王川川,母 童,李德生,張 迪,李蕾蕾,張 娟,顧亞玲

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

脂肪酸結(jié)合蛋白(Fatty acid binding proteins,FABPs)是胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白超家族成員。 FABPs蛋白可結(jié)合長(zhǎng)鏈脂肪酸和其他具有生物活性的配體以促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)的定位[1],也可以影響細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)通量、代謝和信號(hào)傳導(dǎo)[2]。在奶牛乳腺組織中,FABP3、FABP4和FABP5均高表達(dá),并且在哺乳期間顯著上調(diào)[3]。FABPs作為進(jìn)化上保守的蛋白質(zhì),其獨(dú)特的家族成員,如FABP1、FABP3、FABP4等具有調(diào)節(jié)脂肪酸代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的能力[4]。其中FABP4常被作為脂肪細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志基因,通過(guò)與激素敏感性脂肪酶(Hormone-sensitivetriglayceridelipase,HSL)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)的相互作用在維持脂肪細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)脂肪分解和生成方面發(fā)揮作用[5]。最早對(duì)牛脂肪酸結(jié)合蛋白4(Fatty acid binding protein 4,FABP4)的研究表明[6],牛背最長(zhǎng)肌中FABPs的活性隨著安格斯牛和日本和牛的大理石花紋分?jǐn)?shù)的增加而增加。目前,已經(jīng)鑒定出FABP4是影響山東黑牛和魯西黃牛脂肪沉積的重要候選標(biāo)記基因,這為改善肉質(zhì)和產(chǎn)生新品種牛提供了新的思路[7]。FABP4在牛中被定位在14號(hào)染色體(46 833 665～46 838 053),該位置富含產(chǎn)奶性狀的數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait loci,QTL),這表明它可能是產(chǎn)奶的候選基因或標(biāo)記。Marchitelli等[8]發(fā)現(xiàn),FABP4還是影響乳脂成分的重要基因,主要影響牛奶中的中鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸水平。因此,了解FABP4基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律有助于改善家畜的肉質(zhì)及牛奶中乳脂的成分。

目前,有關(guān)FABP4基因在荷斯坦奶牛乳脂中的相關(guān)研究較少。基于前期對(duì)荷斯坦奶牛高、低乳脂率組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析,確定FABP4作為影響奶牛乳脂代謝的關(guān)鍵功能候選基因[9],但目前FABP4在奶牛乳脂合成中的作用機(jī)制還不確定,故對(duì)其進(jìn)行乳脂合成方面的深入研究是非常有必要的。本研究旨在通過(guò)克隆荷斯坦奶牛FABP4基因的CDS區(qū),通過(guò)生物信息學(xué)分析FABP4基因的分子結(jié)構(gòu)、功能、蛋白特性及啟動(dòng)子等,并運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)FABP4基因在泌乳中期荷斯坦奶牛各組織中的表達(dá),為進(jìn)一步研究FABP4基因在荷斯坦奶牛乳脂調(diào)控中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用荷斯坦奶牛均來(lái)自寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)茂盛牧場(chǎng),奶牛的小腸、肝臟、乳腺、心臟、子宮、腎臟及卵巢組織樣品均為寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期采集(3頭泌乳中期、無(wú)乳房疾病的荷斯坦奶牛),剪碎組織后裝入1.5 mL凍存管,迅速放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存?zhèn)溆?。本試?yàn)所用的原代BMECs來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)膠原酶Ⅰ消化法分離獲得,且采集乳腺組織的奶牛也處于泌乳中期。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑盒(TaKaRa,大連);DNA膠回收試劑盒(生工,上海);反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自諾唯贊生物科技股份有限公司;DL2000 DNA Marker購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;2×Taq DNA Master Mix購(gòu)自諾唯贊公司;pMD18-T Vector Cloning Kit(寶生生物,大連);2×SYBR Green PCR Master Mix(艾科瑞,長(zhǎng)沙);DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司;氨芐青霉素、胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉和瓊脂糖均購(gòu)自上海生工生物有限公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自Cell Max公司;DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司;雙抗(青霉素、鏈霉素)、PBS均購(gòu)自金克隆公司、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;Cytoplasmic &Nuclear RNA Purification Kit 購(gòu)自英國(guó)NORGREN公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中牛FABP4及U6、β-actin和GAPDH的基因序列,利用Primer 5.0設(shè)計(jì)PCR和qRT-PCR特異性引物(表1),委托陜西中科羽瞳生物公司合成。

