王琳琳,呂亞男,李增敬,崔林涵,楊 蕓,梁榮財(cái),王愛(ài)萍

(1.山東綠葉制藥有限公司長(zhǎng)效和靶向制劑國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 煙臺(tái) 264003;2.煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺(tái) 264005)

納米藥物傳遞系統(tǒng)對(duì)難溶性藥物體內(nèi)遞送起到了至關(guān)重要的作用。納米混懸劑是由藥物和少量穩(wěn)定劑組成的純藥物粒子分散在水溶液中的亞微米膠體分散體系,不需要載體材料,制備工藝簡(jiǎn)單,載藥量高[2]。納米混懸劑在滿足體內(nèi)釋藥行為的基礎(chǔ)上,應(yīng)具有適當(dāng)?shù)牧６扰c粒度分布,以減小粒子的沉降速度,從而使混懸劑處于穩(wěn)定狀態(tài)。目前納米混懸劑的制備方法主要有Top-down(分散法)和Bottom-up(凝聚法)兩種[2]。Top-down是在穩(wěn)定劑的存在下,將較大粒度的原料藥分散成小顆粒的藥物形式,主要方法有介質(zhì)研磨法、高壓均質(zhì)法等。Bottom-up是將藥物溶解在適當(dāng)?shù)牧既軇┲?然后通過(guò)溶液中的藥物在反溶劑中沉淀形成小顆粒的藥物形式。一般將良溶劑為有機(jī)溶劑、不良溶劑為水相制備納米混懸劑的方法稱為反溶劑沉淀法;而對(duì)于弱酸或者弱堿性藥物則可通過(guò)調(diào)節(jié)藥液的pH值來(lái)制備納米混懸劑,稱為pH沉淀法[3]。Top-down的優(yōu)點(diǎn)在于任何疏水性藥物均可以采用該方法進(jìn)行制備,但高壓均質(zhì)法能耗較大,介質(zhì)研磨法可能存在研磨介質(zhì)殘留在混懸液中的問(wèn)題。Bottom-up的優(yōu)點(diǎn)在于制備工藝簡(jiǎn)單,但可能存在有機(jī)溶劑殘留或者混懸液過(guò)酸或過(guò)堿的現(xiàn)象[4]。

美洛昔康(MLX)是一種非甾體抗炎藥,屬于BCS II類(lèi)藥物,適用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、疼痛性骨關(guān)節(jié)炎和術(shù)后疼痛等方面的治療[5],其中在術(shù)后疼痛方面,由于口服吸收起效慢,限制了其在術(shù)后急性疼痛領(lǐng)域的應(yīng)用。為提高藥物溶出速率和生物利用度,研究者將難溶性藥物制備成納米尺寸的中間體或最終制劑,用于口服或其他給藥途徑,有望實(shí)現(xiàn)溶出速率和生物利用度的提高[6]。MLX溶于DMSO、DMF等有機(jī)溶劑,且為弱酸性藥物,溶解度隨溶液pH值的升高而增加。本研究根據(jù)前期處方研究結(jié)果,使用0.5%膽酸鈉和0.5%吐溫20為穩(wěn)定劑[7],分別采用介質(zhì)研磨法、反溶劑沉淀法以及pH沉淀法制備美洛昔康納米混懸液(MLX-NS),考察三種方法對(duì)MLX-NS粒度、形貌、晶型、體外釋放度以及穩(wěn)定性的影響,篩選最優(yōu)的MLX-NS制備方法,為MLX納米混懸劑的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

DYNO-MILL球磨機(jī)(瑞士WEB公司);PE20K puls pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司);1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司);T25 高剪切分散乳化機(jī)(德國(guó)IKA公司);3000型激光粒度儀(英國(guó)Mastersizer公司); XPE205型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司);DSC822e型差式掃描量熱儀(瑞士Mattler Toledo公司);MIX control 20多點(diǎn)磁力攪拌器(德國(guó)2mag公司);2.5L型凍干機(jī)(美國(guó)Labconco公司);D2 PHASER型X射線衍射儀(德國(guó)Bruker公司)。

1.2 試藥與試劑

美洛昔康(190606,純度為99.8%,江蘇飛馬藥業(yè)有限公司);氫氧化鈉(湖南爾康藥業(yè)股份有限公司);濃鹽酸(昆山金城試劑有限公司);DMSO(aladdin);膽酸鈉(上海麥克林生化科技有限公司);吐溫20(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙酸銨(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);甲醇(色譜純,德國(guó)Merck KGaA公司)。

