楊美麗，張少杰，楊金蕊，王 楠，潘炫屹，付萍萍，徐 彬

（1. 河北省保定市食品藥品檢驗(yàn)所，河北 保定 071000； 2. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000）

藥品評價(jià)研究工作通過標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)、探索性研究、相關(guān)數(shù)據(jù)分析等手段對藥品的質(zhì)量進(jìn)行全面分析與評價(jià)，給出正確結(jié)論［1］，旨在促進(jìn)藥品質(zhì)量的提升，保障人民用藥安全。近年來，隨著社會(huì)壓力的不斷加大，失眠的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。養(yǎng)血安神片由仙鶴草、墨旱蓮、雞血藤、熟地黃、地黃、合歡皮、首烏藤7 味中藥組方，臨床療效好，價(jià)格低廉，市場占有率很高。其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第六冊）》，僅有性狀和檢查項(xiàng)，真?zhèn)蝺?yōu)劣不易評判，標(biāo)準(zhǔn)可控性差。為考察該藥的整體質(zhì)量，確保人民用藥安全、有效，為行政監(jiān)管提供技術(shù)支持，課題組對其開展質(zhì)量評價(jià)工作，且收集了執(zhí)行該部頒標(biāo)準(zhǔn)的10 家生產(chǎn)企業(yè)的共16 批樣品，基于“點(diǎn)-線-面”的全方質(zhì)量評價(jià)模式［2］開展質(zhì)量評價(jià)工作，在法定檢驗(yàn)基礎(chǔ)上開展了薄層色譜鑒別［3-5］、含量測定［6-8］、指紋圖譜鑒定［9-16］、顯微檢查［17］等探索性研究，進(jìn)行了樣品測定及質(zhì)量分析評價(jià)，以期能促進(jìn)藥品質(zhì)量的提升?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DIONEX Ultimate 3000 型液相色譜儀（賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司），配有二極管陣列檢測器；Agilent 1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技＜中國＞有限公司），配有紫外檢測器；Sartorius CPA 225D 型電子天平（德國賽多利斯集團(tuán)，精度為萬分之一/十萬分之一）；SK7200H 型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司，功率為350 W，頻率為53 kHz）；Olympus BX50 型顯微鏡（奧林巴斯＜中國＞有限公司）。

1.2 試藥

2，3，5，4′ - 四羥基二苯乙烯- 2 -O-β-D- 葡萄糖苷對照品（簡稱二苯乙烯苷，批號為110844 -202116，含量為94.8%），沒食子酸對照品（批號為110831-201906，含量為91.5%），原兒茶酸對照品（批號為110809 - 201906，含量為97.7%），綠原酸對照品（批號為110753-202119，含量為96.3%），旱蓮苷A 對照品（批號為111886-201804），大黃素對照品（批號為110756 - 201913，含量為96.0%），大黃素甲醚對照品（批號為110758-201817，含量為99.2%），熟地黃對照藥材（批號為121196-202007），墨旱蓮對照藥材（批號為120958-201708），首烏藤對照藥材（批號為120939-201908），均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲酸、甲醇均為分析純，水為娃哈哈飲用純凈水；仙鶴草、墨旱蓮、雞血藤、熟地黃、地黃、合歡皮、首烏藤飲片（市售），經(jīng)河北省保定市食品藥品檢驗(yàn)所楊美麗高級工程師鑒定均為正品；養(yǎng)血安神片（共16批，編號為1-16，購于河北省內(nèi)6個(gè)市縣，涉及10家生產(chǎn)企業(yè)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別［3-5］

溶液制備：取樣品10 片，除去包衣，研細(xì)，加水30 mL，加熱煮沸10 min，放冷，離心，取上清液，加乙酸乙酯并振搖提取2 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取熟地黃對照藥材2 g、墨旱蓮對照藥材2 g、首烏藤對照藥材1.5 g，分別加水40 mL，煎煮30 min，放冷，離心，取上清液，加乙酸乙酯并振搖提取2 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為對照藥材溶液。取旱蓮苷A 對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液Ⅰ。取大黃素對照品、大黃素甲醚對照品，加甲醇制成每1 mL 各含0.2 mg 的溶液，作為對照品溶液Ⅱ和對照品溶液Ⅲ。按處方工藝分別制備缺熟地黃、墨旱蓮、首烏藤的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

