于金萍,張 惟,李 琦,白鵬華,崔新儀,劉亦學(xué)

(1.天津農(nóng)學(xué)院,天津 300384;2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,天津 300381)

小麥?zhǔn)鞘澜缰饕Z食作物之一,其種植面積僅次于水稻[1]。小麥的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)、輕簡(jiǎn)化栽培及小麥品質(zhì)與國(guó)家糧食安全和社會(huì)穩(wěn)定有著密切的聯(lián)系[2-5]。近年來(lái),隨著新型耕作和施肥制度等的持續(xù)推廣,小麥田禾本科雜草發(fā)生蔓延速度加快,嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量,增加小麥種植成本[6-9]。因此,田間簡(jiǎn)化雜草防治技術(shù)的研究成為科研人員關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。

目前,麥田中闊葉雜草及部分禾本科雜草防治較為簡(jiǎn)單,使用異丙隆[10-11]、吡氟酰草胺[12]、氟噻草胺[13]和炔草酯[14]等常用麥田除草劑即可防治。但是,田間野燕麥、雀麥、節(jié)節(jié)麥和大穗看麥娘等雜草,由于和小麥親緣關(guān)系較近,基因同源性高且代謝途徑相近,使用常規(guī)麥田除草劑無(wú)法有效防除上述雜草,導(dǎo)致近年來(lái)近緣雜草蔓延迅速,逐漸成為麥田主要惡性雜草,嚴(yán)重影響小麥的生長(zhǎng),造成小麥減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)[15-18]。上述小麥近緣雜草防治困難,增加了小麥田間雜草的防治成本。因此,亟待挖掘、創(chuàng)制能夠抵御滅生性除草劑的小麥資源,輕簡(jiǎn)化小麥田間雜草有效防治技術(shù),且不影響小麥產(chǎn)量,降低小麥種植的人工投入和種植成本,增加小麥產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力。前人研究表明,咪唑乙煙酸能夠有效防治一年生禾本科雜草馬唐、稗草以及闊葉雜草蒼耳等[19];煙嘧磺隆常用于防除玉米田中一年生雜草[20]。大部分谷子栽培種及野生近緣種均不能抵御咪唑乙煙酸和煙嘧磺隆,但經(jīng)育種創(chuàng)制的冀谷32和冀谷33卻能夠有效抵御咪唑乙煙酸及煙嘧磺隆[19,21],于是在谷子種植生產(chǎn)中形成了“(抗除草劑)冀谷+除草劑”的雜草防治模式?；诳共蒌@膦bar基因和pat基因的研究與應(yīng)用,目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)、創(chuàng)制了抗草銨膦大豆、玉米、油菜、甜菜、棉花等材料[22-24],而發(fā)展“滅生性除草劑+抗除草劑作物”是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的新模式。

草銨膦(Glufosinate-ammonium)是通過(guò)抑制谷氨酰胺合成的有機(jī)磷類除草劑,能夠滅生性的殺死小麥、節(jié)節(jié)麥、燕麥、雀麥[25]等絕大部分綠色植物。因此,創(chuàng)制抗草銨膦小麥新種質(zhì)是有效控制小麥野生近緣雜草,實(shí)現(xiàn)“抗除草劑資源+草銨膦”的新型輕簡(jiǎn)化栽培技術(shù)的有效手段。創(chuàng)制材料的根本在于研究草銨膦在小麥中的代謝信號(hào)通路,挖掘關(guān)鍵基因,并利用、改造基因。目前,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)是高效挖掘相關(guān)基因的常規(guī)手段,已經(jīng)在小麥耐鹽基因挖掘、抗旱基因挖掘中發(fā)揮重要作用[26-28]。

本研究通過(guò)對(duì)草銨膦處理苗期小麥的表型鑒定,篩選用于RNA-seq樣本處理的濃度及時(shí)間。利用RNA-seq對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行分析,挖掘關(guān)鍵差異表達(dá)基因,并通過(guò)隱馬爾可夫(HMM)算法等相關(guān)生物信息學(xué)技術(shù)挖掘關(guān)鍵基因家族成員,明確該基因家族在小麥染色體中分布情況及表達(dá)模式,從而為后續(xù)解析關(guān)鍵基因功能,利用基因編輯手段改造并利用基因提供有效信息,為創(chuàng)制抗除草劑種質(zhì)資源提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及小麥植株處理

供試小麥品種為春小麥津強(qiáng)11號(hào)和冬小麥津農(nóng)6號(hào),由天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物研究所提供。小麥種子經(jīng) 75%乙醇表面消毒3～4 min,并用蒸餾水沖洗4～5次,置于有2層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中,在24 ℃黑暗條件下培養(yǎng)至萌發(fā),然后播種至盛有營(yíng)養(yǎng)土的塑料盆中(直徑10 cm),播種深度3～5 cm,每盆播種10粒,播種后轉(zhuǎn)至人工氣候箱光照培養(yǎng)(16 h光照/8 h黑暗)。

