)映體的熒光響應(yīng)[21]

6.2 雙響應(yīng)熒光分子探針(S)-17的響應(yīng)機(jī)制

在圖18中,發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm時(shí),(S)-17與大多數(shù)常見氨基酸的D-或L-對(duì)映體作用時(shí),只產(chǎn)生了非常小的熒光增強(qiáng)。然而,D-Arg在λ=525 nm處的熒光卻顯著增強(qiáng),其強(qiáng)度比L-Arg高出528%。對(duì)映體選擇性比值為487。除此之外,(S)-17還具有化學(xué)選擇性,其對(duì)D-Arg的熒光響應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他任何一種氨基酸。因此,(S)-17僅對(duì)Arg不僅有對(duì)映選擇性識(shí)別還有化學(xué)選擇性識(shí)別。

圖19 傳感器的手性導(dǎo)致對(duì)精氨酸對(duì)映體的不同熒光響應(yīng)[22]

圖20 手性傳感器對(duì)精氨酸對(duì)映體的對(duì)映選擇性熒光增強(qiáng)圖[22]

當(dāng)用已知濃度的(S)-17溶液測(cè)定其對(duì)L-和D-Arg的響應(yīng),如圖19(a)所示,熒光強(qiáng)度隨著Arg濃度的增加而增加,當(dāng)加入到5當(dāng)量D-Arg,此時(shí)熒光增強(qiáng)峰值達(dá)到飽和。在對(duì)映體0～5當(dāng)量范圍內(nèi),線性回歸系數(shù)R2>0.99。因此,確定D-Arg的檢測(cè)限(LOD)為50 nmol/L(LOD=3×SD/k,其中SD為空白標(biāo)準(zhǔn)偏差,k為校準(zhǔn)曲線的斜率)。在相同的條件下使用(R)-17進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn),如圖19(b)和圖19(d)所示,與L-Arg作用時(shí)下熒光顯著增強(qiáng)。這證實(shí)了所觀察到的對(duì)精氨酸對(duì)映體的差異熒光響應(yīng)來(lái)源于手性識(shí)別過(guò)程。

同時(shí),如圖20所示,還研究了精氨酸溶液在不同對(duì)映體過(guò)量值情況下的熒光響應(yīng)(ee=[D-L]/[D+L])。不同對(duì)映體過(guò)量值下的(S)-17和(R)-17的熒光響應(yīng)呈現(xiàn)出近似鏡像的關(guān)系。因此,與圖19中所示的結(jié)果一致,不同ee的熒光響應(yīng)研究進(jìn)一步證實(shí)了所觀察到的對(duì)映體選擇性識(shí)別來(lái)源于手性匹配關(guān)系。

令人驚奇的是該Arg的對(duì)映選擇性識(shí)別可以通過(guò)肉眼來(lái)區(qū)分。當(dāng)加入D-Arg后,探針溶液呈現(xiàn)深棕色(圖21),而L-Arg的加入使溶液變?yōu)闇\棕色,其他氨基酸都沒(méi)有顯著地顏色變化。這一現(xiàn)象表明,探針(S)-17與Arg的反應(yīng)機(jī)理是完全不同的。

圖21 (S)-17的比色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)[22]

圖21 傳感反應(yīng)可能的產(chǎn)物[22]

認(rèn)為形成了圖21所示的產(chǎn)物,并通過(guò)量化計(jì)算研究了其發(fā)光機(jī)制,認(rèn)為是傳感反應(yīng)產(chǎn)物中的分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移(ICT)導(dǎo)致了熒光增強(qiáng)現(xiàn)象。

7 結(jié)論與展望

(R)-4的設(shè)計(jì)合成及手性熒光識(shí)別應(yīng)用證實(shí)了對(duì)映選擇性熒光傳感器可以作為雙響應(yīng)熒光傳感器,同時(shí)確定手性底物的濃度和對(duì)映體組成,極大地促進(jìn)手性氨基酸化合物的快速測(cè)定。該探針的設(shè)計(jì)原理逐漸成為開發(fā)雙響應(yīng)熒光傳感器的一種通用策略。該策略為:化合物(R)-4在Zn2+存在下識(shí)別手性功能胺,如二胺、氨基醇和氨基酸時(shí),(R)-4中的2-萘胺單元可以與各種手性胺底物進(jìn)行換位反應(yīng),從而呈現(xiàn)兩個(gè)波長(zhǎng)的熒光增強(qiáng)效應(yīng),一個(gè)波長(zhǎng)可用于底物濃度識(shí)別,另一個(gè)波長(zhǎng)用于底物對(duì)映體選擇性識(shí)別。因此,在這兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)上的熒光響應(yīng)的一次測(cè)量可以測(cè)定濃度和對(duì)映體組成。

表2 四類不同探針?lè)肿討?yīng)用特點(diǎn)總結(jié)

