景宏麗，孔玉方，袁向芬，張旻，王娜，陳冬杰，吳紹強

（中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

在已知的脊椎動物種群中，魚類約占48%，魚類細胞作為脊椎動物組織和細胞模型應(yīng)用于多個生物學科，是一個巨大資源[1]。魚類細胞系作為實驗材料，比活魚實驗具有便捷、經(jīng)濟、易操作和重復(fù)性好等優(yōu)點。對比人和哺乳動物離體培養(yǎng)的細胞株，魚類細胞株平均傳代100 代仍可繼續(xù)分裂，且來源于成魚的細胞系仍具有分裂能力。本文歸納整理了近年新建魚類細胞系的數(shù)據(jù)，綜述了魚類細胞系組織來源、培養(yǎng)方法及應(yīng)用現(xiàn)狀，以期為魚類細胞系研究提供最新的參考數(shù)據(jù)。

1 國內(nèi)外魚類細胞系構(gòu)建情況

自1962 年Wolf 和Quimby 建立了第一個魚類細胞系—虹鱒（Oncorhynchus mykiss）性腺細胞系（RTG-2）[2]以來，魚類細胞系應(yīng)用已有60 年的歷史。截至目前，至少建立和應(yīng)用了826 株細胞系[3]。這些細胞系分別來源于約74 科186 種魚類的不同組織，其中鯉科的魚類種類最多，約27 種，但是來源于虹鱒的細胞系數(shù)量最多，約為73 株。淡水魚類和溯河洄游性魚類約525 株，分別來源于42 科的105 種魚類的不同組織；而海水魚類及咸水魚類的細胞系約為301 株，分別來源于約32 科的81 種海水魚類的不同組織。該數(shù)據(jù)與張博等[4]報道魚類隸屬科的數(shù)量有所減少，但是，魚類種類和數(shù)目都增加。特別是來源于海水魚類種類和數(shù)目明顯增加。目前魚類細胞培養(yǎng)已實現(xiàn)從淡水魚類擴展到海水魚類，相信未來會擴展到其他水生動物，會建立更多種類細胞系，形成豐富細胞系資源庫。

我國學者新建的部分細胞系并未統(tǒng)計在內(nèi)。據(jù)統(tǒng)計，截至2010 年上半年，我國已經(jīng)建立的魚類細胞系約70 株[4]。筆者進一步統(tǒng)計，在2011—2021 年間中國學者公開發(fā)表的新建且能穩(wěn)定傳代的魚類細胞系約94 株，分別來源于53 種魚類不同組織（表1）。在2011—2021 年新建立細胞系報道中，至少80%由亞洲學者報道，這與Lakra 等[1]結(jié)果類似。這些亞洲學者中中國學者居多，其次是印度。中國學者已然成為全世界新建細胞系研究領(lǐng)域主要貢獻者。

2 細胞系的組織來源

細胞系建立是一個漫長復(fù)雜的過程，會因為取組織時出現(xiàn)污染而造成試驗失敗，因此建立細胞系通常選擇比較容易獲得的正常魚類組織。目前已經(jīng)報道的組織或器官有肝臟、腎臟、腦、鰭條、皮膚和性腺等。在2011—2021 年間，本文統(tǒng)計的94 株的國內(nèi)魚類細胞系中，來自鰭條組織細胞系有26 株，占新建細胞系27.66%；來自腦組織細胞系14 株，占新建細胞系14.89%；來自腎組織細胞系14 株，占新建細胞系14.89%；來自性腺組織細胞系10 株，占新建細胞系9.4%。由此可見，鰭條是建立細胞系最常選擇的組織之一，這是由于取鰭條組織不用殺死成魚，且鰭條組織的再生能力很強，離體培養(yǎng)細胞增殖活性強[5]。

為了能夠更好發(fā)揮魚類細胞系作用，魚類組織來源除了選取常見組織，還會根據(jù)需求選取特殊組織構(gòu)建細胞系。如關(guān)檸楠等[67]建立團頭魴骨組織細胞系；魏鈺娟等[68]建立異育銀鯽脊髓組織細胞系。

