莊義娟 ，張歡，關(guān)蕾 ，劉漢忠 ，陳軍芳

［1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生培養(yǎng)基地（孝感市中心醫(yī)院），湖北 孝感 432000；2.武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院（孝感市中心醫(yī)院），湖北 孝感 432000；3.湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000］

結(jié)腸癌是消化道常見惡性腫瘤，據(jù)2020 年全球癌癥發(fā)病率和死亡率的統(tǒng)計(jì)，結(jié)腸癌在全球癌癥發(fā)病率排名第三，死亡率第二。我國結(jié)腸癌發(fā)病率高居第二，每年新發(fā)人數(shù)可達(dá)55 萬，嚴(yán)重危害人類健康，需引起高度警惕［1］。β-鏈蛋白（β-catenin）是WNT 信號通路中的重要作用因子，β-catenin 陽性表達(dá)上升，能夠通過激活WNT 信號通路，導(dǎo)致下游癌細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)，使癌細(xì)胞DNA 的復(fù)制速度明顯增強(qiáng)［2］。雙糖鏈蛋白聚糖（Biglycan）屬于富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖家族，是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Biglycan 在多種腫瘤中表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，更有研究者發(fā)現(xiàn)Biglycan 在結(jié)腸癌中高表達(dá)且與腫瘤不良預(yù)后因素相關(guān)［3-5］，前有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中Biglycan 可經(jīng)Wnt/β-Catenin 信號通路促進(jìn)瘤細(xì)胞的生長［6］。錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair,MMR）系統(tǒng)是一系列修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配的特異性修復(fù)蛋白，MMR 系統(tǒng)功能受損或缺失（dMMR），則喪失本身的校驗(yàn)核對功能，導(dǎo)致DNA 錯(cuò)配堆積，微衛(wèi)星重復(fù)序列拷貝數(shù)目發(fā)生變化，從而產(chǎn)生遺傳不穩(wěn)定性，稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability,MSI）。MSI 可進(jìn)一步分為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）和低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性/微衛(wèi)星穩(wěn)定性（MSI-L/MSS）。MMR基因中任何一個(gè)或幾個(gè)基因突變均可產(chǎn)生MSI 表型［7］。另有研究發(fā)現(xiàn)MSI-H 腫瘤組中出現(xiàn)低或零的β-Catenin 陽性表達(dá)，而MSS 或MSI-L 的腫瘤組顯示出高含量的β-Catenin 陽性表達(dá)，揭示了兩組腫瘤表現(xiàn)出的不同臨床行為表現(xiàn)［8］。綜上，為探尋Biglycan 蛋白與β-catenin 蛋白表達(dá)及其與結(jié)腸癌的關(guān)系，其次探究β-catenin 蛋白是否在MSI-H與MSI-L/MSS 兩組腫瘤中存在不同表達(dá)，選取80例結(jié)腸癌患者作為研究對象，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測癌組織中β-catenin、Biglycan 蛋白，應(yīng)用PCR 方法檢測分析癌組織中MSI 狀態(tài)并分組，分析不同組別間β-catenin 陽性表達(dá)率。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年1 月至2020 年6 月孝感市中心醫(yī)院收治的結(jié)腸癌患者80 例為研究對象，其中男性43 例，女性37 例；年齡22～86 歲，平均（63.55±12.30）歲。TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期30 例，Ⅲ期50 例；腫瘤部位：右半結(jié)腸47 例，左半結(jié)腸33 例；分化程度：高、中分化42 例，低分化38 例；浸潤程度：T1～T2 期23 例，T3～T4 期57例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0）38例，有1～3 枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或見任一癌結(jié)節(jié)（N1）23 例，有4～6 枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N2）6 例，有大于等于7 枚淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N3）13 例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床及病理組織學(xué)確診為原發(fā)性結(jié)腸癌；②入組前未行放療、化療及手術(shù)治療等；③患者及家屬同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他部位腫瘤；②患有嚴(yán)重精神疾??；③心、腎、肝臟等功能嚴(yán)重不足。

