蔣玲玲 劉穎蕾 劉曼華 鄭艷莉 喬海風(fēng) 陳麗平

我國是卵巢癌的高發(fā)國家,卵巢癌已成為威脅女性生命健康的常見惡性腫瘤之一。卵巢癌早期無典型癥狀,以致于很大部分患者一經(jīng)確診,已發(fā)展至中晚期,錯失最佳的治療時機(jī)［1］。研究報道指出［2］,卵巢癌的整體生存率在47%左右,但對于晚期卵巢癌患者,生存率明顯下降,5 年生存率僅有29%左右。因此,如何實現(xiàn)早期科學(xué)準(zhǔn)確地預(yù)警判斷,對于卵巢癌早期科學(xué)防治具有重要意義。現(xiàn)有研究顯示,卵巢癌的發(fā)生與相關(guān)信號途徑激活有關(guān),特別是與PI3K/AKT 信號途徑密切關(guān)聯(lián)。也就是說,通過對信號途徑研究,對卵巢癌早期誘發(fā)因素的檢測分析,可以實現(xiàn)早期科學(xué)預(yù)警,對卵巢癌臨床診治提供了重要保障。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、靜止和增殖的重要細(xì)胞內(nèi)途徑,即PI3K/AKT/mTOR 信號通路激活能夠促進(jìn)上皮性卵巢癌(EOC)細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移［3］。因此,對卵巢癌細(xì)胞REG3A 與PI3K/AKT 通路的表達(dá)研究,對于了解癌癥分期進(jìn)展及相關(guān)預(yù)后,具有十分重要的意義。本文選擇本院2019 年1 月～2021 年12 月收治的60 例卵巢癌患者的卵巢癌組織及癌旁組織作為研究材料,就卵巢癌細(xì)胞REG3A 與PI3K/AKT 通路的表達(dá)情況進(jìn)行如下闡述。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次研究選擇本院2019 年1 月～2021 年12 月收治的60 例卵巢癌患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①確診為卵巢癌患者；②預(yù)期生存時間>6 個月患者；③無嚴(yán)重精神障礙患者；④按照規(guī)定完成組織留樣患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他惡性腫瘤患者；②合并有嚴(yán)重精神障礙患者；③不愿參與本次研究患者。所有患者年齡41～76 歲,平均年齡(52.67±7.88)歲。經(jīng)癌癥分期評價(tumor node metastasis classification,TNM)：Ⅰ期15 例,Ⅱ期20 例,Ⅲ期18 例,Ⅳ期7 例。本次研究經(jīng)患者及其家屬同意,并簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器 ①上海信帆生物科技有限公司提供的鏈霉親和素-生物素復(fù)合物法免疫組織化學(xué)試劑盒；②美國Abcam 公司提供的REG3A 特異性-抗試劑盒及總RNA 提取試劑盒等；③上海信帆生物科技有限公司提供熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 樣本組織中REG3A 表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測 將卵巢癌及其癌旁組織制作成病理切片,經(jīng)鏈霉親和素-生物素復(fù)合物法免疫組織化學(xué)檢測REG3A 的表達(dá)水平。經(jīng)REG3A 特異性-抗染色之后,于高倍鏡下進(jìn)行相關(guān)結(jié)果的判讀。本次研究中,染色強(qiáng)度的積分標(biāo)準(zhǔn)為0、1、2、3 分,并分別代表無染色、淡黃色、棕黃色、棕褐色。陽性染色細(xì)胞比率積分標(biāo)準(zhǔn)為0、1、2、3、4 分,并分別代表<10%、10%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%。在陽性判斷中,上述兩項積分的乘積≥4 分,則為陽性,反之則為陰性。

1.3.2 樣本組織中REG3A 表達(dá)的熒光定量PCR檢測 采用總RNA 提取試劑對卵巢癌及其癌旁組織提取總RNA,并經(jīng)熒光定量PCR 檢測REG3A 的mRNA 表達(dá)水平。

1.3.3 樣本組織中p-PI3K、p-AKT 的表達(dá)檢測 將裂解液加入到卵巢癌及其癌旁組織中裂解,并提取相關(guān)蛋白。在經(jīng)電泳分離之后,實現(xiàn)對不同分子量蛋白的分離,以及電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,之后放入5%脫脂牛奶中,溫室孵育1 h,并在洗膜之后,放入1∶1000稀釋的p-PI3K、p-AKT 一抗中4℃孵育過夜。在第2 天,經(jīng)洗膜3 次之后,將硝酸纖維素膜放入1∶2000稀釋的二抗中室溫孵育,孵育也控制在1 h,最終在凝膠成像儀中顯影得到 p-PI3K、p-AKT 的蛋白條帶。

