蔡 靜,曾巧煌,歐曉敏,江 巍,3,呂渭輝,3,藍濤華,3

辨證論治在診斷、治療心血管疾病,改善生活質量,維持心功能,降低再住院率方面有一定的優(yōu)勢。中醫(yī)證候客觀化是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究進程中遇到的問題,將病證結合動物模型應用于中醫(yī)藥研究,從形態(tài)、功能等多方面闡述中醫(yī)藥治療的效果與原理,揭示中醫(yī)證候的本質。因此建立一套既符合中醫(yī)辨證理論,又具有穩(wěn)定性、針對性及客觀性的病證結合動物模型的評價體系,以期為中醫(yī)心病濕證動物模型的構建及中醫(yī)心病濕證研究提供思路,最終達到為臨床服務的目的。 為深入探討中醫(yī)藥在心血管疾病領域的作用機制,病證結合動物模型的構建及客觀化評價是前提,建立及評價中醫(yī)心病濕證證候客觀化是研究關鍵?？偨Y歸納中醫(yī)心病濕證的微觀診斷指標、證候定量診斷、與他證的鑒別診斷等,探索心病濕證候的本質及穩(wěn)定可靠的生物模型,可為中醫(yī)藥客觀化現(xiàn)代化研究提供依據。綜述冠心病、高血壓、心力衰竭3個心血管常見疾病探討中醫(yī)心病濕證的客觀化進展。

1 中醫(yī)心系疾病與濕邪

心系疾病病因病機復雜,歷代醫(yī)家對心系疾病病因病機及治療進行了探索。古代醫(yī)家早已意識到濕邪在心系疾病中的重要作用,《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》中指出胸痹心痛的病機為“陽微陰弦”,陽微為本,為胸陽不足,陰弦為標,指陰寒痰濕偏盛?！稖夭l辨》中提到胸痹心痛的病機為“肺水克心”,“肺水”指外來濕邪,“克心”指克制心火,即病機為外濕抑制胸陽,胸陽不振發(fā)為胸痹心痛?！稘健ん@悸怔忡健忘門》中亦有“風寒冷濕閉塞諸經,令人怔忡”的記載?，F(xiàn)代發(fā)現(xiàn),六淫之濕具有病因、病理的雙重意義,濕邪作為致病物質或致病條件,是物質性、條件性與某些人體反應性的綜合概念,六淫致病的臨床表現(xiàn)包含了體質、病種、致病因素等的綜合作用[1]。

從濕論治、從脾論治心系疾病的方式方法及相關中藥方劑療效顯著?！督饏T要略·胸痹心痛短氣病脈證治》中記載了通陽化濕代表方劑栝蔞薤白半夏湯、枳實薤白桂枝湯、茯苓杏仁甘草湯;調脾胃以化濕代表方劑橘皮枳實生姜湯、人參湯及溫腎化濕的薏苡附子散等?！短交菝窈蛣┚址健酚涊d二陳湯通過化濕理脾治療痰濕所致的心悸。王守富等[2]從痰濕論治冠心病心絞痛,結果顯示,六君子湯或參苓白術散加減、逍遙散合半夏厚樸湯加減、理中丸合二陳湯、參附湯、冠心Ⅱ號合瓜蔞薤白半夏湯或《壽世保元雙合湯》加減、小陷胸湯合溫膽湯加減等補氣、行氣、溫陽、活血、清熱化痰之法。由此可見,在心系疾病病因病機及治療方式的探索中,濕邪致病、從濕論治及濕證證候客觀化是中醫(yī)心系疾病研究的關鍵。

2 中醫(yī)心系疾病濕證證候客觀化的研究現(xiàn)狀

證候是中醫(yī)治療的核心,準確辨出濕證是“對證下藥”的前提,“異病同治”關鍵在于對證的準確把握。中醫(yī)理論的辨證具有多樣性,證與證之間既交叉又獨立,準確評價濕證尤為重要。

2.1 濕證的生物學模型及客觀指標 系統(tǒng)生物學的不斷發(fā)展為中醫(yī)病證結合研究帶來了新思路和技術手段,中醫(yī)傳統(tǒng)理論結合現(xiàn)代醫(yī)學研究方法從組織、分子、免疫等方面探討中醫(yī)心病濕證的客觀化發(fā)展。其中生物學模型的構建與科學評價、生物標志物研究尤其重要,且因臨床上濕證辨證多樣,濕證動物模型的造模方法復雜,現(xiàn)模擬臨床病因病機建立的濕證病證結合動物模型進行分析、歸納和總結。

