孫兆豐 ，王國棟 ，翟傳興 ，張元民

（1.濟寧醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟寧 272067；2.濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)外科，山東 濟寧 272067）

三維（3D）生物打印是一種按預(yù)先設(shè)計的方案進行生物材料精確可控的增材制造技術(shù)［1］。擠壓和噴墨是目前基于噴嘴的生物打印最常見的模式，而激光誘導(dǎo)正向轉(zhuǎn)移和數(shù)字激光打印是兩種常用的激光3D 生物打印［2］。生物墨水的合成、交聯(lián)對生物組織的構(gòu)造，特別是對組織的機械性和細(xì)胞行為有很大的影響［3］。因此，生物墨水的設(shè)計是3D 生物打印關(guān)鍵的步驟之一。水凝膠是由高度親水的聚合物組成的松散交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，具有很高的滲透性，允許細(xì)胞遷移，可以在不損傷細(xì)胞的同時交聯(lián)并能將支架內(nèi)的細(xì)胞的生理壓力降至最低［4］。這些特性使水凝膠能夠接近模擬細(xì)胞的自然微環(huán)境，使其成為3D 生物打印的最佳選擇。

設(shè)計優(yōu)良的生物墨水應(yīng)具備支持細(xì)胞外基質(zhì)的合成及沉積和植入后不會引發(fā)先天或獲得性免疫反應(yīng)等特點［5］。此外，預(yù)處理和后處理參數(shù)必須能夠保持材料的生物相容性、打印保真度、剪切稀釋、機械強度等特性［6］。目前的研究需開發(fā)出有效加強水凝膠，同時保持良好的生物特性的復(fù)合水凝膠，常用的技術(shù)包括多材料、互穿網(wǎng)絡(luò)（interpenetrating polymer network，IPN）、納米復(fù)合材料、超分子生物墨水，這些生物墨水增強方法從不同途徑改善水凝膠的力學(xué)性能，包括增強交聯(lián)度、均勻應(yīng)力分布和通過犧牲鍵耗散機械能［7］。本文旨在對這幾種技術(shù)的生物墨水合成和生物制造的趨勢進行概括，并嘗試評估這些新型生物材料轉(zhuǎn)化為臨床使用的潛在應(yīng)用。

1 水凝膠的分類和結(jié)構(gòu)

水凝膠是具有3D 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的交聯(lián)聚合物鏈，其親水官能團（如-OH、-NH2、-COOH 和-SO3H）的存在決定了水凝膠的吸水性、不溶解性和力學(xué)性能，根據(jù)來源，水凝膠可以分為天然、合成或半合成聚合物，天然水凝膠具有分級多孔結(jié)構(gòu)、生物相容性、滲透性、伸縮性、粘彈性和類組織特性，從物理化學(xué)的角度來看，與天然組織細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）非常相似［8］。天然水凝膠包括多糖、蛋白質(zhì)和動物衍生物，比如海藻酸鹽、明膠、殼聚糖、絲素蛋白、纖維蛋白原、透明質(zhì)酸和纖維素等，然而因為力學(xué)性能低，穩(wěn)定性差，通常與物理交聯(lián)機制有關(guān)，從而限制了其在生物組織工程的應(yīng)用［4］。合成水凝膠是由合成聚合物構(gòu)成的，相對于天然水凝膠，其具有良好的生物相容性、生物降解性、功能性和機械性能，比較常見的合成水凝膠主要由聚乙二醇、聚乙醇酸、聚乳酸、聚己內(nèi)酯或聚乳酸-聚乙醇酸等單體聚合制備，半合成聚合物是化學(xué)改性的天然聚合物或天然和合成聚合物的組合，常用于制備半水凝膠［9］。此外還有天然和合成聚合物的組合，如聚乙二醇結(jié)合殼聚糖，海藻酸鹽與甲基丙烯酸酐化明膠（GelMA）結(jié)合等。這些水凝膠不僅具有天然水凝膠的生物活性特征，而且通過其不同的化學(xué)參數(shù)具有多種可調(diào)性質(zhì)［10］。目前水凝膠因其的力學(xué)、組織粘附性和可調(diào)性使其適合于各種應(yīng)用，包括傷口愈合、藥物和細(xì)胞輸送癌癥治療、增強抗炎作用、生物電子學(xué)、和組織再生［11］。

