葉鵬茹，王萬利，王萍，陶占領(lǐng)，渠海

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450016）

磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)因其靈敏度高、線性范圍寬、選擇性強(qiáng)、快速簡單、自動化等諸多優(yōu)點已經(jīng)廣泛用于檢測甲狀腺、激素、心肌損傷、腫瘤標(biāo)志物、傳染病、貧血、骨代謝等［1-4］，在體外臨床診斷有著廣泛的應(yīng)用和巨大的前景［5-6］。目前市場上產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，因此必須要全面提高產(chǎn)品的性能，其中產(chǎn)品穩(wěn)定性作為評價體外診斷試劑保持產(chǎn)品性能的重要指標(biāo)，提高產(chǎn)品的穩(wěn)定性對于產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)、運(yùn)輸、保存和使用等環(huán)節(jié)至關(guān)重要。眾所周知，影響磁微?；瘜W(xué)發(fā)光試劑穩(wěn)定性的因素有很多，例如：緩沖液的種類、pH、離子強(qiáng)度、表面活性劑、糖類、酶標(biāo)記方法等［7-12］，甚至是更換原料也可能會導(dǎo)致活性減弱或喪失，穩(wěn)定性變差。

有研究表明可以通過預(yù)熱處理方法來控制蛋白質(zhì)顆粒的大小、變性和聚集，從而提高蛋白穩(wěn)定性，是目前最簡單、有效的方法之一［13-14］。在加熱過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會發(fā)生一定的變化，分子內(nèi)和分子間重組等因素增強(qiáng)了熱穩(wěn)定性，抑制蛋白分子聚合，維持結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，從而改善穩(wěn)定性［14-15］。因此，根據(jù)啟發(fā)在本研究中筆者提出通過預(yù)熱平衡這種簡單的方式來增加磁微?；瘜W(xué)發(fā)光試劑的穩(wěn)定性。

通常情況下，升高溫度來考察加速穩(wěn)定性是最常用的方式，即通常所講的熱穩(wěn)定性，因此本研究主要通過考核熱穩(wěn)定性來驗證平衡對產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響。本文主要以磁微粒β2-MG 檢測試劑盒為例，通過對試劑進(jìn)行預(yù)熱平衡處理來穩(wěn)定活性材料與輔料的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高產(chǎn)品穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磁微粒β2-MG 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒；酶標(biāo)抗體（鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司）：酶結(jié)合物稀釋液：0.02 M pH=7.4 PBS 緩沖液含1% 牛血清白蛋白（BSA）和1‰ P300。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動化學(xué)發(fā)光測定儀Auto Lumo A2000 Plus（安圖生物）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器材有限公司）

1.3 試驗方法

1.3.1 不同平衡方式對穩(wěn)定性影響研究 對酶結(jié)合物進(jìn)行不同的平衡處理來驗證對穩(wěn)定性的影響。①平衡酶標(biāo)抗體：酶標(biāo)抗體原液37℃溫箱放置3 d后取出，在2～8℃冰箱放置過夜，然后用新鮮配制的酶結(jié)合物稀釋液將其稀釋至所需濃度；②平衡酶結(jié)合物稀釋液：將新鮮配制的酶結(jié)合物稀釋液37℃溫箱放置3 d 后取出，在2～8℃冰箱放置過夜，然后此酶結(jié)合物稀釋液將酶標(biāo)抗體原液稀釋至所需濃度；③平衡酶結(jié)合物：將新鮮配制的酶結(jié)合物工作液37℃溫箱放置3 d 后取出，在2～8℃冰箱放置過夜；④分步平衡：將新鮮配制的酶結(jié)合物稀釋液37℃溫箱放置3 d 后取出，在2～8℃冰箱放置過夜，然后用此酶結(jié)合物稀釋液將酶標(biāo)抗體原液稀釋至所需濃度得到酶結(jié)合物工作液，然后在37℃溫箱放置3 d 后取出，2～8℃冰箱放置過夜；⑤對照不平衡：新鮮配制的酶結(jié)合物工作液在2～8℃冰箱保存；以上5 組試劑用0.22 μm 的過濾器過濾后，分別將其放置2～8℃、37℃ 10 d 后進(jìn)行穩(wěn)定性考核。

1.3.2 平衡溫度對穩(wěn)定性影響研究 將新鮮配制的酶結(jié)合物在在25℃、37℃、45℃電熱恒溫培養(yǎng)箱放置3 d 后取出，2～8℃冰箱放置過夜，然后將其放置2～8℃、37℃ 10 d 后進(jìn)行穩(wěn)定性考核。

1.3.3 平衡時間對穩(wěn)定性影響研究 將新鮮配制的酶結(jié)合物在在37℃溫箱放置1、3、5、7 d 后取出，2～8℃冰箱放置過夜，用0.22 μm 的過濾器過濾后將其放置2～8℃、37℃ 10 d 后進(jìn)行穩(wěn)定性考核。

1.3.4 酶標(biāo)抗體稀釋液平衡對穩(wěn)定性影響研究用新鮮配制的酶結(jié)合物稀釋液將酶標(biāo)抗體稀釋20 倍，在37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱放置1、3、5、7 d后取出，2～8℃冰箱放置過夜，然后用新鮮配制的酶結(jié)合物稀釋液將其至所需濃度，放置2～8℃、37℃ 10 d 后進(jìn)行穩(wěn)定性考核。