2.1.1 單因素造模 李蓉[3]將昆明小鼠置于人工氣候箱中飼養(yǎng),其余時間按常規(guī)室溫飼養(yǎng),連續(xù)觀察7 d;模型組小鼠出現(xiàn)體重下降、腸道菌群失調、小腸炎性反應、組織結構紊亂、水液代謝障礙、免疫系統(tǒng)紊亂等多方面改變,符合外感寒濕致病的病理表現(xiàn)。章敏[4]將Wistar大鼠置于人工氣候箱中飼養(yǎng),每日刺激8 h,持續(xù)觀察30 d;觀察到腸道菌群數量隨著濕度升高而增加,如金黃色葡萄球菌、鏈球菌、軍團桿菌、大腸桿菌及真菌數量;同時,具有致病性的大腸桿菌數量增加,對機體有益的雙歧桿菌減少;出現(xiàn)機體免疫功能紊亂、胃腸激素失調、胃泌素減少,大鼠腎臟水通道蛋白2(AQP2)mRNA減少的情況。

2.1.2 復合因素造模 將復合因素造模法模擬臨床濕證病因病機的動物模型進行分析、歸納和總結。

2.1.2.1 濕熱證生物模型的評價指標 程方平等[5]采用新西蘭兔和Wistar大鼠造模,人工氣候箱模擬外濕,每次灌服54 °白酒5 mL+油脂10 mL/(2 kg·d)模擬內濕,灌服大腸桿菌模擬客邪,造濕溫病模型;可見高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)增高。譚永振[6]采用SD大鼠構造濕偏重組與熱偏重組模型,可見大鼠尿液中AQP2、p物質(SP)70升高,胃竇勻漿胃竇SP及生長抑素(SS)含量降低,同時胃、十二指腸病理切片顯示,胃黏膜層有大量中性粒細胞、嗜酸性粒細胞浸潤,血管擴張充血,胃黏膜下層可見組織水腫,中性粒細胞、嗜酸性粒細胞浸潤明顯,十二指腸可見絨毛上皮細胞脫落、大量炎性細胞滲出。有研究使用人工氣候箱建立正常、濕和濕熱3種不同溫度和濕度的環(huán)境,結果顯示,飼養(yǎng)在濕熱環(huán)境中的小鼠接觸流感病毒時表現(xiàn)出免疫耐受性,身體無法有效清除病毒,導致持續(xù)感染,說明溫暖、潮濕的環(huán)境可能干擾了免疫反應和平衡[7]。有研究顯示,高濕、高溫環(huán)境導致體內炎性細胞因子表達升高,造成Th17/Treg免疫失衡,抑制Treg成熟和分化,增加白細胞介素(IL)-2、IL-6等細胞因子表達,降低γ干擾素(IFN-γ)和IL-17A表達[8]。王婷等[9]將BALB/c小鼠置于人工氣候箱中模擬濕熱環(huán)境,灌胃致脾虛;腹腔注射脂多糖(LPS)工作液完成濕熱模型造模,結果顯示,INF-γ、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平均出現(xiàn)升高;濕熱模型腸道菌群含量出現(xiàn)不同程度增加;以脾陽虛為內濕基礎的濕熱證,雙歧桿菌屬、乳桿菌屬含量減少,濕邪困擾為內濕基礎的濕熱證雙歧桿菌屬、乳桿菌屬含量增多。

2.1.2.2 脾虛濕困生物模型的評價指標 朱壽光[10]強迫SD大鼠游泳15 min后灌胃液態(tài)豬油,灌蜂蜜模擬內濕模型;胃泌素水平和胃壁黏液量下降,胃腸推進運動明顯減弱,小腸推進出現(xiàn)斷續(xù)現(xiàn)象,全血5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚醋酸(5-HIAA)含量及血清Na+-K+-三磷酸腺苷(ATP)酶降低。趙麗等[11]單日施加豬油脂,雙日上午在跑步機上跑步約30 min,以汗出喘息為止,下午喂飼甘藍進行造模;結果顯示,丙二醛和CD指標升高,過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)下降,上述物質可能作為客觀評價指標。劉偉[12]將SD大鼠置于人工氣候箱中模擬外濕條件,給予單日禁食聯(lián)合4 ℃冰水灌胃,雙日給予充足飼料并給予豬油灌胃+4 cm水深,控制睡眠8 h造濕證模型;結果顯示,脾虛濕困大鼠臟器系數增加,血清電解質水平紊亂,代謝異常,胰島素水平下降;脾臟及胸腺臟器系數降低,胸腺皮質厚度及脾臟中央動脈淋巴鞘直徑、面積變小,血清IL-6升高,IgG含量減少;運用反證藥物平胃散治療該模型說明大鼠脾虛濕困造模成功。有研究顯示,利用8周的時間建立60只高脂飲食和力竭游泳的脾虛水濕證Wistar大鼠模型,貢獻基因主要集中在Fabp、SLC和AQP家族,即蛋白質和多糖的組成對脾虛水濕證模型大鼠水液轉運的調節(jié)作用顯著[13]。