但該傳感器的應(yīng)用也存在一些問(wèn)題,該傳感器可以對(duì)種氨基酸產(chǎn)生雙重?zé)晒忭憫?yīng),化學(xué)選擇性效果差。而且其與苯丙氨酸相互作用時(shí),對(duì)映選擇性比值ef高達(dá)13,但對(duì)其他氨基酸的對(duì)映選擇性比值要低得多(ef=1～4),針對(duì)這一現(xiàn)象的機(jī)理解釋有待進(jìn)一步研究。此外,由于該探針?biāo)苄圆?且與氨基酸形成的席夫堿配合物在水溶液中不穩(wěn)定,測(cè)量主要在甲醇溶液中進(jìn)行,不利于后期生物應(yīng)用研究。熒光探針(R)-9的雙波長(zhǎng)識(shí)別機(jī)制為與氨基酸的氨基親核反應(yīng)通過(guò)兩種途徑進(jìn)行,一種是通過(guò)1,4-加成反應(yīng)脫掉香豆素單元8,8再與氨基酸反應(yīng);另一種是與氨基酸的氨基進(jìn)行1,2-親核加成反應(yīng)形成亞胺。兩種不同的途徑產(chǎn)生不同的中間體和產(chǎn)物,從而產(chǎn)生不同的熒光。與之前報(bào)道的基于BINOL的氨基酸熒光探針需要添加Zn2+配位產(chǎn)生對(duì)映選擇性熒光增強(qiáng)相比,該探針不需要添加金屬陽(yáng)離子,而且該探針識(shí)別氨基酸主要在水溶液中進(jìn)行,這使得它更便于實(shí)際應(yīng)用。對(duì)于探針(S)-12,其與組氨酸和Zn2+反應(yīng),形成了一個(gè)六配位的Zn(II)配合物,限制了BINOL單元的旋轉(zhuǎn),從而顯示熒光增強(qiáng)。同時(shí)因組氨酸的L-和D-對(duì)映體可能導(dǎo)致14的穩(wěn)定性和/或結(jié)構(gòu)剛性不同,從而給出對(duì)映體選擇性響應(yīng)。該熒光分子探針僅對(duì)組氨酸有較高的對(duì)映選擇性識(shí)別,對(duì)其他D-和L-氨基酸均沒(méi)有熒光響應(yīng),原因是其他氨基酸沒(méi)有組氨酸的咪唑取代基不能產(chǎn)生配合物14這樣的結(jié)構(gòu),使得僅組氨酸可以被(S)-12選擇性地檢測(cè)到。但是探針(S)-12對(duì)組氨酸的檢測(cè)是在DMF溶劑中進(jìn)行的,這導(dǎo)致在生物細(xì)胞領(lǐng)域當(dāng)中的應(yīng)用受到限制。探針(S)-17具有多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn),可以特異性識(shí)別常見20種氨基酸中的精氨酸,具有化學(xué)選擇性識(shí)別;同時(shí)其對(duì)精氨酸的對(duì)映選擇性識(shí)別效果也很好,ef值可達(dá)到487。該熒光探針對(duì)手性精氨酸的特異性識(shí)別來(lái)源于探針結(jié)構(gòu)引入的丙烯酸酯基團(tuán),該基團(tuán)產(chǎn)生了一個(gè)額外的反應(yīng)位點(diǎn),只與某種精氨酸對(duì)映體形成環(huán)狀化合物。量化計(jì)算研究支持了這樣的假設(shè),因形成的邁克爾加成產(chǎn)物,具有強(qiáng)烈的分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移,從而發(fā)出強(qiáng)烈的熒光,產(chǎn)生了化學(xué)選擇性和對(duì)映選擇性識(shí)別。與其他用于檢測(cè)手性氨基酸的熒光探針相比,該探針具有特異性檢測(cè)精氨酸,無(wú)金屬離子添加,快速響應(yīng)和比色檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。

目前,很多儀器識(shí)別方法發(fā)展起來(lái)用于識(shí)別氨基酸的對(duì)映異構(gòu)體,這些光學(xué)純度分析方法有CD[39]、HPLC[40]和電化學(xué)方法[41]等,但是這些分析方法需要較高的儀器成本,精密和仔細(xì)的操作,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,無(wú)法適用于痕量氨基酸分析,特別是對(duì)一些先導(dǎo)藥物篩選及細(xì)胞內(nèi)涉及手性物質(zhì)代謝的原位分析等方面難以達(dá)到預(yù)期效果。而通過(guò)對(duì)細(xì)胞代謝的一些重要產(chǎn)物或中間體氨基酸進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)原位分析,可闡明此類化合物的代謝過(guò)程,手性藥物的作用機(jī)制等。在諸多對(duì)手性氨基酸的檢測(cè)方法中,熒光檢測(cè)借助其高靈敏度、高選擇性、響應(yīng)時(shí)間短、可原位檢測(cè)、多種檢測(cè)模式、高吞吐量分析潛能和無(wú)創(chuàng)性實(shí)時(shí)成像等優(yōu)點(diǎn)在手性識(shí)別分析中備受關(guān)注。特別是用單一熒光探針雙波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定手性底物濃度和對(duì)映體組成,可以極大地促進(jìn)手性化合物的快速分析。因此對(duì)近幾年所發(fā)表的在手性識(shí)別氨基酸方面的雙響應(yīng)熒光傳感器進(jìn)行總結(jié)整理,窺一斑而知全豹,以此為起點(diǎn),知曉這一測(cè)定思路,可以指導(dǎo)并開發(fā)其他類手性雙響應(yīng)熒光傳感器。同時(shí),該領(lǐng)域仍有一些問(wèn)題存在,需要在未來(lái)加以解決。第一,由于特定氨基酸的結(jié)構(gòu)相似,對(duì)其單個(gè)對(duì)映體的特異性檢測(cè)仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。第二,熒光分子探針對(duì)氨基酸檢測(cè)由于金屬的加入以及反應(yīng)條件的影響,在細(xì)胞領(lǐng)域應(yīng)用受限。第三,熒光分子探針識(shí)別氨基酸,為什么對(duì)某一種氨基酸存在熒光響應(yīng),而對(duì)其他結(jié)構(gòu)相似的氨基酸沒(méi)有熒光響應(yīng)或熒光響應(yīng)較弱,其中的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。相信在未來(lái)的諸多學(xué)者的不懈努力下,一定會(huì)有更多簡(jiǎn)單而又高效的雙響應(yīng)傳感器產(chǎn)生,并在生物細(xì)胞領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。