2 復(fù)合水凝膠生物墨水

復(fù)合水凝膠生物墨水是一種新興的方法，指兩種或兩種以上不同的生物材料水通過物理纏結(jié)、化學(xué)交聯(lián)和離子相互作用等多種機制一種生物墨水的混合物［12］。依據(jù)添加劑的空間分布和取向，復(fù)合生物油墨可以具有各向同性或各向異性的特性，在單網(wǎng)絡(luò)水凝膠生物墨水的基礎(chǔ)上，通過在多材料水凝膠網(wǎng)絡(luò)中設(shè)計新的機械耗能機制來改善水凝膠生物墨水的力學(xué)性能，以及改善生物墨水的流變特性提高可印刷性，以致于目前關(guān)于多材料生物墨水的相關(guān)研究非常多樣化，包括互穿網(wǎng)絡(luò)、納米復(fù)合材料、超分子生物油墨、聚合物功能化等［13］。

2.1 半/互穿網(wǎng)絡(luò)生物墨水

IPN 生物墨水因其獨特的微觀結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能讓人們對其的開發(fā)越來越感興趣。IPN 生物墨水由兩個單獨的聚合物網(wǎng)絡(luò)通過共價或離子交聯(lián)或兩者結(jié)合在一起，如果IPN 中只有一個聚合物是交聯(lián)的，而其他聚合物具有線性結(jié)構(gòu)，則形成半IPN［14］。IPN 的形成不僅保留了每種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的特點，提高了交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性和力學(xué)性能，并有較好的粘附性、降解性。為了適應(yīng)組織或器官的特定要求，利用不同聚合物網(wǎng)絡(luò)組合的協(xié)同作用來調(diào)節(jié)所產(chǎn)生的IPN 生物墨水在3D 生物打印中展現(xiàn)出了巨大的潛力。目前已在藥物輸送和組織工程、傷口敷料、生物致動器、微傳感器和滲透劑中得到廣泛應(yīng)用［15］。

IPN 主要分為雙交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)（dual-cross-linked network，DCN）和離子-共價糾纏（ionic-covalent entanglement，ICE）網(wǎng)絡(luò)兩大類。DCN 是指兩個網(wǎng)絡(luò)都通過共價交聯(lián)連接在一起，它具有很高的鍵能，幾乎與應(yīng)變率無關(guān)，有較好的力學(xué)性能［14］。比如明膠和殼聚糖（chitosan,CS）是廣泛應(yīng)用于組織工程支架的天然生物材料但單純的明膠或CS 水凝膠的力學(xué)性能較差，因此SUO 等［16］提出了明膠與CS 水凝膠通過共價鍵形成互穿網(wǎng)絡(luò)（IPN）生物墨水，利用光交聯(lián)和堿化作用實現(xiàn)了疏水相互作用。通過壓縮和拉伸模數(shù)、極限拉伸應(yīng)力和應(yīng)變的表征進行驗證時，發(fā)現(xiàn)該生物墨水有較好的力學(xué)性能和生物相容性。ICE 網(wǎng)絡(luò)是指即由離子交聯(lián)的剛性聚合物和共價鍵交聯(lián)的彈性聚合物形成的，相比于共價交聯(lián)，其具有具有更強韌性［17］。例如CHIMENE 等［18］把共價交聯(lián)Gelma、離子交聯(lián)卡拉膠進行交聯(lián)形成離子-共價糾纏網(wǎng)絡(luò)，并與納米硅酸鹽相結(jié)合形成了納米工程離子共價纏結(jié)生物墨水，測試支架發(fā)現(xiàn)其有較好的印刷適性，機械性能和降解特性，并且發(fā)現(xiàn)在無骨誘導(dǎo)劑的情況下，生物打印的支架能誘導(dǎo)囊人間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨內(nèi)分化，這說明其有較好的骨誘導(dǎo)作用。