熟地黃：吸取供試品溶液5～15 μL，熟地黃對照藥材溶液、缺熟地黃的陰性對照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）- 乙酸乙酯（1∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液，置日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 A。

1，1′. 對照藥材溶液 2 - 9. 供試品溶液 10. 陰性對照品溶液（分別缺熟地黃、墨旱蓮、首烏藤） 11，11′. 對照品溶液A. 熟地黃（日光） B. 墨旱蓮 C. 首烏藤（365 nm）圖1 薄層色譜圖1，1′.Reference medicinal material solution 2-9.Test solution 10.Negative reference solution（（lacking Rehmanniae Radix Praeparata，Ecliptae Herbs，and Polygoni Multiflori Caulis，respectively） 11，11′.Reference solutionA.Rehmanniae Radix Praeparata（sunlight） B.Ecliptae Herbs C.Polygoni Multiflori Caulis（365 nm）Fig.1 TLC chromatograms

墨旱蓮：吸取供試品溶液、墨旱蓮對照藥材溶液、對照品溶液Ⅰ、缺墨旱蓮的陰性對照品溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 水（30∶40∶15∶3，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 B。

首烏藤：吸取供試品溶液5～10 μL，首烏藤對照藥材溶液、缺首烏藤的陰性對照品溶液、對照品溶液Ⅱ、對照品溶液Ⅲ各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以正己烷- 乙酸乙酯- 甲酸（12∶3∶0.1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同的黃色熒光斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1 C。

2.2 含量測定［6-8］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido CAPCELL PAK C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈- 水溶液（17∶83，V/V）；流速：10 mL/min；檢測波長：320 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取二苯乙烯苷對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的溶液，即得對照品溶液。取樣品20 片，除去糖衣，研細(xì)，取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ蕿?50 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，加80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方工藝制備不含首烏藤的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下供試品溶液、對照品溶液、陰性對照品溶液及空白溶劑（80%甲醇）各適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖2。

1.2，3，5，4′ - 四羥基二苯乙烯- 2 - O - β - D葡萄糖苷A. 空白溶劑 B. 陰性對照品溶液 C. 對照品溶液 D. 供試品溶液圖2 高效液相色譜圖1.2，3，5，4′-tetrahydroxy stilbene - 2 - O - β - D - glucosideA.Blank solvent B.Negative reference solution C.Reference solution D.Test solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取二苯乙烯苷對照品0.010 50 g，精密稱定，加80%甲醇溶解并定容，作為對照品貯備液；精密量取對照品貯備液1，1，2 mL，分別置25，10，10 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶解并定容，作為對照品溶液A，B，C；分別精密吸取對照品貯備液3，5，10 μL及對照品溶液A，B，C 各10 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 3 411X- 11.98，r=0.999 0（n=6）。結(jié)果表明，二苯乙烯苷進(jìn)樣量在0.039 3～0.982 8 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限確定：取2.2.2項(xiàng)下對照品溶液適量，加80%甲醇逐級稀釋，分別以信噪比（S/N）為10和3的進(jìn)樣量為定量限和檢測限。結(jié)果定量限為0.001 3 μg，檢測限為0.000 4 μg。

精密度試驗(yàn)：精密吸取線性關(guān)系考察對照品貯備液5 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果二苯乙烯苷峰面積的RSD為0.41%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品適量，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，20，24 h 時(shí)按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為1.02%（n= 6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品適量，精密稱定，共7 份，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果二苯乙烯苷含量的RSD為1.29%（n=7），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（0.351 4 mg/g）0.5 g，精密稱定，共6 份，精密加入對照品溶液（取二苯乙烯苷0.010 77 g，精密稱定，置200 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶解并定容，搖勻）5 mL，依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取16 批（編號為1-16）樣品，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果樣品中二苯乙烯苷含量為每片0.06～0.57 mg，提示樣品間一致性較差；僅9批樣品含量測定結(jié)果相對集中，為每片0.10～0.20 mg；有4批樣品含量測定結(jié)果偏低（每片低于0.10 mg），提示首烏藤的質(zhì)量較差，或存在投料不足的嫌疑。詳見表2。

表2 樣品中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷含量測定結(jié)果（mg/片）Tab.2 Results of the content determination of 2，3，5，4′-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside in samples（mg/tablet）