200 g/L草銨膦水劑由浙江新安化工集團(tuán)股份有限公司提供。為了篩選用于RNA-seq樣本處理的濃度及時(shí)間,利用草銨膦于小麥植株三葉一心時(shí)進(jìn)行莖葉噴霧處理。草銨膦使用濃度選取市場(chǎng)推薦用量(1 740 g/hm2)的1倍濃度(1×,1 740 g/hm2)、2倍濃度(2×,3 480 g/hm2)、3倍濃度(3×,5 220 g/hm2)和4倍濃度(4×,6 960 g/hm2),兌水量為450 L/hm2,在處理的0,3,9,12 h進(jìn)行小麥的表型觀察。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

應(yīng)用TIANGEN公司RNA提取試劑盒(DP762-T1A)提取總RNA,由上海派森諾生物科技有限公司采用Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)處理與質(zhì)控樣品經(jīng)過(guò)上機(jī)測(cè)序,得到圖像文件,由測(cè)序平臺(tái)自帶軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)化,生成FASTQ的原始數(shù)據(jù)(Raw Data),即下機(jī)數(shù)據(jù)。對(duì)每個(gè)樣品的Raw Data分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì),包括樣品名、Q20、模糊堿基所占百分比。測(cè)序數(shù)據(jù)包含一些帶接頭、低質(zhì)量的reads,這些序列會(huì)對(duì)后續(xù)的信息分析造成很大的干擾,因此需要對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步過(guò)濾。數(shù)據(jù)過(guò)濾的標(biāo)準(zhǔn)主要包括:①采用Cutadapt去除3′端的接頭,去除的部分與已知接頭有至少10 bp Overlap;②去除平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于Q20的reads。

1.3 比對(duì)分析

使用TopHat2的升級(jí)版HISAT2(https://daehwankimlab.github.io/hisat2/)軟件將過(guò)濾后的reads比對(duì)到參考基因組(https://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)上,采用基因覆蓋均一度、飽和度分析對(duì)測(cè)序質(zhì)量以及測(cè)序數(shù)據(jù)量進(jìn)行評(píng)估。

1.4 表達(dá)量分析

使用HTSeq(0.9.1)統(tǒng)計(jì)比對(duì)到每一個(gè)基因上Read Count值,作為基因的原始表達(dá)量。reads計(jì)數(shù)與基因的真實(shí)表達(dá)水平,以及基因的長(zhǎng)度和測(cè)序深度呈正相關(guān)。為了使不同基因、不同樣本間的基因表達(dá)水平具有可比性,采用FPKM(Fragments Per Kilo bases per Million fragments)對(duì)表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,FPKM是每百萬(wàn)片段中來(lái)自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的片段數(shù)目,對(duì)于Pair-End測(cè)序,每個(gè)Fragments會(huì)有2個(gè)reads,FPKM只計(jì)算2個(gè)reads能比對(duì)到同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的Fragments數(shù)量。

1.5 差異表達(dá)基因分析

轉(zhuǎn)錄組主要目的是尋找不同比較組之間的差異基因,以揭示導(dǎo)致比較組之間不同的分子機(jī)制。采用 DESeq(1.39.0)軟件包對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行差異分析[29],篩選差異表達(dá)基因條件為:表達(dá)差異倍數(shù)|log2FoldChange|>1,顯著性P-value<0.05。

1.6 生物信息學(xué)分析

用DNAman 8.0進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)[30];通過(guò)HMMER(https://www.ebi.ac.uk/Tools)預(yù)測(cè)氨基酸結(jié)構(gòu)域,采用HMM算法通過(guò)HMMER軟件進(jìn)行全家族成員調(diào)取,并使用mapchart進(jìn)行染色體定位可視化[31],使用TBtools進(jìn)行序列統(tǒng)計(jì)分析及可視化[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 草銨膦處理苗期小麥表型鑒定

由圖1可知,隨著草銨膦溶液濃度升高,小麥葉片受到脅迫逐漸增強(qiáng)。葉片出現(xiàn)萎蔫、失綠等壞死癥狀的時(shí)間隨濃度升高而縮短。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),小麥幼苗逐漸死亡。在1×、2×和3×草銨膦溶液處理下,藥后3,9 h小麥表型變化差異不大。4×草銨膦溶液處理后3,9 h的表型差異明顯,12 h下葉片均枯萎。由于干枯死亡的葉片RNA含量少,且完整性差,不適宜進(jìn)行RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,因此,選擇4×草銨膦溶液處理小麥0,3,9 h后的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,挖掘與草銨膦脅迫密切相關(guān)的基因。