國內(nèi)外魚類細胞建系建立雖然已經(jīng)取得了很大進步，但并不是所有的魚類組織都能夠構(gòu)建穩(wěn)定可傳代的細胞系，如付思思等[6]在錦鯉組織細胞體外培養(yǎng)的初步研究中，鰭條細胞系已傳至第39 代，但心臟和肌肉細胞系分別停留在第2 代和第4代。建議應(yīng)根據(jù)實際需要和組織特性合理選擇用于細胞培養(yǎng)的組織來源，否則不能獲得預(yù)期的細胞系。

3 魚類細胞系原代培養(yǎng)方法

魚類細胞培養(yǎng)分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩個階段。原代培養(yǎng)是細胞培養(yǎng)的起始而最關(guān)鍵的階段。細胞原代培養(yǎng)方法有多種，如組織塊法、機械分離法、絡(luò)合劑分散法、酶消化法、懸浮細胞培養(yǎng)法和微載體細胞培養(yǎng)法等[5]。近年數(shù)據(jù)顯示，酶消化法和組織塊法使用頻率最多。目前采用酶消化法建立的魚類細胞系已有較多報道，如Liu 等[25]建立了石斑魚的腦細胞系；Xu 等[26]建立了鯽的腦細胞系；Jing等[37,59]建立了金魚吻端、腎臟和心臟細胞系；張瑩瑩等[38]建立了金錢魚的腎細胞系；周佳楠等[66]建立了金錢魚鰓細胞系。采用組織塊法成功建立的細胞系有錦鯉的鰭條細胞系[6]、斑石鯛的肌肉、腦和肝細胞系[27,28]、大菱鲆的腦和心臟細胞系[29,60]等。

雖然以上兩種細胞原代培養(yǎng)方法均得到了廣泛應(yīng)用，但研究數(shù)據(jù)顯示，相同組織細胞系使用原代培養(yǎng)方法并不是單一固定在酶消化法或組織塊法上，即不具有專一性。如建立皮膚細胞系研究中，來源于中華鱘、牙鲆、石斑魚的皮膚細胞系使用了組織塊法[5,56,57]，而中華鳑鲏的皮膚細胞系使用了酶消化法[58]；在腦細胞系研究中，來源斑石鯛、鱖和大菱鲆的腦細胞系使用組織塊法[28-30]，來源金魚、鯽、卵形鯧鲹和錦鯉的腦細胞系使用酶消化法[26,31,32]；在性腺細胞系研究中也有類似報道[48-50]。除了以上兩種原代培養(yǎng)方法，在建立魚類的胚胎細胞系研究中使用了機械分離法[65]。盡管現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)技術(shù)較為成熟，且獲得了重要成果，但還有相當多的魚類組織器官的細胞培養(yǎng)至今尚未成功。這就需要不斷開發(fā)新的原代細胞培養(yǎng)技術(shù)來解決這一難題。

4 培養(yǎng)基和添加劑的選擇

要建立魚類細胞系，從組織到細胞延伸是決定細胞系能否建成的關(guān)鍵步驟之一，整個過程中主要營養(yǎng)來源就是培養(yǎng)基。因此選擇合適培養(yǎng)基至關(guān)重要。培養(yǎng)基組成包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、抗生素和促細胞生長因子等。細胞系不同時期需要成分有所不同，但是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清是必備成分。

目前常見的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括Dulbeccos Modified Eagle Medium（DMEM）、Medium 199（M199）、Leibovitz-15（L-15）、Dulbecco's Modified Eagle Medium:Ham's F-12（DMEM:F12）和Minimum Essential Medium（MEM）。每種培養(yǎng)基適用細胞系不同，如DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分高于MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其根據(jù)糖的含量又分為高糖DMEM 和低糖DMEM，適合培養(yǎng)增殖活躍的細胞[5]；M199 所含營養(yǎng)成分達60 多種，在淡水魚細胞培養(yǎng)中比較常見[37,59]；L-15 培養(yǎng)基采用半乳糖作為糖源，且豐富了氨基酸組成成分，在細胞培養(yǎng)過程中不用添加CO2，海水魚類細胞系的培養(yǎng)使用較多[25]。DMEM/F12是Ham’s F12 與DMEM 以1∶1 的比例混合培養(yǎng)基，適用于培養(yǎng)增殖活力較弱的細胞[28]；MEM 培養(yǎng)基含有多種必需氨基酸和維生素，適用于培養(yǎng)要求不太高魚類的細胞[45,51]。這些商品化培養(yǎng)基產(chǎn)品多數(shù)是由國外廠家授權(quán)后國內(nèi)生產(chǎn)商生產(chǎn)的，但是未見有國內(nèi)學者自主研發(fā)商品化培養(yǎng)基報道，希望未來能對此做些研究，生產(chǎn)我國自有品牌的培養(yǎng)基，提高我國在細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品市場上的競爭力。