2.3 指紋圖譜鑒定［9-16］

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido CAPCELL PAK C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min 時(shí)2%A，10～33 min 時(shí)2%A →19%A，33～50 min 時(shí)19%A →26%A，50～60 min 時(shí)26%A →40%A，60～65 min時(shí)40%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm（0～28 min），320 nm（28～52 min），280 nm（52～75 min）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 溶液制備

取二苯乙烯苷、沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸對照品各適量，精密稱定，加80%甲醇溶解，制成每1 mL 含0.1 mg 的單一對照品溶液及混合對照品溶液。按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按處方工藝取各單一藥材適量（相當(dāng)于成藥4片的量），按處方工藝分別制備單一樣品，按供試品溶液制備方法制備單一藥材溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取2.3.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄色譜圖。以9 號峰（二苯乙烯苷峰）為參照峰，結(jié)果色譜圖中1-16號峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均低于5.00%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.3.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于0，2.5，5.0，7.5，10.0，15.0，20.0，24.0 h 時(shí)按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以9號峰（二苯乙烯苷峰）為參照峰，結(jié)果色譜圖中1-16 號峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均低于5.00%（n= 8），表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品6 份，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以9 號峰（二苯乙烯苷峰）為參照峰，結(jié)果色譜圖中1-16 號峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均低于5.00%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 共有峰及主要色譜峰指認(rèn)

取16 批（編號為1 - 16）樣品，依法制備供試品溶液，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖3A。依據(jù)測定結(jié)果，確定13 個(gè)共有峰（8 號峰、10 號峰、12 號峰除外）作為特征峰。

2. 沒食子酸 4. 原兒茶酸 5. 綠原酸 9.2，3，5，4′ - 四羥基二苯乙烯- 2 - O - β - D - 葡萄糖苷A. 供試品溶液 B. 混合對照品溶液圖3 高效液相色譜圖2.Gallic acid 4.Protocatechuic acid 5.Chlorogenic acid 9.2，3，5，4′-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucosideA.Test solution B.Mixed reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

分別取2.3.2項(xiàng)下單一對照品溶液各適量，并進(jìn)樣測定，比較色譜峰的保留時(shí)間及紫外光譜結(jié)果，確定2號峰、4號峰、5號峰、9號峰分別為沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸、二苯乙烯苷。色譜圖見圖3 B。結(jié)合單一藥材溶液在相同條件下的測定圖譜及色譜峰的紫外吸收光譜，確認(rèn)1-3號峰為地黃及熟地黃的特征峰，9號峰為首烏藤的特征峰，13號峰、14號峰主要來源于仙鶴草，4-8號峰為多藥味（首烏藤、雞血藤、墨旱蓮等）的共有成分。

2.3.5 指紋圖譜測定及相似度評價(jià)

對16 批樣品進(jìn)行指紋圖譜測定，以9 號峰為參照峰，各峰相對保留時(shí)間的RSD均低于5.00%。采用國家藥典委員會(huì)主持開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件2012A版生成標(biāo)準(zhǔn)譜圖，分別對樣品與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行多點(diǎn)校正、Mark峰匹配，并計(jì)算相似度。結(jié)果見表3。

表3 樣品相似度計(jì)算結(jié)果Tab.3 Similarity of samples

2.3.6 聚類分析

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中系統(tǒng)聚類法的Ward法，選取平方Euclidean 距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，對所測樣品與標(biāo)準(zhǔn)譜圖的相似度進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果按相似度大小將樣品分為五小類。相似度在0.90以上及以下的分別聚為兩大類，組間距離最大；2批（編號為6，14）樣品的相似度低于0.80，單獨(dú)聚為一小類，離群明顯。詳見圖4。

圖4 16批樣品聚類分析結(jié)果Fig.4 Results of the cluster analysis of 16 batches of samples