2.1.3 濕證證候組學研究 系統(tǒng)生物學的研究方法與中醫(yī)整體概念的理論內涵相似,為中醫(yī)和現(xiàn)代醫(yī)學提供了重要方法。通過代謝、蛋白、基因、轉錄等方面,探討證候的生物學基礎,為證候的可分離性提供了生物學依據。將SD大鼠置于人工氣候箱模擬的高溫高濕環(huán)境中,除正常飲食外,濕阻證大鼠每日給予蜂蜜、豬油;采用濕阻證大鼠臟器組織等蛋白的半定量實時熒光聚合酶鏈式反應(RT-PCR)測定熱休克蛋白,說明高溫高濕環(huán)境為濕熱證而非暑濕證;同時結果顯示,濕證大鼠腎、脾、胃組織中ATP儲存量減少,提示氧化應激、膜完整性、黑色素生物合成、離子通道活性和ATP代謝可能是濕證的標志[14-15]。臨床研究顯示,嚴格按照《治療血脂異常的中藥新藥臨床研究指導原則》篩選脾腎陽虛證與痰濕阻滯證病人,比較臨床指標總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、HDL-C,并與健康對照組相比,脾腎陽虛血脂異常病人和痰濕阻滯證血脂異常病人,差異有統(tǒng)計學意義;脾腎陽虛血脂異常病人、痰濕阻滯證血脂異常病人與健康對照組、痰濕阻滯證與脾腎陽虛血脂異常病人氨基酸代謝、脂代謝、碳水化合物代謝比較,差異有統(tǒng)計學意義;與脾腎陽虛病人相比,痰濕阻滯病人血脂異常代謝途徑不同:①丙酮酸代謝途徑;②甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑;③谷氨酰胺和谷氨酸代謝途徑;④丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑;⑤TG代謝途徑[13]。

2.2 濕證復合素造模情況(見表1)

表1 濕證復合素造模情況

3 中醫(yī)心系疾病濕證證候的研究現(xiàn)狀

病的概念反映了某一種疾病全過程的總體屬性、特征和規(guī)律;證是疾病過程中某一階段的病理概括,包括病變的部位、原因、性質、正邪關系,因而證較癥狀可全面、深刻、準確地揭示疾病的本質。病與證均能反映疾病的本質,病證結合的內涵既體現(xiàn)在中醫(yī)現(xiàn)代化的進程。現(xiàn)代醫(yī)學的飛速發(fā)展使人們對疾病微觀探索掌握更加明確,病證結合將促進中西醫(yī)結合。中醫(yī)心系疾病濕證證候客觀化現(xiàn)狀見表2。

表2 中醫(yī)心系疾病濕證證候客觀化現(xiàn)狀

3.1 冠心病 有研究顯示,冠心病在不同地區(qū)病性要素占比不同,南方、北方、西北地區(qū)頻數居前3位的病性要素為血瘀、氣虛、痰濁,且近20年冠心病的常見證候依次為血瘀、氣虛、痰濁,與現(xiàn)代臨床對冠心病“本虛標實”的認知[17]基本一致。冠心病濕證客觀化臨床研究主要從“辨證”即診斷客觀化與“論治”即療效評價客觀化著手。