2.2 納米復(fù)合材料生物墨水

納米復(fù)合生物墨水（nanocomposite bioink）是含有納米顆粒的復(fù)合生物墨水。將納米材料引入會導(dǎo)致許多親水聚合物牢固的結(jié)合在納米材料的表面，從而納米復(fù)合生物墨水顯示出高強度和高韌性［19］。此外，納米材料的表面提供了蛋白質(zhì)吸附和焦點黏附位置，從而可以提高蛋白質(zhì)和細(xì)胞在納米復(fù)合生物墨水上的黏附性［20］。納米復(fù)合生物墨水具有剪切減薄性、力學(xué)穩(wěn)定性、導(dǎo)電性、藥物可控傳遞性等優(yōu)異性能，使得人們對開發(fā)和使用納米復(fù)合生物墨水作為組織工程應(yīng)用的3D 支架越來越感興趣［21］，當(dāng)前納米粘土/納米硅酸鹽、陶瓷納米顆粒、納米纖維素、金屬納米顆粒和碳納米材料等納米材料已被廣泛研究［22］

例如 SAMADI 等［23］制備的聚乙烯醇（polyvinyl alcohol,PVA）/瓊脂/石墨烯納米復(fù)合水凝膠，石墨烯納米片上的聚合鏈通過物理吸附形成的聚合物的網(wǎng)絡(luò)。研究發(fā)現(xiàn)該納米復(fù)合生物墨水具有較好的的力學(xué)性能、快速的自愈行為和高效的強度恢復(fù)能力。為了生產(chǎn)用于骨組織工程的生物墨水，IM 等［24］使用TEMPO 氧化纖維素納米纖維（TEMPO-oxidized cellulose nanofibrils,TOCNF）和聚多巴胺納米顆粒（polydopamine nanoparticles,PDANPs）配制了納米復(fù)合生物墨水。通過載有成骨細(xì)胞的支架的體外研究表明，摻入 0.5% PDANP的生物墨水可顯著誘導(dǎo)成骨特性。也有研究開發(fā)了一種適用于嵌入細(xì)菌的 3D 生物打印的基于高度顆粒填充的氧化鋁/殼聚糖納米復(fù)合生物墨水，該生物墨水通過與海藻酸鹽的靜電相互作用和殼聚糖分子與溫和的膠凝劑京尼平之間的共價結(jié)合得到增強。研究發(fā)現(xiàn)將納米顆粒整合到殼聚糖凝膠中可以顯著提高機械阻力和可印刷性，還可以為凝膠增加導(dǎo)電性、抗菌性能等［25］。ZHU 等［26］將胺功能化銅摻雜的玻璃納米粒子摻入由海藻酸二醛和明膠組成的動態(tài)共價交聯(lián)的生物墨水中，測試發(fā)現(xiàn)該墨水具有良好的流變特性、無毒性、形狀保真度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在體外沒有額外生長因子的情況下，藻酸鹽二醛-明膠-ACuMBGN 支架促進了小鼠原代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和血管生成。

2.3 超分子生物墨水

超分子生物墨水是一類分子通過氫鍵、π-π 堆積、范德華、靜電和疏水作用等非共價鍵相互作用組裝而成的一類材料［27］。超分子生物墨水的組裝過程是動態(tài)的和可逆的。這些相互作用不同于共價鍵，當(dāng)被機械破壞時，它們可以迅速重新形成，而不會對性能造成永久性損失。這比常用的聚合物水凝膠（如海藻酸鹽、明膠和膠原）具有許多優(yōu)點，包括有序和可逆的納米結(jié)構(gòu)、易于修飾的生物活性行為、可控的降解和對環(huán)境刺激的響應(yīng)性［28］。

