婁 萍,趙 欣,趙 穎,張 丹

川崎病是一種皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征,并發(fā)癥表現(xiàn)為冠狀動(dòng)脈和心肌損傷,主要病理改變?yōu)槿矸翘禺愋匝苎?肌原纖維斷裂及溶解,心肌細(xì)胞水腫、變性和壞死及炎性浸潤等[1]。相關(guān)研究顯示,川崎病可能與炎癥及免疫調(diào)節(jié)失衡有關(guān),由于免疫細(xì)胞的過度激活,使產(chǎn)生多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的促炎與抗炎反應(yīng)調(diào)節(jié)失衡,增強(qiáng)心臟冠狀動(dòng)脈損傷[2]。關(guān)于川崎病的臨床研究越來越多,但川崎病誘發(fā)心肌損傷的機(jī)制尚未明確。他克莫司是一種新型免疫抑制劑,通過與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)免疫親和蛋白(macrophilin)結(jié)合抑制鈣磷酸酶的活性,并調(diào)控T細(xì)胞活化,抑制肥大細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,可治療炎癥性皮膚疾病,目前他克莫司在臨床中廣泛用于器官移植和自身免疫系統(tǒng)疾病的治療[3]。酪氨酸激酶(JAKs)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子(STATs)信號(hào)通路是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑,廣泛分布于多種組織細(xì)胞,發(fā)揮特異的生物學(xué)作用,在參與機(jī)體免疫及腫瘤發(fā)展等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[4]。有研究表明,JAKs/STATs信號(hào)通路與心臟等疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,介導(dǎo)了心肌細(xì)胞生長、存活,改善心血管疾病[5]。關(guān)于他克莫司治療川崎病的研究報(bào)道較少。本研究觀察他克莫司通過激活JAKs/STATs信號(hào)通路對(duì)川崎病小鼠血管內(nèi)皮功能及心肌細(xì)胞凋亡的影響,可為臨床治療川崎病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康級(jí)小鼠40只,雌雄各半,4～6個(gè)月齡,體質(zhì)量150～240 g,購自基爾頓生物科技(上海),嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行實(shí)驗(yàn),動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(上):2019-0075,溫度15～18 ℃,濕度約為70%,每日12 h光照,喂養(yǎng)條件為自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料,飲用干凈自來水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 他克莫司(上海第一生化藥業(yè)有限公司),阿司匹林(廣州天心制藥廠),伊紅液(上海麥克林公司),白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)(上海酶聯(lián)生物科技有限公司),無水乙醇(桂林中輝科技發(fā)展有限公司),干酪乳酸桿菌菌種(重慶天圣制藥有限公司),心肌肌鈣蛋白I試劑盒、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(TUNEL)試劑盒(南京建成生物工程研究所),FEITecnai G12型透射電鏡(美國強(qiáng)生公司),切片機(jī)(上海醫(yī)用儀器廠),多普勒超聲儀(日本Nikon公司),免疫印跡化學(xué)放光底物(北京化學(xué)試劑公司)。

1.3 動(dòng)物模型建立 將干酪乳酸桿菌菌種(LCWE)接種于肉湯培養(yǎng)基中,在37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)2 d,將培養(yǎng)基以3 000×g(重力加速度),離心30 min后棄上清,沉淀加入50 g/L十二烷基硫酸鈉(SDS)過夜并裂解,以3 000×g離心裂解液30 min,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌后加RNA酶200 μg/mL混勻,37 ℃孵育2 h,離心棄上清后重復(fù)3次,再加入DNA酶200 μg/mL混勻,7 ℃孵育4 h,離心棄上清后重復(fù)3次,最后沉淀中加入胰蛋白酶200 μg/mL,37 ℃孵育4 h,離心棄上清后重復(fù)3次,以PBS將沉淀重懸,超聲破碎儀冰上破碎2 h后5 ℃,8 000×g離心1 h,上清即為LCWE。采用比色法定量,并將LCWE終濃度稀釋為1 mg/mL后,小鼠腹腔注射5 mg/kg劑量為川崎病建模成功。

1.4 動(dòng)物分組與給藥 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常組、模型組、阿司匹林組、他克莫司組,每組10只小鼠。正常組和模型組采用10 mg/kg羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃,阿司匹林組采用阿司匹林50 mg/kg灌胃,他克莫司組采用他克莫司40 mg/kg灌胃,均每日1次,連續(xù)干預(yù)10 d。