2.4 顯微檢查異性有機(jī)物

藥材被粉碎后的組織細(xì)胞特征或內(nèi)含物依然保留，這是中成藥顯微鑒定的基礎(chǔ)［17］。采用顯微檢查法篩查制劑中的異性有機(jī)物，考察是否存在投料不足、不按工藝生產(chǎn)、非法投料等問題。顯微檢查結(jié)果如下：1）養(yǎng)血安神片為半浸膏制劑，部分首烏藤以原粉入藥，顯微鏡下應(yīng)僅可見首烏藤的組織特征，若其他藥味的專屬組織特征有一定鏡檢率，則提示生產(chǎn)工藝存在問題。16 批樣品均能檢出首烏藤顯微特征，提示無企業(yè)為省去首烏藤粉碎工序而將所有藥味一起提取制劑。2）1 批樣品地黃或熟地黃薄壁組織特征及仙鶴草非腺毛組織特征鏡檢率較高，1 批樣品仙鶴草非腺毛組織特征鏡檢率較高，提示有地黃、熟地黃及仙鶴草原粉入藥。3）2 批樣品淀粉粒甚多，且粉末顏色偏淺，提示提取出膏量可能偏少，添加了較多輔料才能按標(biāo)準(zhǔn)每片芯0.25 g 進(jìn)行壓片，存在投料不足或工藝不合理等嫌疑。指紋圖譜顯示，上述2 批樣品多種成分含量較低，與該項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果具有相關(guān)性。可見，16 批樣品中有4 批樣品的顯微特征提示生產(chǎn)工藝存在問題，應(yīng)引起重視。

2.5 安全性考察

參考原國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件2009024，2012004，2013002，篩查樣品中是否添加艾司唑侖、阿普唑侖、三唑侖、勞拉西泮、硝西泮、地西泮、苯巴比妥、異戊巴比妥、延胡索乙素（羅通定）、青藤堿及氯苯那敏11種化學(xué)成分。結(jié)果16批樣品中均未檢出相應(yīng)成分，不存在非法添加的情況。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別

由圖1 可知，薄層色譜圖中斑點(diǎn)雖均有檢出，但不同廠家斑點(diǎn)強(qiáng)弱不同，5 批樣品增大點(diǎn)樣量也僅是略顯，提示單藥味質(zhì)量差異較大，存在以次充好投料、少投料、不按工藝生產(chǎn)等嫌疑。

仙鶴草為薔薇科植物龍芽草的干燥地上部分，主要含有黃酮、三萜、異香豆素、有機(jī)酸類成分［13］。其相關(guān)研究多以黃酮類成分為主，但黃酮類成分并非仙鶴草的專屬性成分，含量較低，且產(chǎn)地、采收加工等因素對藥材的含量影響較大，不利于質(zhì)量控制［18-19］。方中，仙鶴草經(jīng)水煮濃縮入藥，在嘗試對仙鶴草進(jìn)行薄層色譜鑒別時(shí)，采用水提醇沉及70%乙醇直接超聲提取2種方法，再用乙醚萃取除雜，正丁醇萃取濃縮的方式凈化樣品，分別采用硅膠G 薄層板，聚酰胺薄膜經(jīng)多種展開系統(tǒng)展開，但仙鶴草對照藥材斑點(diǎn)較多，陰性干擾嚴(yán)重，經(jīng)多次調(diào)整仍不理想，故未能建立仙鶴草的專屬薄層鑒別方法。雞血藤亦因陰性干擾未制訂適宜的方法。

3.2 含量測定

在方法的建立過程中發(fā)現(xiàn)，樣品中二苯乙烯苷的含量顯著高于其他組分的特征成分，由于指紋圖譜中大部分樣品色譜圖中沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸的色譜峰峰高及峰面積均較小，相對二苯乙烯苷峰含量低很多，為保證方法的準(zhǔn)確性，尤其是低濃度成分的準(zhǔn)確性，指紋圖譜測定時(shí)未進(jìn)行多成分的含量測定，僅以流動(dòng)相乙腈- 水溶液測定二苯乙烯苷，該體系下檢出干擾成分少，分析時(shí)間短，專屬性更強(qiáng)，且方法學(xué)考察符合要求。經(jīng)測定，16 批樣品每片含二苯乙烯苷0.06～0.57 mg，相差近10倍，4批含量低于每片0.10 mg，初步推測部分企業(yè)可能存在首烏藤飲片質(zhì)量較差或投料不足的嫌疑，提示應(yīng)制訂相關(guān)限度。