表1 基因引物序列Tab.1 Primer sequences of gene

1.4 RNA的提取與cDNA的合成

按照TRIzol法提取奶牛不同組織總RNA。利用試劑盒提取BMECs的細(xì)胞核RNA和細(xì)胞質(zhì)RNA。使用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(Eppendorf BioSpectrometer basic)進(jìn)行濃度和純度檢測(cè),利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行總RNA完整性檢測(cè)。挑取完整性及純度較好的不同組織的RNA利用諾唯贊生物公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNAs,反轉(zhuǎn)完成后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 FABP4基因CDS區(qū)擴(kuò)增與測(cè)序

通過(guò)PCR擴(kuò)增出FABP4基因CDS區(qū)全長(zhǎng)。FABP4基因擴(kuò)增體系為25 μL(統(tǒng)一為250 ng/μL):cDNA樣品1 μL,上、下游引物各1 μL(10 μmol/L),TaqPCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸2 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸6 min,4 ℃保存。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,用膠回收試劑盒進(jìn)行回收目的片段,隨后將目的片段與pMD18-T Vector Cloning Kit克隆載體在4 ℃條件下過(guò)夜連接。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,置于冰上30 min,42 ℃水浴90 s,再次置于冰上3 min,加入無(wú)抗液體LB培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)45 min,涂布于含氨芐抗性的LB平板培養(yǎng)基上,37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜,挑取單菌落放入含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)8 h,進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增。同時(shí),收集菌液送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)軟件對(duì)牛FABP4基因進(jìn)行分析,主要包括蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)定位等,具體軟件使用的網(wǎng)址及預(yù)測(cè)的功能見(jiàn)表2。

表2 生物信息學(xué)分析軟件及功能Tab.2 Bioinformatics analysis software and functions

1.7 統(tǒng)計(jì)與分析

以GAPDH為內(nèi)參基因,通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算FABP4基因在奶牛各組織中的相對(duì)表達(dá)量。核質(zhì)定位采用細(xì)胞核RNA中基因占比(%)=2^-胞核CT值/(2^-胞漿CT值+2^-胞核CT值),細(xì)胞質(zhì)RNA中基因占比(%)=1-細(xì)胞核RNA中基因占比(%),原始數(shù)據(jù)結(jié)果通過(guò)Microsoft office 2019整理后利用SAS 9.2(SAS Institute,Cary,NC,美國(guó))的線性混合模型(Linear mixedmodel)進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛FABP4基因CDS序列擴(kuò)增結(jié)果

以荷斯坦奶牛乳腺組織cDNA為模板,擴(kuò)增FABP4基因CDS序列,通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,結(jié)果如圖1所示,擴(kuò)增出468 bp的清晰條帶,與預(yù)期條帶相符,可進(jìn)行下一步研究。

圖1 荷斯坦奶牛FABP4基因CDS序列PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification electrophoresis of CDS sequence of FABP4 gene in Holstein cows

2.2 牛FABP4基因片段克隆及測(cè)序結(jié)果分析

經(jīng)菌液PCR鑒定成功獲得468 bp的目的片段(圖2-A)。將菌液測(cè)序結(jié)果與NCBI發(fā)布的牛FABP4基因序列進(jìn)行比對(duì),得到單峰全長(zhǎng)為399 bp的CDS區(qū)序列(圖2-B),比對(duì)結(jié)果顯示(圖2-C)荷斯坦奶?；駽DS序列第149位核苷酸存在錯(cuò)義突變(T→G),使絲氨酸突變?yōu)楸彼帷?/p>

A.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定;B.測(cè)序峰圖;C.測(cè)序序列比對(duì)。A.PCR amplification product identification;B.Sequencing peak map; C.Sequencing sequence comparison.