1.5 組織提取 每組選取5只小鼠進(jìn)行眼眶靜脈取血1 mL,于-80 ℃保存,用于生化指標(biāo)檢測(cè)。將小鼠麻醉后,采用脊椎脫臼法處死小鼠后,在無菌條件下迅速剪開皮膚,取出心臟后置于生理鹽水中漂洗,采用5%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定,室溫保存,制作病理切片。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)小鼠心臟功能 采用200 g/L烏拉坦腹腔注射麻醉小鼠,備皮仰臥位固定,使用頻率為7.0 MHz的探頭對(duì)小鼠進(jìn)行心臟超聲檢查,首先測(cè)量小鼠胸骨旁左心室短軸二維圖像,在乳頭肌水平位將M型取樣線與室間隔-左心室后壁連線垂直,獲得M型超聲心動(dòng)圖,采用ASE法測(cè)量小鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD),采用Teich-holtz公式計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF),LVEF(%)=[(LVEDD3-LVAWD3)/LVEDD3]×100%,其中LVAWD為左室前壁舒張末期厚度,每組原始數(shù)據(jù)取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的平均值,超聲檢查操作及分析均采用雙盲法。

1.6.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清IL-6、TNF-α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 各組小鼠眼眶取靜脈血1 mL后,以3 000 r/min離心15 min,留取上清液,在對(duì)應(yīng)孔板中加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品工作液,37 ℃恒溫孵箱孵育1 h,去板內(nèi)液體后加入50 μL生物素化抗體工作液,37 ℃恒溫孵箱孵育1 h,去板內(nèi)液體后沖洗3次,洗滌結(jié)束后每孔加100 μL辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合物工作液,37 ℃恒溫孵箱孵育30 min,取孔板反復(fù)沖洗板內(nèi)液體,洗滌結(jié)束后每孔加入100 μL底物溶液,進(jìn)行37 ℃恒溫孵箱孵育15 min,每孔加入50 μL終止液,200 nm波長處檢測(cè)OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和OD值計(jì)算IL-6、TNF-α、VEGF含量。

1.6.3 蘇木精-伊紅(HE)染色 取小鼠心臟組織樣品后經(jīng)梯度濃度乙醇脫水,再置于二甲苯中透明,之后置入石蠟中包埋。使用切片機(jī)將組織切片,切片厚度為3 μm,染色前將石蠟切片置于二甲苯中脫去石蠟,采用10%中性甲醛固定后進(jìn)行石蠟切片,依次由無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇和80%乙醇梯度脫水后再用清水沖洗,在80 ℃烤箱中烘烤15 min后置于蘇木素中染色15 min,清洗后伊紅染色3 min,70 ℃烘箱烤干后用中性樹脂封片。血管組織切片于顯微鏡下觀察后拍照。

1.6.4 TUNEL檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞凋亡率 將包埋好的心肌組織石蠟切片用冰凍機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片后進(jìn)行TUNEL染色,嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作,將冰凍切片室溫復(fù)溫30 min,使用冰丙酮固定5 min,5 ℃ PBS進(jìn)行沖洗3次,每次5 min,10%牛血清蛋白(BSA)室溫封閉15 min,加入TUNEL混合液室溫孵育1 h,5 ℃ PBS沖洗3次,每次5 min,熒光染料二脒基苯基吲哚(DAPI)核染1 min,4 ℃ PBS沖洗3次,每次5 min,切片染色后在顯微鏡下觀察,凋亡細(xì)胞核呈綠色熒光,采用Image Pro Plus 5.0軟件進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù),在500倍顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)不同的視野,在每個(gè)視野中記錄凋亡心肌細(xì)胞數(shù)及心肌細(xì)胞總數(shù),計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率,取平均值。

1.6.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá) 取小鼠心肌組織50 mg,加入0.15%胰蛋白裂解液,以4 000 r/min離心,10 min后取上清液,血清樣品中加入樣孔進(jìn)行電泳,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜TBS浸泡15 min后PBS反復(fù)沖洗,每次5 min,分別加入JAK2(1∶500)、STAT3(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶1 000),辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗(1∶2 000),分別雜交后進(jìn)行PBS沖洗,以β-actin為內(nèi)參指標(biāo),采用顯色劑進(jìn)行顯色和灰度掃描分析掃描條帶,計(jì)算JAK2、STAT3蛋白表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組超聲心動(dòng)圖改變 正常組小鼠心臟舒張功能正常、無障礙發(fā)生;模型組小鼠出現(xiàn)心臟舒張功能障礙,LVEDD增加,LVEF降低;他克莫司組LVEF有所提升,LVEDD相對(duì)減少;阿司匹林組小鼠心臟舒張功能略微緩解,LVEF、LVEDD改善。詳見圖1、表1。