3.3 指紋圖譜

參考2020 年版《中國藥典（一部）》，地黃、合歡皮、墨旱蓮等藥材均采用低波長測定相關(guān)成分含量，但養(yǎng)血安神片在低波長處的色譜圖基線漂移嚴(yán)重。采用二極管陣列檢測器進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)低波長附近成分異常復(fù)雜，無法理想分離，且含量低的成分采集效果很差。3D 光譜圖顯示，280 nm 及320 nm 波長附近均有較理想的紫外吸收峰，為使指紋圖譜中呈現(xiàn)較多色譜信息且響應(yīng)值適宜，最終采用280 nm →320 nm →280 nm的切換波長法測定。

相似度測定結(jié)果顯示，1）16 批樣品的相似度為0.771～0.985，發(fā)現(xiàn)部分企業(yè)的樣品離散較遠(yuǎn)。通過色譜圖對比，發(fā)現(xiàn)這些企業(yè)的樣品的色譜圖差異性較大，如編號為6 和14 樣品的相似度均低于0.80，聚類分析也將其聚為一類。指紋圖譜顯示，18～50 min 范圍內(nèi)色譜峰個(gè)數(shù)和峰面積與標(biāo)準(zhǔn)譜圖均有較大差異，尤其是9 號峰及13 號峰，表明樣品的化學(xué)成分差異較大。峰面積小或缺失，提示存在多藥味少投或用不合格品替代投料等嫌疑，質(zhì)量較差。2）相似度在0.80～0.90之間的樣品，查看色譜圖發(fā)現(xiàn)，9 號峰和13 號峰對相似度的貢獻(xiàn)較大，其次為1-3 號峰，該區(qū)間的樣品地黃、熟地黃特征峰與首烏藤特征峰的大小呈現(xiàn)不規(guī)律變化，任何藥味特征峰明顯低于標(biāo)準(zhǔn)譜圖均能降低相似度，提示地黃、熟地黃或首烏藤可能存在少投或用不合格品替代投料等嫌疑，質(zhì)量一般。3）相似度高于0.90 的樣品，質(zhì)量較好。4）供試品溶液的顏色與色譜圖也具有一定相關(guān)性。顏色淺，色譜圖中1-3 號峰的峰面積均較小，指紋圖譜相似度低，提示地黃及熟地黃存在不按規(guī)定投料的嫌疑。研究中，按處方工藝自制1 份樣品平行測定進(jìn)行驗(yàn)證，溶液顏色較深，指紋圖譜與參照圖譜相似度為0.966，與樣品預(yù)期測定結(jié)果基本一致。本研究中的樣品依據(jù)現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均為合格樣品，但指紋圖譜體現(xiàn)的差異性表明所建立的指紋圖譜更能反映樣品的真實(shí)性，為其質(zhì)量控制提供了更有效的技術(shù)方法。

3.4 顯微鑒別

顯微鑒別結(jié)果顯示，16 批樣品中，有4 批樣品存在不按工藝生產(chǎn)、飲片未經(jīng)提取而直接以原粉入藥等嫌疑。鑒別用供試品溶液制備時(shí)，先經(jīng)水煮10 min，16 批樣品水煮后有2 批呈黏稠狀，與其他樣品區(qū)別明顯，推測淀粉類輔料添加量較多，這與植物組織顯微篩查中同批樣品顯微鏡下淀粉粒多證據(jù)指向相同。指紋圖譜顯示，上述2 批樣品各成分含量相對較低。樣品性狀按標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)為除去糖衣后顯黑棕色，但顏色明顯較淺，與標(biāo)準(zhǔn)有一定差異。輔料添加量大，提示工藝中濃縮得到的稠膏量少，存在不按規(guī)定投料、以次充好投料、不按工藝生產(chǎn)等多種嫌疑。

方中首烏藤部分以原粉入藥，顯微鏡下草酸鈣簇晶特征明顯，但方中仙鶴草也含有較多草酸鈣簇晶且大小與首烏藤有交叉。若企業(yè)不按工藝提取而直接用仙鶴草原粉入藥，專屬性鑒別不理想，易造成誤判，故未制訂顯微鑒別項(xiàng)。

3.5 方法評價(jià)

本研究中建立的方法準(zhǔn)確、可靠，可用于養(yǎng)血安神片的質(zhì)量控制及評價(jià)，為其規(guī)范生產(chǎn)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供了有效的技術(shù)方法與支持。