1.3.4 Real-time PCR 檢測 REG3A 檢測在4 株人卵巢癌細(xì)胞A2780、HEY、SKOV3、ES2 和1 株人正常卵巢上皮組織細(xì)胞中的表達(dá)。高表達(dá)REG3A 的細(xì)胞株：SKOV3、ES2 細(xì)胞；低表達(dá)REG3A 的細(xì)胞株：A2780、HEY 細(xì)胞。

1.4 觀察指標(biāo) ①比較卵巢癌及其癌旁組織中REG3A 的表達(dá)情況；②比較卵巢癌及其癌旁組織中p-PI3K、p-AKT 的表達(dá)情況；③分析卵巢癌組織中REG3A 與p-PI3K、p-AKT 的相關(guān)性；④通過western blot 檢測PI3K/AKT 通路中關(guān)鍵蛋白分子磷酸化情況。通過基因轉(zhuǎn)染,構(gòu)建REG3A 過表組卵巢癌細(xì)胞,繼而阻斷PI3K/AKT 通路,檢測卵巢癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移和藥物敏感性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗；相關(guān)性檢驗采用Pearson 相關(guān)分析。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌及其癌旁組織中REG3A 的表達(dá)情況比較 卵巢癌組織中REG3A 陽性率、REG3AmRNA 表達(dá)水平分別為65.00%、(1.02±0.19),均明顯高于癌旁組織的31.67%、(0.71±0.14),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。免疫組化檢測卵巢癌組織和癌旁組織REG3A 的表達(dá)情況見圖1。

圖1 免疫組化檢測卵巢癌組織和癌旁組織REG3A 的表達(dá)

表1 卵巢癌及其癌旁組織中REG3A 的表達(dá)情況比較［n(%),］

表1 卵巢癌及其癌旁組織中REG3A 的表達(dá)情況比較［n(%),］

注：與癌旁組織比較,aP<0.05

2.2 卵巢癌及其癌旁組織中p-PI3K、p-AKT 的表達(dá)情況比較 卵巢癌組織中p-PI3K、p-AKT 表達(dá)水平分別為(1.04±0.18)、(1.08±0.19),均明顯高于癌旁組織的(0.72±0.17)、(0.53±0.09),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。p-PI3K、p-AKT 的蛋白電泳圖見圖2。

圖2 p-PI3K、p-AKT 的蛋白電泳圖

表2 卵巢癌及其癌旁組織中p-PI3K、p-AKT 的表達(dá)情況比較()

表2 卵巢癌及其癌旁組織中p-PI3K、p-AKT 的表達(dá)情況比較()

注：與癌旁組織比較,aP<0.05

2.3 卵巢癌組織中REG3A 與 p-PI3K、p-AKT 的相關(guān)性分析 REG3A 陽性表達(dá)的卵巢癌組織中p-PI3K、p-AKT 水平明顯高于REG3A 陰性表達(dá)的卵巢癌組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。相關(guān)性分析顯示：REG3A 表達(dá)水平與 p-PI3K、p-AKT 表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.387、0.426,P<0.05)。見表3,表4。

表3 REG3A 陽性與陰性表達(dá)的卵巢癌組織中p-PI3K、p-AKT 水平比較()

表3 REG3A 陽性與陰性表達(dá)的卵巢癌組織中p-PI3K、p-AKT 水平比較()

注：與陰性表達(dá)比較,aP<0.05

表4 卵巢癌組織中REG3A 與 p-PI3K、p-AKT 的相關(guān)性分析

2.4 卵巢癌細(xì)胞中敲減REG3A 和過表達(dá)REG3A情況分析 在卵巢癌細(xì)胞中敲減REG3A 和過表達(dá)REG3A,研究其對卵巢癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞克隆的影響,發(fā)現(xiàn)敲減REG3A 抑制細(xì)胞增殖和克隆形成能力,過表達(dá)REG3A 促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力。見圖3。

圖3 卵巢癌細(xì)胞中敲減REG3A 和過表達(dá)REG3A 情況

3 討論

研究報道指出,我國卵巢癌的發(fā)病率高達(dá)5.21%,已成為威脅女性生命健康的五大惡性腫瘤之一。由于卵巢癌早期無典型癥狀,在經(jīng)發(fā)現(xiàn)之后,有近70%的患者已發(fā)展至晚期［4］。因此,如何實現(xiàn)科學(xué)準(zhǔn)確的診斷,以及對癌癥進(jìn)展、預(yù)后等的科學(xué)評估分析,對于卵巢癌治療具有重要意義。近年來,隨著對卵巢癌研究的不斷深入,關(guān)于卵巢癌的發(fā)生機(jī)制有了更多研究結(jié)論,特別是卵巢癌的發(fā)生與PI3K/AKT 信號途徑有密切關(guān)聯(lián),對于更加深入研究卵巢癌具有重要的指導(dǎo)性價值。REG 為鈣依賴性植物凝集素超家族,可分為4 個亞型(1、2、3、4),其具有相似的基因結(jié)構(gòu),其中REG3 基因有REG3A、REG3b 和REG3g 三個亞基。人REG3A 與小鼠REG3g 同源性最高,兩者均有調(diào)控細(xì)胞凋亡,細(xì)胞增殖,免疫應(yīng)激等能力。有研究報道指出,REG3A 在肝癌、腸癌、卵巢癌等消化道癌癥中都存在異常表達(dá),REG3A 過表達(dá)通過激活A(yù)KT 和ERK1/2途徑,以促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展［5］。因此,從現(xiàn)有相關(guān)研究可見,REG3A 的表達(dá)水平情況,可以為臨床卵巢癌的發(fā)展分析提供依據(jù),同時也可以基于AKT 和ERK1/2 的通路研究,為卵巢癌的治療提供新的思路與方案,具有重要的研究價值。