盡管超分子生物墨水在分子水平上具有可控的性質(zhì)，顯示出巨大的潛力。然而，它們的機械性能不穩(wěn)定仍然是3D 生物打印的一大挑戰(zhàn)［29］，為此，JIAN 等［30］基于兩種末端殘基帶相反電荷的9-熒甲氧基甲氧基二肽（Fmoc-di 多肽），設(shè)計了兩種相反電荷的二肽生物墨水，通過兩個二肽之間的靜電相互作用實現(xiàn)原位凝膠，避免了化學(xué)物質(zhì)、加熱、冷卻、紫外線照射等交聯(lián)處理對細(xì)胞的損傷。使用基于液滴的3D 打印機構(gòu)建腫瘤球體。該球體機械性能和可降解性均可在很大范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，使腫瘤球體的形成、生長和自然釋放成為可能，并且拓寬了短肽材料在三維生物打印、組織工程、器官再生等領(lǐng)域的應(yīng)用。由多肽-DNA 水凝膠制備超分子生物墨水有效的克服了非共價水凝膠的形狀易變形性、缺乏響應(yīng)性和可剪切性等缺點［31］，且具有較好的愈合性能和力學(xué)性能［32］。DNA 水凝膠包含兩個組分：多肽-DNA 偶聯(lián)物和互補DNA連接物，通過在編程位置交替沉積DNA 偶聯(lián)物和互補DNA 連接物，可以短時間內(nèi)構(gòu)建包含功能性活細(xì)胞的3D 結(jié)構(gòu)。測試發(fā)現(xiàn)其在生理條件下具有完全可生物降解性。由于物理交聯(lián)的超分子水凝膠不能滿足生物墨水長期保持形狀的機械要求［33］。便有人提出二次交聯(lián)可以解決這個問題。例如HU 等［34］制備了一種由聚乙二醇化殼聚糖、明膠、α-CD 和β-GPS 組成新型的超分子生物墨水，通過雙重物理交聯(lián)獲得穩(wěn)定的生物打印結(jié)構(gòu)，沒有有毒副產(chǎn)物或有害成分。生物墨水不僅表現(xiàn)出理想的生物相容性，而且還表現(xiàn)出可調(diào)節(jié)的強度和較好的機械性能。為構(gòu)建基于超分子水凝膠的生物墨水提供了一種策略。

2.4 聚合物功能化

為了克服天然聚合物機械強度、熱強度、粒徑和比表面積差等缺點，研究人員通常對聚合物進行物理和化學(xué)改性［35］。許多天然生物油墨（海藻酸鹽、殼聚糖、明膠、透明質(zhì)酸和膠原等）通過功能化來增強其機械強度和穩(wěn)定性［36］。比如聚合物功能化的一種常用方法是通過甲基丙烯酸酯基團對聚合物主鏈進行共價交聯(lián)，最常見的就是甲基丙烯酰胺明膠的合成，甲基丙烯酸酯基團在引發(fā)劑的介導(dǎo)下與明膠進行共價交聯(lián)，形成的聚合物不光的保留了許多基本生物活性，還提高其力學(xué)性能［37］。殼聚糖雖然具有生物降解性、生物相容性、無毒、黏附性、無致癌性等優(yōu)點［38］，但是因其不可控的生物降解性、pH 敏感性低、藥物在胃內(nèi)的釋放以及在酸性介質(zhì)中的溶解性，阻礙了其在藥物傳遞方面的重大發(fā)展，通過聚甲基丙烯酸乙二醇酯接枝殼聚糖合成型殼聚糖接枝聚甲基丙烯酸乙二醇酯，不僅提高了多糖的水溶性，而且可以制備出在稀釋條件下穩(wěn)定性良好的顆粒［10］?？傊?，功能化通過引入共價交聯(lián)機制來增強生物油墨，這種交聯(lián)機制比物理交聯(lián)更強、更穩(wěn)定。由于交聯(lián)的快速和永久性質(zhì)，這些反應(yīng)越來越受歡迎。功能化技術(shù)可以提高水凝膠網(wǎng)絡(luò)的斷裂能，也可以改善網(wǎng)絡(luò)的均勻性，從而增加延展性。

3 結(jié)論和展望

3D 生物打印是組織工程領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，生物墨水的選擇或設(shè)計是3D 生物打印過程中的一個關(guān)鍵步驟，然而，缺乏合適的生物墨水已經(jīng)成為推動3D 生物打印研究的最大障礙之一。生物墨水需要具有可打印性，并考慮到流變學(xué)、溶脹率、表面張力和凝膠動力學(xué)等幾個參數(shù)，相對于傳統(tǒng)的單組分水凝膠，互穿網(wǎng)絡(luò)、納米復(fù)合材料和超分子方法通過使施加的應(yīng)力能夠在不破壞主網(wǎng)絡(luò)的情況下進行增強生物墨水的性能，聚合物功能化生物墨水通過加強交聯(lián)鍵增加固有斷裂能。目前使用3D 生物打印設(shè)計復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)的瓶頸是傳統(tǒng)生物墨水的有限可用性。最近有不少研究探索了使用多種聚合物生物墨水來打印復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)。相信在未來，能夠看到用于打印復(fù)雜結(jié)構(gòu)的復(fù)合生物墨水重大發(fā)展。