1.3 HPLC色譜條件

采用Aglient-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm) 色譜柱,以甲醇- 0.2 mol/L乙酸銨水溶液(50:50)為流動(dòng)相,進(jìn)樣量為10 μL,柱溫為37 ℃,流速為1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。

1.4 MLX-NS的制備

1.4.1 介質(zhì)研磨法 將適量MLX原料預(yù)先分散在0.5 %膽酸鈉和0.5%吐溫20的水溶液中攪拌30 min,制得1%的MLX初混懸液。在研磨腔中填裝80%的0.4 mm氧化鋯研磨珠。開(kāi)啟研磨機(jī),調(diào)整研磨機(jī)轉(zhuǎn)速為1500 r/min,通過(guò)控制冷卻水溫度,使研磨溫度保持在30 ℃以下。藥物混懸液被泵入研磨室,經(jīng)過(guò)研磨珠研磨一定時(shí)間后停止研磨,即得介質(zhì)研磨法制備的MLX-NS。

1.4.2 反溶劑沉淀法 將適量MLX原料溶解于DMSO中(MLX為4%)作為有機(jī)相;稱取穩(wěn)定劑(0.1 g吐溫20和0.1 g膽酸鈉)溶于適量蒸餾水中作為水相,有機(jī)相和水相按1:6比例,在13 000 r/min高速剪切作用下,將有機(jī)相加入到水相中,并繼續(xù)剪切2 min,即得反溶劑沉淀法制備的MLX-NS。

1.4.3 pH沉淀法 將0.3 g MLX原料、穩(wěn)定劑(0.1 g吐溫20和0.1 g膽酸鈉)溶解于適量 0.1 mol/mL氫氧化鈉中(MLX為1.5%),并在13 000 r/min高速剪切作用下將1 mol/L鹽酸溶液按1:1比例加入含有藥物和穩(wěn)定劑的堿性溶液中,并繼續(xù)在13 000 r/min下剪切2 min,即得pH沉淀法制備的MLX-NS。

將三種方法制備的MLX-NS置于室溫下保存待用,另分別取少量MLX-NS水洗離心去除輔料后凍干,凍干粉用于形貌和晶型的檢測(cè)。

1.5 納米混懸劑的表征

1.5.1 粒度 取適量MLX-NS,以蒸餾水為分散介質(zhì)稀釋至適宜濃度,保持遮光率約為6%,采用馬爾文3000型激光粒度儀測(cè)定粒度與粒度分布。

1.5.2 形態(tài) 取適量MLX-NS凍干粉分散附有導(dǎo)電膠的樣品板上,真空噴金后采用掃描電子顯微鏡觀察形貌。

1.5.3 晶型 取適量MLX-NS凍干粉置于樣品板中,采用Bruker X射線衍射儀以0.02步長(zhǎng)和5 °/min的掃描速度進(jìn)行測(cè)試,記錄5～40 °下的衍射圖。

取適量MLX-NS凍干粉,放入鋁坩堝中,采用差式掃描量熱儀以20 ℃/min的升溫速率進(jìn)行測(cè)試,記錄吸放熱曲線。

1.5.4 體外釋放度 取0.5 mL MLX-NS于透析袋中(14 KD),以40 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖液為釋放介質(zhì),設(shè)定恒溫振蕩器轉(zhuǎn)速為50 r/min,溫度為37 ℃。在0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、36、48和72 h分別取樣1 mL,同時(shí)補(bǔ)加1 mL釋放介質(zhì),測(cè)定并計(jì)算美洛昔康的體外累計(jì)釋放度。

1.5.5 短期穩(wěn)定性 將MLX-NS室溫放置14 d,于0 d、3 d、7 d和14 d測(cè)定粒度及粒度分布,考察制劑短期穩(wěn)定性。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 粒度與形貌

采用介質(zhì)研磨法、反溶劑沉淀法以及pH沉淀法制備的MLX-NS粒度及粒度分布見(jiàn)表1,掃描電鏡照片見(jiàn)圖1。三種方法制備MLX-NS的d50處于300～600 nm,但介質(zhì)研磨法的MLX-NS呈不規(guī)則顆粒狀,棱角分明,粒度分布較寬;而反溶劑沉淀法以及pH沉淀法制備的MLX-NS呈圓潤(rùn)顆粒狀,粒度分布較窄。

表1 不同方法制備的MLX-NS的粒度及粒度分布(n=3)