在建立細胞系之初，選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般是根據(jù)來源組織確定培養(yǎng)基。但近年來研究顯示，來源于同一種族同一組織的細胞系使用的培養(yǎng)基有所不同。王藝舟等[5]建立青魚鰭條組織細胞系使用的是DMEM 培養(yǎng)基，張雪萍等[7]則使用的是L-15。來自不同種族同一組織的細胞系則可以使用相同的培養(yǎng)基。如來源于金魚和鯽魚的腦組織建立細胞系都可以使用M199 培養(yǎng)基[26]。當然，也有報道顯示，來源不同種類同一組織細胞系使用不同的培養(yǎng)基[8,17,39]。同一個細胞系也可以在多種培養(yǎng)基中生長。李苗苗等[40]建立鰻鱺腎臟細胞系時，發(fā)現(xiàn)DMEM/F12 和L15 培養(yǎng)液均適合其正常生長和增殖,而在MEM 培養(yǎng)液中無法正常生長。以上說明，在建立原代細胞系時，培養(yǎng)基的選擇不具有一定的規(guī)律性。因此，在建立細胞系初期，可以多選擇幾種培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng)。在細胞系建立后，培養(yǎng)基必須優(yōu)化，通過優(yōu)化培養(yǎng)基選擇出適合培養(yǎng)該細胞系的培養(yǎng)基。

血清是細胞培養(yǎng)最重要的一種營養(yǎng)添加物。魚類細胞系最常用血清是胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）。縱觀近年來細胞培養(yǎng)中胎牛血清添加量來看，僅傅永明等[18]在建立二倍體紅鯽、三倍體湘云鯽和異源四倍體鯽鯉尾鰭細胞系時，使用的血清濃度為30%，通常使用的濃度范圍在10%～20%。這主要是因為血清濃度過高，對細胞產(chǎn)生毒性，不利于細胞系生長。隨著細胞代數(shù)增加，細胞系狀態(tài)變?yōu)榉€(wěn)定時，血清的濃度會降至10%左右[45]。為了細胞更好的貼壁生長，在魚類細胞系培養(yǎng)時除了加FBS 外，還添加一定濃度的魚血清和胚胎提取液[5]。

除了血清，另一種重要的添加物是生長因子。目前常用生長因子包括表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、血小板和胰島素生長因子（insulin-like growth factor-I，IGF-I）等。Sun 等[48]通過添加bFGF、EGF 和IGF-I 促進來源半滑舌鰨的性腺細胞生長。鄭媛等[45]在來源半滑舌鰨的細胞培養(yǎng)過程中添加了bFGF。單莉娟[41]在松江鱸細胞培養(yǎng)過程中添加bFGF 和EGF。

在魚類細胞培養(yǎng)過程中還會經(jīng)常加入其它輔助成分，如Sun 等[48]加入了β-琉基乙醇，可以直接刺激細胞分裂增殖并保護細胞免受氧化損傷；齊文闖等[49]加入的白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）有利于維持細胞未分化狀態(tài)。

以上培養(yǎng)基和添加劑在魚類組織啟動原代培養(yǎng)時承啟著重要的作用，但是在傳代培養(yǎng)中也易出現(xiàn)細胞增長過快產(chǎn)生細胞死亡。建議在細胞系進行傳代培養(yǎng)中要及時調(diào)整培養(yǎng)基和添加劑劑量。當然，考慮培養(yǎng)基和添加劑成分越簡單，越有利于后期細胞系的推廣應(yīng)用，魚類細胞系在后期傳代過程動物源、無蛋白和化學成分限定培養(yǎng)基）培養(yǎng)細胞系。這是漫長而復(fù)雜過程，一旦成功，將開啟魚類細胞系發(fā)展史上新紀元。

5 細胞系的應(yīng)用

隨著魚類細胞系發(fā)展，其被廣泛應(yīng)用于病毒學、免疫學、內(nèi)分泌學、腫瘤學、細胞工程等研究領(lǐng)域。近年報道顯示，新建的魚類細胞系主要應(yīng)用在魚類病毒學研究。這也是魚類細胞系建立的初衷。