1.3.5 加樣和反應(yīng)模式 在反應(yīng)杯中分別加入100 μL 標(biāo)準(zhǔn)品（濃度值分別為0 μg/L、50 μg/L、150 μg/L、400 μg/L、1 000 μg/L、4 000 μg/L），20 μL 磁微粒試劑和100 μL 酶結(jié)合物震蕩混勻，37℃反應(yīng)17 min，洗滌5 次，加激發(fā)液和預(yù)激發(fā)液各50 μL，測定發(fā)光值（relative light unit,RLU）。

1.3.6 檢測指標(biāo) IVD 行業(yè)一般認(rèn)為試劑盒在37℃放置10 d 相當(dāng)于2～8℃貯存18 個月效期，所以試劑盒組分都需要考核37℃放置10 d 的性能指標(biāo)，本文重點考察標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)光值變化，實驗將放置37℃ 10 d 后各研究方法配制的試劑與2～8℃試劑同時對比檢測，計算配對濃度點的發(fā)光值下降率（rate of decline,ROD）（%）=（RLU37℃10d/RLU2～8℃－1）均值為標(biāo)準(zhǔn)品各濃度ROD 的平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本文選擇較優(yōu)的方案，用酶標(biāo)稀釋液平衡7 d與對照不平衡2～8℃的試劑同時測定22 份樣本，采用SPSS 17.0 軟件對結(jié)果進(jìn)行配對樣本行t檢驗，計算出P值，若P＞0.05，則酶標(biāo)稀釋液平衡后的試劑與對照試劑兩組數(shù)據(jù)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同平衡方式對穩(wěn)定性影響研究

不同平衡方式對磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑穩(wěn)定性影響結(jié)果見表1。通過對比不同平衡方式，筆者發(fā)現(xiàn)不同平衡方式之間穩(wěn)定性有一定的差異，其中平衡酶結(jié)合物與分步平衡對穩(wěn)定性有明顯改善，且兩者無顯著差異，ROD 均值由30.37% 減少至19%左右，而平衡酶結(jié)合物稀釋液對穩(wěn)定性改善沒有效果。因此后續(xù)以平衡酶結(jié)合物方法進(jìn)一步驗證平衡時間及平衡溫度對穩(wěn)定性的影響。其中值得注意的是，經(jīng)過平衡后的酶結(jié)合物的試劑檢測的發(fā)光值有一定的下降，后續(xù)需著可進(jìn)一步研究這種變化對臨床檢驗是否產(chǎn)生影響。

表1 不同平衡方式穩(wěn)定性結(jié)果比較

2.2 不同平衡溫度對穩(wěn)定性影響研究

由表2 可知，不同平衡溫度對穩(wěn)定性改善能力有一定區(qū)別，其中在25℃條件下平衡3 d 時，ROD 僅改善3%左右，此外溫度過高可能導(dǎo)致發(fā)光試劑失活，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此，后續(xù)均選用37℃作為平衡溫度。

表2 平衡溫度穩(wěn)定性結(jié)果比較

2.3 不同平衡時間對穩(wěn)定性影響研究

不同平衡時間對磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑穩(wěn)定性影響結(jié)果見表3。由結(jié)果可知隨著平衡時間的延長，穩(wěn)定性也隨之越好，當(dāng)熱平衡時間增加到7 d時，ROD 均值由28.84%減少至17.09%。

表3 不同平衡時間穩(wěn)定性結(jié)果比較

2.4 酶標(biāo)抗體稀釋液平衡對穩(wěn)定性影響研究

為減少生產(chǎn)操作難度，筆者又進(jìn)一步評估預(yù)先稀釋的酶標(biāo)抗體經(jīng)平衡后能改善穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。由結(jié)果可知，酶標(biāo)稀釋液平衡7 d 后，ROD 均值減少至18.85%，與直接平衡酶結(jié)合物7 d（ROD 均值17.09%）無明顯差異；因此采用酶標(biāo)稀釋液平衡7 d 與對照不平衡2～8℃的試劑檢測22 份樣本進(jìn)行比較 （P=0.8473），見表5。

表4 酶標(biāo)抗體稀釋液平衡穩(wěn)定性結(jié)果比較

表5 22 份樣本的配對樣本t 檢驗結(jié)果（μg/L）

3 討論

產(chǎn)品穩(wěn)定性是體外診斷試劑保持產(chǎn)品性能的重要指標(biāo)，而在磁微?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒中，磁微粒發(fā)光試劑是最主要的組分之一，但由于活性材料與酶形成發(fā)光復(fù)合物后可能導(dǎo)致某些結(jié)構(gòu)上的改變，同時會受到外界溶液酸堿性、離子強(qiáng)度、表面活性劑、糖類等的變化［7-12］，通過疏水相互作用、范德華力、靜電作用以及水化作用等相互作用引起原有蛋白或分子上的某些活性基團(tuán)受到破壞，造成試劑穩(wěn)定性差，最終影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

由于通過熱平衡使發(fā)光試劑中的活性材料在溶液中與其他組分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使結(jié)構(gòu)得到充分伸展，此外分子內(nèi)和分子間重組等相互作用，增強(qiáng)了穩(wěn)定性，抑制蛋白分子聚合，維持結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，從而使加速穩(wěn)定性降幅變小，提高磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑盒的穩(wěn)定性。綜上所述，通過熱平衡處理，可以在不改變試劑成分的情況下提高磁微粒發(fā)光試劑的穩(wěn)定性，為體外診斷試劑同行提供一種新思路。