圖1 MLX-NS凍干粉的掃描電鏡圖

2.2 晶型

制備方法可能影響MLX-NS的晶型,將三種方法制備的MLX-NS粉末進(jìn)行XRD和DSC檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。三種方法制備MLX-NS的DSC圖中的吸熱峰與MLX相比稍有提前,可能是由于混懸液藥物粒子尺寸較小,比表面積大,加熱時(shí)熱量從表面向顆粒內(nèi)部的傳熱速率較大,更容易汽化,更早分解能量所致[8-10]。介質(zhì)研磨法和pH沉淀法制備的MLX-NS與MLX原料的XRD和DSC圖峰位幾乎一致,表明這兩種方法制備的MLX-NS晶型未發(fā)生改變;而反溶劑沉淀法制備的MLX-NS與MLX原料的XRD圖峰位相差較大,且其DSC圖與原料圖相比在吸熱峰前出現(xiàn)一個(gè)明顯吸熱過(guò)程,說(shuō)明反溶劑沉淀法使MLX-NS發(fā)生了轉(zhuǎn)晶[11]。

圖2 三種方法制備的MLX-NS凍干粉及MLX的XRD圖

圖3 三種方法制備的MLX-NS凍干粉及MLX的DSC圖

2.3 體外釋放

將三種方法制備的MLX-NS和MLX原料進(jìn)行體外釋放度測(cè)定(粒度結(jié)果見(jiàn)表1),結(jié)果見(jiàn)圖4。將MLX原料制成MLX-NS后可顯著提高體外溶出速率,在2 h時(shí)釋放超過(guò)20%,有望實(shí)現(xiàn)在術(shù)后鎮(zhèn)痛領(lǐng)域快速起效的用途。三種方法制備的MLX-NS中介質(zhì)研磨法釋放較慢,這是由于其粒度較大[12];pH沉淀法制備的藥物粒徑最小,因此釋放快于介質(zhì)研磨法;而反相沉淀法制備的MLX-NS釋放快于pH沉淀法,但反相沉淀法粒度大于pH沉淀法粒度,可能由于反相沉淀法制備的MLX-NS晶型發(fā)生改變,導(dǎo)致其溶解度增加,釋放加快[13]。

圖4 三種方法制備MLX-NS及MLX原料的體外釋放度曲線 (n=3)

2.4 短期穩(wěn)定性

將三種方法制備的MLX-NS常溫下放置考察其穩(wěn)定性,粒度變化情況如圖5所示。介質(zhì)研磨法和反相沉淀法制備的MLX-NS常溫放置14 d后,粒徑無(wú)顯著變化,表明其短期穩(wěn)定性良好。pH沉淀法制備的MLX-NS放置3 d時(shí),粒度顯著增加至13 μm,7 d時(shí)粒徑繼續(xù)增加至19 μm,這可能是由于pH沉淀法中制劑增大的離子強(qiáng)度影響了膽酸鈉的存在狀態(tài),從而影響了MLX-NS的等電點(diǎn),引起MLX-NS的聚集[12]。因此,從短期穩(wěn)定性角度來(lái)看,介質(zhì)研磨法和反溶劑沉淀法更適用于MLX-NS的制備。

圖5 三種方法制備MLX-NS的短期穩(wěn)定性(n=3)

3 結(jié) 論

納米混懸劑的制備過(guò)程受多種因素的影響,在穩(wěn)定劑種類(lèi)和濃度相同條件下(0.5 %膽酸鈉和0.5 %吐溫20),采用介質(zhì)研磨法、反溶劑沉淀法以及pH沉淀法制備MLX-NS,并對(duì)三種方法制備的MLX-NS進(jìn)行粒度、形貌、XRD、DSC、體外釋放及短期穩(wěn)定性的評(píng)價(jià),考察不同制備方法對(duì)MLX-NS性質(zhì)的影響。結(jié)果顯示三種方法均能制備出d50為300～600 nm的MLX-NS;XRD和DSC譜圖顯示介質(zhì)研磨法和pH沉淀法制備的MLX-NS晶型未發(fā)生變化,而反溶劑沉淀法制備的MLX-NS晶型發(fā)生改變。體外釋放度結(jié)果顯示MLX-NS較原料藥可顯著提高體外釋放速率,且釋放速率與粒度及晶型有關(guān);常溫放置14 d,介質(zhì)研磨法和反溶劑沉淀法制備的MLX-NS能保持粒度穩(wěn)定,而pH沉淀法制備的MLX-NS粒度發(fā)生顯著增大。研究結(jié)果表明,介質(zhì)研磨法較其他兩種方法更適用于MLX-NS的制備,可保持晶型一致和放置穩(wěn)定性,為MLX納米混懸劑的研究開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。