3.1.1 冠心病濕證客觀化的臨床研究 曲淼[18]研究顯示,氣滯痰阻證多在冠心病發(fā)作期,在冠心病痰阻心脈證臨床診斷方面除四診合參外,一些實驗檢測指標如RDW、HDL-C水平降低,hs-CRP、TC、TG、LDL-C水平升高可作為冠心病中醫(yī)辨證的客觀參考[19]。楊一格[20]從冠心病痰證病人AGEs出發(fā),發(fā)現(xiàn)病人血清AGEs及AGEs受體(RAGE)水平增加,相關基因RAGE mRNA和Fox1 mRNA表達水平更高;冠心病痰濁內阻證病人從濕辨治發(fā)現(xiàn),治療組心絞痛癥狀、中醫(yī)證候療效、心電圖療效及血液流變學改善的總有效率高于對照組。朱璞玉等[21]研究發(fā)現(xiàn),冠心病痰證病人轉化生長因子-β1(TGF-β1)-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-糖胺聚糖(GAG)通路可能是痰病變的特征信息,其中TGF-β1與生痰因子相關,而GAG和蛋白聚糖(versican)可能為“痰”的物質基礎。何浩強[22]研究顯示,冠心病穩(wěn)定型心絞痛痰瘀互結證病人存在代謝組學差異表達,其通路與生物功能和氨基酸代謝、甘油磷脂代謝和類固醇激素生物合成相關;多組學聯(lián)合研究發(fā)現(xiàn)趨化因子8(CXCL8)、CCL2、集落刺激因子-1(CSF1)、Serpin家族D成員1(SERPIND1)可作為生物標志物,提示免疫反應是冠心病穩(wěn)定型心絞痛痰瘀互結證發(fā)生發(fā)展的生物學基礎之一。朱明丹等[23-24]通過血漿代謝組學發(fā)現(xiàn),冠心病痰濁阻滯證與能量代謝、脂質代謝、糖代謝、氨基酸代謝紊亂密切相關,其生物標志物可能是葡萄糖、花生四烯酸、亞油酸等代謝產物。張紅栓[25]研究冠心病痰濁證與血瘀證的區(qū)別,其中痰濁證病人尿液中檸檬酸、α-酮戊二酸、順式-烏頭酸等含量較高,膽汁酸、組氨酸含量較低。張秀梅[26]對比痰濕瘀阻型及非痰濕瘀阻型冠心病病人血管緊張素轉換酶(ACE)基因多態(tài)性分布,結果顯示,痰濕瘀阻型DD基因型及D等位基因分布頻率高,可能是冠心病中醫(yī)辨證分型的基礎物質。

3.1.2 冠心病濕證客觀化的基礎研究 高杉等[27-29]分別對Wistar雄性大鼠及載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠建立冠心病痰瘀互結證模型并進行評價,采用高脂飼料聯(lián)合結扎冠狀動脈左前降支建立模型;使用心肌酶指標、血流變指標、血小板聚集指標評價模型;將模型用于發(fā)病機制的探討,結果顯示,大鼠心肌細胞蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)和Bcl-2蛋白下調,促凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白上調,激活PI3K/Akt通路,促進細胞凋亡。繼高脂喂養(yǎng)小型豬結合冠狀動脈球囊損傷左冠狀動脈前降支建立病證結合模型研究之后,有研究進行了方證分析,比較方證不相應的生脈膠囊,與痰瘀互結證對證的丹蔞片,結果顯示,丹蔞片可降低血脂代謝,縮小心肌梗死面積,降低主癥和兼癥評分等[30]。除對生物標志物分析外,方證相應可能對證候客觀化診斷、模型評價亦有一定的說服力。

3.2 心力衰竭濕證診斷的客觀化 Zhou等[31]收集了208例心力衰竭住院病人的臨床資料,總結中醫(yī)證候特點,結果顯示,痰濁證LVEF檢出率為50%,水濕阻滯組NT-proBNP較高。從證型分布與心功能分級方面分析,Miao等[32]分析134例慢性心力衰竭病人,結果顯示,中醫(yī)證型以氣虛血瘀型、痰瘀交織型、氣陰虛型、內濕熱滯型和陽虛型為主,證型分布與紐約心臟病協(xié)會(NYHA)心功能分級有關。Shi等[33]通過回顧分析1 036例病人,將慢性心力衰竭的證與NYHA心功能分級聯(lián)系起來,進一步發(fā)現(xiàn)與Ⅰ級、Ⅱ級病人相比,Ⅲ級、Ⅳ級病人陽虛、水濕發(fā)生率較高,痰濁發(fā)生率較低。Li等[34]回顧性分析1 451例慢性心力衰竭病人,結果顯示,男性病人以痰阻心脈氣虛血瘀證多見,女性病人多見心血瘀阻氣陰虛證。姜坤[35]收集并整理冠心病合并心力衰竭4個臨床階段的中醫(yī)四診信息和實驗室指標,結果顯示,心力衰竭濕阻氣結證與室壁瘤呈正相關,與竇性心動過速、白細胞降低、心室容量升高、平板運動耗氧量>20 mL/(min·kg)、實際碳酸氫根<21.3呈負相關[5]。