本文研究結(jié)果顯示,卵巢癌組織中REG3A 陽性率、REG3A mRNA 表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。研究提示,卵巢癌組織中REG3A 的表達(dá)水平更高,這表明卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展與REG3A 的表達(dá)有相關(guān)性。為進(jìn)一步了解REG3A 的作用機(jī)理,對下游p-PI3K、p-AKT 通路的激活進(jìn)行了探究。本文研究結(jié)果顯示,REG3A 陽性表達(dá)的卵巢癌組織中p-PI3K、p-AKT 水平明顯高于REG3A 陰性表達(dá)的卵巢癌組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。表明卵巢癌細(xì)胞REG3A 與PI3K/AKT 通路的表達(dá)是促進(jìn)卵巢癌發(fā)生及發(fā)展的重要因素,并且在對相關(guān)性的分析中得出,REG3A 表達(dá)水平與 p-PI3K、p-AKT 表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.387、0.426,P<0.05)。REG3A 的表達(dá)顯著增加,REG3A 過表達(dá)能夠激活JAK2/STAT3 通路中JAK2 和STAT3 蛋白的磷酸化,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和粘附,REG3A 可能是卵巢癌的潛在治療靶點［6］。因此,針對卵巢癌細(xì)胞的增殖機(jī)理,通過對REG3A 過表達(dá)狀態(tài)下激活 JAK2/STAT3 的情形,可以基于REG3A 過表達(dá)的有效抑制,以實現(xiàn)對卵巢癌的有效治療,同時也可基于REG3A 的表達(dá)情況,對患者的病情程度進(jìn)行評價分析,為治療提供科學(xué)依據(jù)。

在卵巢癌細(xì)胞中敲減REG3A 和過表達(dá)REG3A,研究其對卵巢癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞克隆的影響,發(fā)現(xiàn)敲減REG3A 抑制細(xì)胞增殖和克隆形成能力,過表達(dá)REG3A促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力［7］。說明在卵巢癌發(fā)展中,REG3A 起到了重要的促進(jìn)作用。通過對REG3A 過表達(dá)狀態(tài)的有效敲減,可對卵巢癌的分期發(fā)展及預(yù)后,具有重要的意義,為臨床卵巢癌診治提供了新的思路。過表達(dá)REG3A 與分化差、腫瘤分期高、生存率低有關(guān),通過REG3A 表達(dá)水平的抑制,可減輕REG3A 與PI3K/AKT 通路的激活程度,可為臨床治療提供良好調(diào)減［8,9］。特別是對于晚期卵巢癌患者,已措施最佳的手術(shù)等治療時間,通過對REG3A 與PI3K/AKT 通路的抑制,可以成為臨床治療的新思路。此外,通過REG3A 表達(dá)水平,對患者癌癥分期、發(fā)展等進(jìn)行評估,也可以預(yù)后治療提供依據(jù)。目前,卵巢癌已成為危害女性生命健康的常見惡性腫瘤之一,通過對REG3A 與PI3K/AKT 通路的抑制,可以從卵巢癌的治療及抑制等維度,提高卵巢癌的治療效果,成為當(dāng)前卵巢癌臨床研究的重要內(nèi)容及方向。

綜上所述,REG3A 在卵巢癌中高表達(dá),并且預(yù)后不良,其能通過促進(jìn)PI3K/AKT 通路的磷酸化促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和藥物抵抗能力。卵巢癌組織中REG3A 表達(dá)水平的升高與p-PI3K、p-AKT 的激活、癌癥分期進(jìn)展等有關(guān)。通過分析臨床數(shù)據(jù),結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)實驗和分子生物學(xué)實驗明確REG3A 對卵巢癌細(xì)胞惡性腫瘤學(xué)表型的影響,并研究其潛在的分子調(diào)控機(jī)制,通過動物水平的裸鼠荷載瘤實驗研究REG3A 對腫瘤生長的影響,以期為探究卵巢癌的發(fā)病機(jī)制和尋找卵巢癌的藥物治療靶點提供新思路。