2.3 荷斯坦奶牛FABP4蛋白生物信息學(xué)分析

2.3.1 荷斯坦奶牛FABP4蛋白的功能分析 通過(guò)ProtParam在線網(wǎng)站分析FABP4蛋白的氨基酸組成成分,結(jié)果顯示,荷斯坦牛FABP4基因共編碼133個(gè)氨基酸殘基,蛋白分子式為C646H1043N171O201S8,分子質(zhì)量為14.677 89 ku,其中含量最高的氨基酸為纈氨酸(占11.4 %),含量最低的氨基酸為半胱氨酸(1.5%)、脯氨酸(1.5%)、色氨酸(1.5%)、酪氨酸(1.5 %)。FABP4蛋白理論等電點(diǎn)(PI)為5.52,蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為15.92,是穩(wěn)定蛋白。用ProtScale程序?qū)εABP4蛋白進(jìn)行疏水性分析,結(jié)果如圖3-A所示,FABP4蛋白第46位天冬酰胺疏水性最強(qiáng)為1.789,第76位脯氨酸親水性最弱為-2.244,親水性的總體平均值為-0.183,預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白。利用TMHMM 2.0在線軟件預(yù)測(cè)荷斯坦牛FABP4蛋白的跨膜結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,利用SignalP 6.0程序預(yù)測(cè)FABP4蛋白的信號(hào)肽(圖3-B),發(fā)現(xiàn)該蛋白可能不存在信號(hào)肽序列,有較大可能為非分泌型蛋白。該蛋白不含跨膜區(qū),且蛋白全部在膜外(圖3-C)。運(yùn)用NetPhos 3.1Server程序?qū)ABP4蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖3-D),荷斯坦牛FABP4氨基酸序列共有21個(gè)磷酸化位點(diǎn),包括8個(gè)絲氨酸、11個(gè)蘇氨酸及2個(gè)酪氨酸,其中蘇氨酸在氨基酸序列中均廣泛分布。

圖3 牛FABP4親疏水性(A)、蛋白信號(hào)肽(B)、跨膜結(jié)構(gòu)域(C)、磷酸化位點(diǎn)(D)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Predicted results of bovine FABP4 hydrophobicity(A),protein signal peptide(B),transmembrane structural domain(C),and phosphorylation site(D)

2.3.2 荷斯坦奶牛FABP4蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要指多肽鏈主鏈骨架中局部的構(gòu)象,對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)分析有助于認(rèn)識(shí)蛋白的空間結(jié)構(gòu)。本研究使用SOPMA軟件預(yù)測(cè)牛FABP4的二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明(圖4-A),由4種結(jié)構(gòu)組成,其中包括無(wú)規(guī)卷曲(占25.00%)、α-螺旋(占28.03%)、β-折疊(占36.36%)、β-轉(zhuǎn)角(占10.61%)。通過(guò)SWISS對(duì)FABP4的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示,其組成部分與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相符(圖4-B)。

藍(lán)色線條.α-螺旋;紅色線條.β-折疊;紫色線條.無(wú)規(guī)則卷曲;綠色線條.β-轉(zhuǎn)角。 Blue line. α-helix; Red line. β-sheet; Purple line. Random curl; Green line. β-turn.

2.3.3 FABP4的亞細(xì)胞定位 細(xì)胞可以分成多個(gè)細(xì)胞器或者細(xì)胞區(qū)域,如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體和高爾基體等,這些細(xì)胞器被稱為“亞細(xì)胞”。把確定某種蛋白質(zhì)或表達(dá)產(chǎn)物在亞細(xì)胞位置的過(guò)程稱為蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。對(duì)于蛋白質(zhì)功能研究而言,亞細(xì)胞定位是非常重要的分析內(nèi)容,蛋白質(zhì)在細(xì)胞中是流動(dòng)的,所以一個(gè)蛋白可以具有一個(gè)到多個(gè)亞細(xì)胞定位信息。本研究通過(guò)Euk-mPLOC 2.0、YLoc和MultiLoc2等在線軟件預(yù)測(cè)了FABP4蛋白的亞細(xì)胞定位。如表3所示,預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)表明,FABP4基因主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮重要功能。

表3 FABP4的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Tab.3 Predicted subcellular localization of FABP4 %

為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的真實(shí)性,分別提取了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核RNA和細(xì)胞質(zhì)RNA,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)(圖5),發(fā)現(xiàn)U6在細(xì)胞核中的含量接近60%,內(nèi)參基因GAPDH和β-actin、FABP4在細(xì)胞質(zhì)中的含量均為80%以上,上述結(jié)果表明,細(xì)胞核RNA和細(xì)胞質(zhì)RNA分離成功。此外,結(jié)果顯示,FABP4在細(xì)胞質(zhì)中的含量達(dá)80%以上,說(shuō)明FABP4基因主要分布在細(xì)胞質(zhì),推測(cè)FABP4在細(xì)胞質(zhì)中可能發(fā)揮重要功能。

圖5 FABP4在BMECs中的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of FABP4 in BMECs

2.3.4 荷斯坦奶牛FABP4核心啟動(dòng)子預(yù)測(cè) 啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游的一段核苷酸序列,是RNA聚合酶識(shí)別并與模板DNA特異性結(jié)合的部位,保證轉(zhuǎn)錄起始的精準(zhǔn)性。因此,深入細(xì)致地研究啟動(dòng)子,對(duì)于了解包括FABP4基因在內(nèi)的各種基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)調(diào)控等具有重要意義。