3.3 高血壓

3.3.1 高血壓濕證客觀化的臨床研究 有研究顯示,高血壓中醫(yī)辨證分型與動脈血流動力學有關,痰濕內阻病人動脈血流動力減慢;痰濕內阻大腦中動脈、大腦前動脈血管脈搏指數高于其他證型[36]。薛文靜[37]研究顯示,原發(fā)性高血壓痰濕壅盛證病變程度與ROCKⅡ、NF-κB p65和ROCKⅡ mRNA呈正相關,且與ROCKⅡ密切相關。葛明立[38]研究顯示,載脂蛋白ε4等位基因可能與痰濕壅盛證具有一定的相關性。Zhang等[39]綜合了痰濕綜合征高血壓病人體重變化整合蛋白質組學和代謝組學分析,公認的生物標志物磷脂酰膽堿(PC)、補體C3、C4a/C4b、α-2-巨球蛋白(A2M)和抗凝血酶(SERPINF1)是病人體重變化的強有力預測因子。吳天敏等[40]通過比較原發(fā)性高血壓痰濕壅盛型的相關指標,可見乳酸、絲氨酸、葡萄糖、蛋氨酸、丙氨酸含量減少,氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、LDL-C、丙酮含量增多。李小兵等[41]臨床研究發(fā)現(xiàn),血清sICAM1、sVCAM1在痰濕證病人中特異性升高,二者可作為原發(fā)性高血壓痰濕證辨證的客觀指標之一。

3.3.2 高血壓濕證客觀化的基礎研究 吳賽等[42]使用Wistar大鼠高脂飲食建立痰濕壅盛型高血壓模型,可見痩素可作為評價痰濕壅盛證高血壓大鼠模型的客觀指標之一;腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的激活和高瘦素血癥在痰濕壅盛型高血壓發(fā)展過程中發(fā)揮著關鍵作用,NF-κB上調提示著機體的炎癥狀態(tài)聯(lián)合構成了本證型的分子基礎;本證型的病理機制可能與JAK2/STAT3通路、PI3K/Akt通路及NF-κB通路活化密切相關。姜凌宇等[43]采用相同的大鼠造模方法予以半夏白術天麻湯“以方測證”,結果證實,半夏白術天麻湯不僅可改善痰濕壅盛型高血壓的臨床癥狀,同時可降低血壓、血脂及改善胰島素抵抗等。姜月華等[44]利用高脂飼料喂養(yǎng)C57BL/6Cnc小鼠25周,以體質量、血壓均大于等于對照組平均值25%作為判定“痰濕壅盛型高血壓小鼠模型”成功的標準,經超高效液相色譜-質譜聯(lián)用(UPLC-MS)分析血漿代謝組變化,得出磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、L-異亮氨酸、乙酰肉堿可作為痰濕壅盛型高血壓小鼠模型的特征血漿代謝標志物;并通過京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,差異代謝物主要富集于膽堿代謝、促性腺激素釋放激素信號通路、氨基酸的合成、磷脂酶D信號途徑等及產熱、表皮生長因子受體(EGFR)信號通路、NF-κB信號通路等。

4 小結與展望

在中醫(yī)證候方面,目前多模擬病因,恒溫箱的使用模擬外濕、高脂飲食模擬內濕,結合多種力竭方式、禁食方式或藥物、生物致病因子的干預模擬脾虛。在病證結合模型的評價上,由于中醫(yī)心病濕證與病因、病理、免疫、生化、代謝等密切相關,如何將諸多因素有機結合確定其證至關重要。臨床上證的發(fā)展是動態(tài)變化的,因此評價指標也是動態(tài)變化的。從動物模型的選擇、造模時間、飲食飼料的配方、用量用法及濕證動物模型的評價指標依賴于科研、臨床經驗甚至是主觀感受。如何將科研、臨床經驗整合,形成公認、穩(wěn)定、可重復性高的濕證生物模型建模方法及公認、科學的濕證生物模型的評價體系是今后研究的方向。病證結合的客觀化研究任重而道遠,為解決這個問題提出以下建議:首先,進一步完善中醫(yī)心病濕證的量化和診斷,建立統(tǒng)一、規(guī)范的診斷標準;其次,建立重復性好、公認的生物模型,找到特異度、靈敏度高的指標進行評價,同時不局限個別指標,從多個指標變化和相互關系以評價病證結合模型;最后,從中醫(yī)整體觀與病證結合的角度進行代謝組學、蛋白質組學等的系統(tǒng)生物學研究,對參與疾病發(fā)生過程的信息物質相互關系進行深入探討,揭示中醫(yī)心病濕證的本質。