2.2 草銨膦脅迫基因挖掘

由于冬小麥種植面積遠(yuǎn)高于春小麥,因此,選用冬小麥津農(nóng)6號(hào)進(jìn)行基因挖掘研究。以草銨膦處理前(0 h)的小麥幼苗為對(duì)照,對(duì)處理3,9 h的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析。結(jié)合小麥基因組注釋信息,發(fā)現(xiàn)TraesCS4A02G044000基因在草銨膦處理津農(nóng)6號(hào)后受到誘導(dǎo),上調(diào)表達(dá)顯著;該基因表達(dá)量在草銨膦處理3,9 h后分別提升4.3,16.7倍(圖2),且持續(xù)增加,說(shuō)明該基因在抵御草銨膦脅迫過(guò)程中起到重要作用。

進(jìn)一步序列分析表明,TraesCS4A02G044000基因長(zhǎng)度為1 975 bp,位于小麥第4同源群A基因組。TraesCS4A02G044000定位于4A上的36 611 408～36 614 890 bp的反義鏈上(表1)。該基因存在1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子,編碼序列長(zhǎng)度1 155 bp,能夠編碼長(zhǎng)度為384 aa的蛋白(圖3-A)。蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明,該基因編碼的蛋白存在1個(gè)信號(hào)肽、1個(gè)DUF568結(jié)構(gòu)域和1個(gè)b561結(jié)構(gòu)域。DUF568結(jié)構(gòu)域位于88～186 aa,功能未知;b561結(jié)構(gòu)域位于204～333 aa,參與細(xì)胞色素形成(圖3-B)。

表1 TraesCS4A02G044000家族成員Tab.1 Family members of TraesCS4A02G044000

A.TraesCS4A02G044000基因序列結(jié)構(gòu)圖;B.TraesCS4A02G044000基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域(蛋白結(jié)構(gòu)域由信號(hào)肽、DUF568、b561組成)。A. Sequence structure of TraesCS4A02G044000; B. Protein domain of TraesCS4A02G044000 encoded (protein domain consists of signal peptide, DUF568 and b561).

2.3 TraesCS4A02G044000及其家族成員分析

由以上分析可知,TraesCS4A02G044000基因編碼的氨基酸含有1個(gè)DUF568結(jié)構(gòu)域和1個(gè)b561結(jié)構(gòu)域,需在小麥基因組挖掘該基因所在家族的全部成員中既含有DUF568結(jié)構(gòu)域也含有b561結(jié)構(gòu)域的基因。結(jié)果在小麥中發(fā)現(xiàn)了34個(gè)含有DUF568結(jié)構(gòu)域的基因,55個(gè)含有b561結(jié)構(gòu)域的基因,其中,12個(gè)基因成員同時(shí)含有DUF568結(jié)構(gòu)域和b561結(jié)構(gòu)域。

進(jìn)一步分析12個(gè)成員在染色體的位置,發(fā)現(xiàn)該家族成員位于第4,5,7同源群,TraesCS4A02G044400等6個(gè)成員來(lái)自第4同源群,TraesCS5A02G278800等3個(gè)成員來(lái)自第5同源群,TraesCS7A02G255600等3個(gè)成員來(lái)自第7同源群(表1)。

2.4 TraesCS4A02G044000及其家族成員進(jìn)化分析

聚類分析表明,上述12個(gè)成員分別屬于4個(gè)基因,TraesCS4D02G265500、TraesCS4B02G265500、TraesCS4A02G044400為1個(gè)基因在A、B、D染色體的同源基因;TraesCS4D02G265000、TraesCS4B02G265100、TraesCS4A02G044000屬于同一個(gè)基因;TraesCS7B02G152000、TraesCS7A02G255600、TraesCS7D02G254000屬于同一個(gè)基因;TraesCS5B02G278100、TraesCS5D02G285700、TraesCS5A02G278800屬于同一個(gè)基因。通過(guò)差異表達(dá)基因分析篩選出的草銨膦脅迫處理小麥幼苗后上調(diào)基因?yàn)門(mén)raesCS4A02G044000,其位于第4,5,7同源群的聚類在一起,與第4同源群的另外1個(gè)基因關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(圖4)。

圖4 TraesCS4A02G044000及其家族成員聚類分析Fig.4 Cluster analysis of TraesCS4A02G044000 family members