本試驗(yàn)選取基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG上游2 000 bp作為FABP4基因的啟動(dòng)子,利用BDGP(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)在線軟件進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)(圖6),結(jié)果顯示,共預(yù)測(cè)到FABP4基因有4個(gè)核心啟動(dòng)子區(qū),分別位于FABP4基因上游732～782 bp,1 148～1 198 bp,1 246～1 296 bp,1 710～1 760 bp。

圖6 FABP4核心啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.6 FABP4 core promoter region prediction results

2.3.5 FABP4蛋白的同源比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 利用MegAlign對(duì)多個(gè)物種FABP4氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析,結(jié)果顯示(圖7),牛FABP4與綿羊、山羊、小鼠、人、大鼠、豬、馬、雞和斑馬魚(yú)的相似性分別為93.2%,92.4%,85.6%,84.1%,83.3%,81.8%,78.8%,72.0%和47.7%,其中與斑馬魚(yú)的相似性最低僅有47.7%,與其他幾個(gè)物種有較高的相似性。使用MEGA 11構(gòu)建FABP4氨基酸序列在不同物種中的遺傳進(jìn)化樹(shù),結(jié)果表明(圖8),牛與綿羊和山羊之間的親緣關(guān)系最近,與雞和斑馬魚(yú)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。以上研究說(shuō)明,FABP4基因編碼區(qū)在物種間比較保守。

圖7 牛與不同物種FABP4氨基酸序列同源性比對(duì)Fig.7 Comparison of amino acid sequence homology between bovine and different species of FABP4

圖8 FABP4氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree of FABP4 amino acid sequences

2.3.6 牛FABP4蛋白互作預(yù)測(cè)分析及共轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè) 通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析FABP4蛋白與其他蛋白之間的關(guān)系,結(jié)果如圖9-A所示,蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中各有10個(gè)節(jié)點(diǎn),置信度為0.7(高等),線的粗細(xì)表示了數(shù)據(jù)支撐的強(qiáng)度。從圖9-A可以看出, FABP4蛋白與多個(gè)脂代謝相關(guān)蛋白(FABP1、LEP、FABP6、LIPE、LPL、PPARG、GOT2、FABP3、ADIPOQ、FABP7)存在較強(qiáng)的互作關(guān)系,推測(cè)可能在調(diào)控乳脂代謝方面扮演著重要的角色。利用CHEA3數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)以上11個(gè)基因進(jìn)行共轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè),結(jié)果如圖9-B所示,展示了對(duì)FABP4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的基因預(yù)測(cè)的共轉(zhuǎn)錄因子之間相互調(diào)控的結(jié)果,根據(jù)ENCODE ChIP-seq展示了排名前十的轉(zhuǎn)錄因子(圖9-C)。

圖9 FABP4蛋白互作、共轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.9 FABP4 protein interactions,co-transcription factor prediction results

2.4 FABP4在泌乳中期荷斯坦奶牛不同組織間的表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果顯示(圖10),FABP4在7個(gè)組織中均有表達(dá),以小腸組織作為對(duì)照,FABP4在乳腺組織中表達(dá)水平最高,與其他組織差異顯著,其他組織之間的表達(dá)量差異不顯著,提示FABP4在乳腺組織中發(fā)揮重要作用。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。The difference lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

作為脂質(zhì)伴侶的FABPs,其功能大多的研究集中在3個(gè)主要的方面,一是在大多數(shù)細(xì)胞中其含量與FA代謝率呈正比[10],它可以主動(dòng)促進(jìn)脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞的特定區(qū)域。其次,FABPs參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用,包括膜和細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用[11]。第三,FABPs通過(guò)將脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)胶耸荏w,例如過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-ac-tivated receptor,PPAR)來(lái)介導(dǎo)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性,從而參與組織和細(xì)胞中脂質(zhì)傳感和反應(yīng)機(jī)制的調(diào)節(jié)[12]。牛的FABP4由133個(gè)氨基酸組成,在6—32個(gè)氨基酸,包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域脂質(zhì)運(yùn)載蛋白,它能運(yùn)輸小的疏水性分子,如脂質(zhì)、類維生素A、類固醇激素和膽汁素等[13-14]。FABP4蛋白主要存在于脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中,負(fù)責(zé)脂肪組織對(duì)脂肪酸的吸收和儲(chǔ)存,通過(guò)調(diào)節(jié)負(fù)責(zé)脂質(zhì)代謝基因的表達(dá),對(duì)維持正常代謝和機(jī)體的能力平衡發(fā)揮重要作用[15]。