1.2 主要儀器和試劑

光學(xué)顯微鏡（型號：BX53，奧林巴斯工業(yè)有限公司）、免疫組織化學(xué)染色試劑盒（貨號：JY-0015，公司：武漢珈源生物醫(yī)學(xué)）、Idylla 全自動(dòng)PCR 腫瘤基因檢測系統(tǒng)（公司：武漢福達(dá)祥康科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備 收集根治術(shù)后結(jié)腸癌標(biāo)本切取癌組織及癌旁組織（距癌組織≥5 cm）經(jīng)10%中性福爾馬林緩沖溶液固定后脫水、浸蠟、包埋、切片等處理后分別制成3～4 μm 厚的石蠟切片用于免疫組織化學(xué)染色、5～10 μm 厚的石蠟切片用于PCR腫瘤MSI 檢測。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測 嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)最終所得切片在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像。染色結(jié)果判定：細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為β-catenin 陽性細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為β-catenin 陰性細(xì)胞；細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為Biglycan 陽性細(xì)胞，按染色強(qiáng)度記錄，染色強(qiáng)度：無色、淡黃、棕黃、棕褐色分別記0、1、2、3 分，0～1 為陰性，2～3為陽性。

1.3.3 微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測 實(shí)驗(yàn)所用PCR-MSI 檢測分析系統(tǒng)可檢測7 個(gè)標(biāo)志物（AVR2A、BTBD7、DIDO1、MRE11、RYR3、SEC31A、SULF2），檢測方法過程嚴(yán)格按照分析系統(tǒng)說明要求完成前期標(biāo)本處理、試劑盒加樣并編號上機(jī)，最終系統(tǒng)顯示每個(gè)標(biāo)志物檢測結(jié)果：檢測到突變的標(biāo)志物得分為0.50～1.00、未檢測到突變的標(biāo)志物得分為小于0.50 及無效（Invalid），可得到的結(jié)果有4 種：MSI-H（≥2 個(gè)標(biāo)志物突變）、MSI-L（＜2 個(gè)標(biāo)志物突變）、MSS（無標(biāo)志物突變）及Invalid（＞2 個(gè)標(biāo)志物結(jié)果無效）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸組織中β-catenin 蛋白及Biglycan 蛋白的表達(dá)

β-catenin 蛋白陰性表達(dá)定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，異常陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，腸癌組織中細(xì)胞陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Biglycan 蛋白陽性表達(dá)定位在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，結(jié)腸癌組織中Biglycan 蛋白陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 結(jié)腸癌組織中Biglycan 蛋白與β-catenin 蛋白表達(dá)

表1 Biglycan 蛋白與β-catenin 蛋白在結(jié)腸癌與癌旁組織中的表達(dá)

2.2 β-catenin 蛋白和Biglycan 蛋白陽性表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)腸癌組織中β-catenin 蛋白陽性表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位、大體類型無明顯相關(guān)性（P均＞0.05），與分化程度、浸潤深度、脈管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期有相關(guān)性（P均＜0.05）；Biglycan 蛋白表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位、大體類型、分化程度及脈管侵犯無明顯相關(guān)性（P均＞0.05），與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期有相關(guān)性（P均＜0.05），見表2。

表2 β-catenin 蛋白與Biglycan 蛋白表達(dá)水平與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.3 β-catenin 和Biglycan 的相關(guān)性

Speraman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中β-catenin 與Biglycan 表達(dá)具有相關(guān)性（r=0.992,P＜0.001），見圖2。

圖2 結(jié)腸癌組織中β-catenin 與Biglycan 的相關(guān)性

2.4 β-catenin 在MSI-H 與MSS/MSI-L 兩組腫瘤中陽性表達(dá)率

在入組的80 例結(jié)腸癌患者中，經(jīng)PCR 方法測定并分類，80 例結(jié)腸癌中MSI-H 組有10 例，β-catenin 陽性表達(dá)率為40.0%，MSI-L/MSS 組有70 例，β-catenin 陽性表達(dá)率為61.4%，兩組結(jié)腸癌中β-catenin 陽性表達(dá)率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.345＞0.05）。見表3 及圖3。