自Wolf 首次利用魚類細胞系成功地從鱒性腺細胞系中分離出第一株魚類病毒傳染性胰臟壞死病毒后[2]，緊接著越來越多的魚類病毒從魚類細胞中成功地分離和鑒定，這為魚類疾病的研究奠定了基礎(chǔ)。鰭條組織細胞系可用于新加坡石斑魚虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）的研究[19]。腦組織細胞系可用于鯉皰疹病毒二型（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）的研究[26]；脾臟組織細胞系可用于石斑魚虹彩病毒（grouper iridovirus,GIV）和鱖傳染性脾腎壞死病毒（infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV）的增殖研究[62]。目前使用細胞系鑒定的病毒有至少有30 種，包括呼腸孤病毒科、雙RNA 病毒科、正黏病毒科、副黏病毒科、杯狀病毒科、皰疫病毒科、小RNA 病毒科和虹彩病毒科等[20]。

似乎魚類細胞系僅能用于魚類病毒的研究，其實魚類細胞系還可以用于來自兩棲動物蛙病毒屬病毒的研究[69]。當然，魚類細胞系是否能用于感染其他水生動物病毒的研究還有待進一步研究。

細胞系除了可以分離病毒外，還可以通過細胞培養(yǎng)研究魚類病毒致病機制，可以從源頭上了解病毒的感染過程，解決水生動物疫病預(yù)防中“卡脖子”問題，促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

6 存在問題和建議

目前，雖然魚類細胞培養(yǎng)已經(jīng)取得了許多成果，但是仍然存在許多尚未解決的問題，值得深入研究。

（1）傳代穩(wěn)定性問題。正常細胞的分裂次數(shù)有限，這是遺傳因素所決定，不易改變。因此，從正常組織獲得的細胞系經(jīng)過一定次數(shù)的分裂后，就會細胞衰老，要防止過度傳代。此外也要注意細胞系傳代過程中細胞突變現(xiàn)象，即細胞在培養(yǎng)初期鑒定過的形態(tài)、功能等，隨著代數(shù)增加表現(xiàn)出現(xiàn)不再一致的現(xiàn)象。

（2）缺乏針對新發(fā)病毒病病原敏感細胞系的問題。魚類細胞系在研究病毒中有許多優(yōu)點，但是，單個魚類細胞系并不適用于所有病毒增殖。如金魚腎臟細胞系對CyHV-2 不敏感，不能用于CyHV-2 增殖[37]。鱸的鰭條細胞系不能用來增殖病毒性神經(jīng)壞死病毒（viral nervous necrosis virus，VNNV）[70]。魚類病毒的易感性具有物種特異性，而來自同種魚的不同組織的細胞系對病毒敏感性也具有特異性。因此，為了適應(yīng)日益增長的病毒種類，需要建立豐富的魚類細胞系資源庫。

（3）國內(nèi)缺少魚類細胞系數(shù)據(jù)庫：國內(nèi)細胞系報道很多，但多數(shù)研究沒有跟進，即這些研究的可靠性尚未有足夠的證實。建立一種細胞數(shù)據(jù)庫，通過細胞系數(shù)據(jù)庫及時更新細胞系相關(guān)信息，有助于及時了解魚類細胞系的溯源情況和研究進展。

（4）缺少魚類細胞系的國內(nèi)流通機構(gòu)。如在鯉皰疹病毒II 型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2）敏感細胞系研究中，魏鈺娟等[68]在異育銀鯽脊髓組織細胞系的建立中，雖然已有學者建立了異育銀鯽腦組織細胞系[33]和鰭條細胞系[9]，且研究CyHV-2 敏感性,但由于不對外供應(yīng),其限制了對CyHV-2 的研究。錦鯉組織細胞系[10,21]的研究也存在同樣的問題。此外，ATCC 相關(guān)機構(gòu)雖然可以購買一定的細胞系，但是某些客觀原因，細胞系不能及時到達實驗室；且國內(nèi)學者構(gòu)建部分細胞系不在ATCC 等機構(gòu)保藏。因此，應(yīng)建立細胞系的國內(nèi)流通機構(gòu)，保障對魚類相關(guān)疾病的研究，從也避免相關(guān)研究機構(gòu)花費大量人力、物力和資金建系。