為了進(jìn)一步研究3組同源基因群是否受到草銨膦脅迫處理的影響,分析了12個(gè)基因在草銨膦脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn),位于第4同源群A、B、D染色體的TraesCS4D02G265000、TraesCS4B02G265100和TraesCS4A02G044000基因在草銨膦脅迫處理下顯著上調(diào)表達(dá),說(shuō)明該3個(gè)基因表達(dá)量受到草銨膦脅迫誘導(dǎo)顯著,參與了小麥耐草銨膦脅迫(圖5)。

圖5 TraesCS4A02G044000家族成員在草銨膦脅迫處理下的基因表達(dá)模式分析Fig.5 Gene expression pattern analysis of TraesCS4A02G044000 family members under glufosinate-ammonium stress

3 結(jié)論與討論

小麥?zhǔn)钱愒戳扼w植物,基因組大而且復(fù)雜,重復(fù)序列多[33]。因此,從小麥自身研究出發(fā),通過(guò)草銨膦脅迫處理,比較不同時(shí)間處理后的差異表達(dá)基因,揭示小麥參與草銨膦脅迫的特定分子機(jī)制,為進(jìn)一步篩選抗草銨膦相關(guān)基因提供理論依據(jù)。本研究篩選出用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的草銨膦處理苗期小麥的濃度(4×,6 960 g/hm2)和時(shí)間(0,3,9 h),對(duì)轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理、篩選后發(fā)現(xiàn),TraesCS4A02G044000基因受到草銨膦脅迫的顯著誘導(dǎo);在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析了該基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域,并用保守結(jié)構(gòu)域調(diào)取小麥中的全家族成員,進(jìn)而分析該家族在抗草銨膦中的潛在作用。

結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),從該基因家族中調(diào)取的12個(gè)成員都存在DUF568結(jié)構(gòu)域和b561結(jié)構(gòu)域。DUF568結(jié)構(gòu)域在植物中功能未知,可在今后重點(diǎn)研究,從而解析該結(jié)構(gòu)域如何在抗草銨膦中發(fā)揮作用。前人研究表明,細(xì)胞色素b561在植物中成員眾多[34],b561結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞色素b561(Cyt B561)的典型結(jié)構(gòu)域,細(xì)胞色素b561是高等植物的質(zhì)膜(PM)中存在一種特定的高電位、抗壞血酸還原的b型細(xì)胞色素[35-36]。研究表明,細(xì)胞色素b561可能構(gòu)成了一類新的跨膜電子傳遞蛋白,存在于多種真核細(xì)胞中[37]。位于細(xì)胞膜上的膜蛋白,在跨膜信號(hào)傳遞過(guò)程中扮演著不可或缺的角色,可感受外界刺激并將此刺激向細(xì)胞內(nèi)部傳遞,從而調(diào)控植物響應(yīng)外界的環(huán)境刺激。草銨膦的作用機(jī)理之一是促進(jìn)銨離子大量累積,導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)外離子平衡遭到破壞[38]。因此,基于b561可能構(gòu)成新的跨膜電子傳遞蛋白的潛在功能和草銨膦引起的離子濃度失衡,本研究推測(cè)噴施草銨膦的植株某些跨膜傳導(dǎo)系統(tǒng)受到了一定的破壞。因而,電子信號(hào)傳遞的重要因子細(xì)胞色素b561可能在抵御草銨膦中發(fā)揮作用,或者是草銨膦破壞了電子信號(hào)傳導(dǎo),從而引發(fā)了細(xì)胞色素b561編碼基因表達(dá)水平的改變。因此,無(wú)論細(xì)胞色素b561和草銨膦是何種關(guān)系,細(xì)胞色素b561都可能是調(diào)節(jié)植物抵御草銨膦脅迫的重要候選因子,可通過(guò)基因編輯,敲除細(xì)胞色素b561編碼基因,深入研究該因子的功能。

通過(guò)基因表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),位于第4同源群A,B,D染色體的TraesCS4D02G265000、TraesCS4B02G265100和TraesCS4A02G044000基因在草銨膦脅迫下顯著上調(diào),說(shuō)明該3個(gè)基因表達(dá)量受到草銨膦脅迫誘導(dǎo),參與小麥耐草銨膦脅迫。上述12個(gè)基因家族成員,是否存在功能冗余,或成員之間是否協(xié)同發(fā)揮作用還未可知。目前,隨著小麥泛基因組及大量重測(cè)序數(shù)據(jù)的公布,在今后明確上述基因具體功能的基礎(chǔ)上,研究基因的自然變異情況,在育種中深度利用優(yōu)異等位基因,從而利于抗草銨膦育種水平的提升;實(shí)現(xiàn)滅生性除草劑在小麥田間控制小麥野生近緣雜草,從而解決小麥田禾本科雜草控制難,生產(chǎn)成本高的現(xiàn)狀。