圖3 微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測結(jié)果

表3 結(jié)腸癌MSI-H 組與MSS/MSI-L 組中β-catenin 的表達(dá) ［n(%)］

3 討論

結(jié)腸癌是世界三大癌癥之一，發(fā)病率和死亡率高居前三，每年死于癌癥患者有近千萬，而死于結(jié)直腸癌的患者近10%，結(jié)直腸癌的防治研究工作刻不容緩［1］。結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多階段的復(fù)雜過程。結(jié)腸癌患者早期癥狀不典型，常表現(xiàn)為便秘、大便習(xí)慣改變、腹痛、腹瀉等癥狀，多未引起注意，大多患者就診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，影響患者術(shù)后生活質(zhì)量［9］。時(shí)代變遷，人們健康意識不斷提升和健康宣教的普及，加之內(nèi)窺鏡檢查和影像學(xué)技術(shù)不斷更新提升，很多結(jié)腸病變得以早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，但也為了進(jìn)一步做好結(jié)腸癌的防治工作，造福更多病患，探究有關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中影響因素有助于了解疾病轉(zhuǎn)歸、探尋預(yù)后不良的相關(guān)因素，有助于制定并完善個(gè)體治療方案，對改善患者預(yù)后有一定意義。

雙糖鏈蛋白聚糖（Biglycan,BGN）屬于富含亮氨酸的小蛋白聚糖類家族（SLRPs），參與構(gòu)成細(xì)胞外基，它由兩個(gè)糖胺多糖和一個(gè)核心蛋白組成，核心蛋白分子量為38 kD，含10 個(gè)富亮氨酸的重復(fù)單位，糖胺多糖由硫酸皮質(zhì)素/硫酸軟骨素組成，BGN 長約8 kb，含有內(nèi)含子和8 個(gè)外顯子，位于Xq27-Xq28，最早于骨組織中發(fā)現(xiàn)［10］。

BGN 在腫瘤的生物發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，在胃癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌等多種癌癥中均發(fā)現(xiàn)異常BGN 表達(dá)。有研究證實(shí)BGN在結(jié)腸癌中高表達(dá)，并且與其組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移相關(guān)［11-13］。BGN 表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致多種臨床疾病的發(fā)生，如代謝紊亂、炎癥性疾病、肌肉骨骼缺損和惡性腫瘤等，在癌癥中，BGN 的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，這與臨床預(yù)后不良有關(guān)［14］。新興研究表明，BGN參與多種生物事件，包括細(xì)胞增殖和分化、血管形成、骨折愈合、組織修復(fù)和炎癥［15］。在各種類型的實(shí)體癌患者中，BGN 的上調(diào)與預(yù)后不良相關(guān)，BGN 在實(shí)體瘤中的表達(dá)增加及其與預(yù)后不良的相關(guān)性表明，BGN 可作為多種類型腫瘤的預(yù)后指標(biāo)［16］。

Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)廣泛涉及人類癌癥和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)癌癥模型。大量研究表明，WNT 信號通路的激活是結(jié)腸癌早期的重要標(biāo)志，超過90%的結(jié)腸癌存在WNT 信號通路的異常激活，NF-κB 信號通路的異?；罨谴龠M(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展和治療抵抗的重要因素［17-18］。當(dāng)細(xì)胞的WNT 信號通路信號在無外界刺激時(shí)，穩(wěn)定狀態(tài)下Axin/GSK-3β/APC復(fù)合體可解體β-catenin 蛋白，使其在細(xì)胞質(zhì)中濃度降低且維持在較低水平，當(dāng)細(xì)胞受到外界WNT信號通路信號刺激時(shí)，Axin/GSK-3β/APC 復(fù)合體構(gòu)象發(fā)生改變進(jìn)而最終解體，其解體后對β-catenin蛋白解體作用缺失，使得細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin 蛋白得以穩(wěn)定存在且不斷積聚，進(jìn)而轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)與TCF/LEF 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合激活信號通路，最終啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［19-20］。有研究認(rèn)為β-catenin表達(dá)上升能夠?qū)е陆Y(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力的增強(qiáng)，提高了癌細(xì)胞對于結(jié)腸黏膜基底組織的浸潤程度［21］。還有研究者認(rèn)為β-catenin 的表達(dá)上升能夠顯著促進(jìn)結(jié)腸癌患者的臨床預(yù)后的惡化［22］。

錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（mismatch repair,MMR）是機(jī)體的一種DNA 基因錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制，主要識別DNA復(fù)制過程中的堿基錯(cuò)配，錯(cuò)配修復(fù)基因完整（pMMR）可確保DNA 復(fù)制過程的準(zhǔn)確性，而當(dāng)錯(cuò)配修復(fù)基因缺失（dMMR）時(shí)不能修復(fù)錯(cuò)配的堿基，出現(xiàn)MSI，一系列調(diào)節(jié)生長和增值的基因發(fā)生突變，致使DNA 遺傳不穩(wěn)定而最終發(fā)生腫瘤［23-24］。約15%的結(jié)腸癌顯示有MSI［25］。病理組織學(xué)顯示，MSI 的結(jié)腸癌多見于近端結(jié)腸，癌組織常表現(xiàn)為低分化，癌周伴有淋巴細(xì)胞浸潤，對化療的反應(yīng)與微衛(wèi)星穩(wěn)定的結(jié)腸癌不同［26］。大約75% 的MSI 結(jié)腸癌伴有MLH1 基因高甲基化［27］。MSI 的結(jié)腸癌常見遺傳改變是致癌的BRAF V600E突變，散發(fā)性結(jié)腸癌中BRAF V600E 突變與死亡率增加相關(guān)［28］。結(jié)腸癌中缺乏dMMR/MSI-H 的發(fā)生率約占15%，Ⅳ期dMMR/MSI-H 腫瘤僅占所有轉(zhuǎn)移性轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的2%～4%［29-30］。近期研究表明MSI-H 結(jié)腸癌患者可從免疫治療中獲益，且預(yù)后優(yōu)于MSS/MSI-L 型結(jié)腸癌。有人提出WNT 信號通路的改變可能與MSI 的結(jié)腸癌的癌變有關(guān)［31］。更有學(xué)者指出MSI-H 的結(jié)腸癌由于特征性突變導(dǎo)致MMP-3 表達(dá)受損，可降低對E-cadhenin 蛋白的水解作用，E-catenin 與β-catenin 連接固定于細(xì)胞骨架中，阻止細(xì)胞漿中的β-catenin 入核激活WNT信號通路，該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MSI-H 的結(jié)腸癌組β-Catenin 陰性表達(dá)，而MSS 或MSI-L 的結(jié)腸癌組顯示出高含量的β-Catenin 陽性表達(dá)，提示MSI-H與MSS/MSI-L 的結(jié)腸癌具有不同臨床表現(xiàn)及預(yù)后［8］。

本研究結(jié)果顯示Biglycan 蛋白表達(dá)水平升高與結(jié)腸癌的組織學(xué)分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期有關(guān)，提示Biglycan 與蛋白表達(dá)水平與結(jié)腸癌的組織學(xué)分化程度和癌組織的侵襲力相關(guān)；β-catenin 蛋白陽性表達(dá)率與結(jié)腸癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期有關(guān)，提示β-catenin蛋白表達(dá)水平與結(jié)腸癌侵襲力及預(yù)后相關(guān)。與癌旁正常組織相比，Biglycan 表達(dá)上調(diào)及β-catenin蛋白陽性表達(dá)率均明顯升高，且相關(guān)性分析提示結(jié)腸癌組織中Biglycan 表達(dá)上調(diào)及β-catenin 蛋白陽性表達(dá)存在一定相關(guān)性，二者在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中是否存在一定關(guān)聯(lián)性，需待后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

此外，筆者對比分析了80 例結(jié)腸癌中MSI-H組和MSS/MSI-L 組的β-catenin 蛋白表達(dá)情況，本研究入組的80 例結(jié)腸癌病例中MSI-H 組有10 例（12.5%），其中β-catenin 蛋白陽性表達(dá)率為40.0%，MSS/MSI-L 組有70 例（87.5%），其中β-catenin 蛋白陽性表達(dá)率為61.4%，MSI-H 與MSS/MSI-L 兩組結(jié)腸癌中β-catenin 陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。筆者猜測，一方面可能β-catenin 陽性表達(dá)情況確實(shí)和微衛(wèi)星穩(wěn)定性無明顯相關(guān)性，另一方面可能研究中入組的MSI-H 組的標(biāo)本例數(shù)太少不足以說明問題，擬進(jìn)行擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步的確認(rèn)和分析。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中，Biglycan 蛋白表達(dá)上調(diào)及β-catenin 蛋白陽性表達(dá)均與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期有關(guān)，Biglycan 與β-catenin可能作為評估結(jié)腸癌患者預(yù)后指標(biāo)。Biglycan 蛋白表達(dá)上調(diào)及β-catenin 蛋白陽性表達(dá)存在一定相關(guān)性，識別WNT 信號通路中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白對結(jié)直腸癌的早期診斷還是早期干預(yù)治療均有積極影響，具體Biglycan 與WNT 信號通路激活的是否相關(guān)，其相關(guān)作用機(jī)制尚需后續(xù)進(jìn)一步研究。