本研究以荷斯坦奶牛FABP4為研究目標(biāo),克隆了荷斯坦奶牛FABP4基因的CDS序列,與NCBI已公布的序列比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)FABP4基因序列存在一個(gè)突變位點(diǎn),使得氨基酸序列、蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。改變后二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu)占比增加、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角占比減少。無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)是蛋白肽鏈中構(gòu)成配體、受體結(jié)合的組成部分,會(huì)受側(cè)鏈的影響改變其空間結(jié)構(gòu)[16],進(jìn)一步改變了FABP4蛋白的功能。對(duì)荷斯坦奶牛蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示,FABP4蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽剪切位點(diǎn),表明其可能不是分泌蛋白。分析FABP4氨基酸序列及遺傳進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),牛與綿羊和山羊之間的氨基酸序列相似性均90%以上,親緣關(guān)系也最近,而與雞和斑馬魚(yú)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),FABP4發(fā)育樹(shù)與生物進(jìn)化的物種樹(shù)基本一致,表明FABP4基因編碼區(qū)在物種間比較保守。這與石鵬飛等[17]的分析結(jié)果一致。FABP4亞細(xì)胞定位結(jié)果與在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致,表明FABP4基因可能主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮重要功能。而Yonekura等[18]對(duì)2種基因型的FABP4進(jìn)行了核定位,研究結(jié)果存在差異,他們認(rèn)為FABP4的核定位存在基因型依賴性差異,即FABP4V/V和I/I的核定位不同,造成這一原因是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子配體與FABP4的脂肪酸結(jié)合袋的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致含核轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)區(qū)域發(fā)生輕微改變,從而使FABP4進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),故FABP4的亞細(xì)胞定位還需要用更多的試驗(yàn)研究去證實(shí)。利用STRING預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),FABP4蛋白與FABP1、LEP、FABP6和PPARG等10種蛋白存在較強(qiáng)的互作關(guān)系,其中FABP1能夠激活PPARα,啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄,活化后的PPARα可正反饋調(diào)節(jié)FABP1,使FABP1表達(dá)量增加[19-20]。FABP3已被證明是與家畜肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat,IMF)含量相關(guān)的候選基因[20-21]。Wei等[22]的研究表明,FABP4通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因(如ADIPOQ、LEP和LEPR)在脂肪沉積和代謝綜合征中起作用。Bao等[23]通過(guò)綜合轉(zhuǎn)錄組的研究發(fā)現(xiàn),受lncRNA調(diào)控的LIPE、ADIPOQ等可能通過(guò)AMPK信號(hào)通路使藏羊肌內(nèi)脂肪沉積含量降低。以上研究均表明,與FABP4互作的蛋白是與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的蛋白,進(jìn)一步推測(cè)FABP4在奶牛乳脂代謝中也發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。共轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)到SREBP1轉(zhuǎn)錄因子參與到FABP4基因的表達(dá),與Li等[24]的研究結(jié)果一致,SREBP1可能是調(diào)控牛FABP4基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。qRT-PCR結(jié)果表明,FABP4基因在泌乳中期的荷斯坦奶牛各個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá),FABP4在乳腺組織中高表達(dá),顯著高于其他組織(小腸、肝臟、心臟、子宮、腎臟、卵巢),其他組織之間差異不顯著。在肝臟組織中的表達(dá)量最低,幾乎可以忽略,這與Attal等[25]的研究結(jié)果一致,FABP4通常不在肝臟中表達(dá)。Marchitelli等[8]的研究發(fā)現(xiàn),FABP4對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸有正調(diào)控,對(duì)中鏈脂肪酸有負(fù)調(diào)控,并表明FABP4是影響乳脂組成最重要的基因。Zhou等[26]的研究表明,FABP4影響奶牛的產(chǎn)奶量和乳蛋白的含量。這暗示了FABP4在奶牛泌乳過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

本研究利用荷斯坦奶牛乳腺組織,克隆了FABP4基因的CDS區(qū)。對(duì)FABP4基因及編碼蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并通過(guò)對(duì)泌乳中期荷斯坦奶牛不同組織表達(dá)譜的分析,表明FABP4基因在乳腺組織中高表達(dá)。本研究為后續(xù)深入研究荷斯坦奶牛FABP4的生物學(xué)功能及乳脂調(diào)控機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。