表1 各組超聲心動(dòng)圖LVEDD、LVEF比較(±s)

圖1 各組超聲心動(dòng)圖改變

2.2 各組小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF含量比較 與正常組比較,模型組血清TNF-α、IL-6、VEGF含量升高(P<0.05);與模型組比較,他克莫司組血清TNF-α、IL-6、VEGF含量降低(P<0.05);與他克莫司組比較,阿司匹林組小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF含量升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF含量比較(±s) 單位:ng/mL

2.3 心肌組織HE染色 正常組小鼠心肌纖維排列整齊,細(xì)胞排列有序緊密,細(xì)胞核呈卵圓形,細(xì)胞質(zhì)鮮紅;模型組小鼠心肌纖維排列紊亂且心肌組織斷裂和溶解,間質(zhì)纖維化和組織壞死,細(xì)胞排列紊亂,出現(xiàn)水腫和壞死等,細(xì)胞核大小不均勻并有炎性浸潤;他克莫司組心肌斷裂組織及溶解有所緩解,細(xì)胞核排列趨于整齊,分布趨于有序、緊密;阿司匹林組心肌纖維排列紊亂現(xiàn)象有所緩解,部分區(qū)域仍有溶解及斷裂現(xiàn)象。詳見圖2。

圖2 各組心肌組織HE染色圖(×200)

2.4 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較 與正常組比較,模型組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與模型組比較,他克莫司組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與他克莫司組比較,阿司匹林組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。詳見圖3、表3。

表3 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較(±s) 單位:%

2.5 各組小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白比較 與正常組比較,模型組心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與模型組比較,他克莫司組心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與他克莫司組比較,阿司匹林組心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。詳見圖4、表4。

表4 各組小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白比較(±s)

圖4 各組JAK2、STAT3蛋白表達(dá)條帶圖

3 討 論

川崎病是一種免疫介導(dǎo)的急性全身疾病,免疫系統(tǒng)的高度活化和免疫損傷性血管炎是川崎病的特點(diǎn)[6]。他克莫司屬鈣調(diào)蛋白磷酸酶抑制劑,其免疫抑制作用機(jī)制與環(huán)孢素A相似,可介導(dǎo)內(nèi)皮功能,并抑制病灶部位新生血管生成[7]。細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的細(xì)胞死亡,表現(xiàn)為凋亡中信號(hào)通路的啟動(dòng)及相關(guān)基因表達(dá)的變化。有研究顯示,心肌細(xì)胞在某些病理狀態(tài)下發(fā)生凋亡,且細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展受多種基因調(diào)控,與相關(guān)信號(hào)的激活、轉(zhuǎn)導(dǎo)具有一定相關(guān)性[8]。通過超聲表現(xiàn)和組織聲學(xué)特性間的相互關(guān)系,不僅能測(cè)定臟器的大小、運(yùn)動(dòng)、結(jié)構(gòu)變化等,同時(shí)了解相關(guān)病理組織的改變及鑒別功能心肌的逆轉(zhuǎn)、炎性浸潤、纖維化等,在川崎病心肌診斷中具有重要意義[9]。本研究利用實(shí)時(shí)三維超聲心動(dòng)圖對(duì)川崎病心肌功能的測(cè)定發(fā)現(xiàn),正常組小鼠心臟舒張功能正常且無障礙產(chǎn)生,模型組小鼠出現(xiàn)心臟舒張功能障礙,LVEDD增加,LVEF降低,經(jīng)他克莫司處理后的川崎病小鼠LVEF提升,LVEDD減少,經(jīng)阿司匹林處理后小鼠雖然心臟舒張功能略微緩解,LVEF、LVEDD略改善,但相對(duì)弱于他克莫司組。表明經(jīng)他克莫司干預(yù)后川崎病小鼠的心臟整體功能及局部收縮功能均可改善。

相關(guān)研究顯示,TNF-α、IL-6、VEGF等炎性因子在川崎病的發(fā)生發(fā)展、心肌損傷及內(nèi)皮功能中的表達(dá)具有重要的作用[10]。本研究結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF水平較高;與模型組比較,他克莫司組小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF水平降低;與他克莫司組比較,阿司匹林組小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF水平升高,提示他克莫司可降低川崎病小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF表達(dá)。川崎病中相關(guān)因子通過增加細(xì)胞黏附分子表達(dá),誘發(fā)血小板活化分子及IL-6等相關(guān)炎性因子釋放,并通過自分泌方式作用于單核巨噬細(xì)胞,釋放炎性介質(zhì)加劇炎癥反應(yīng),促進(jìn)炎性細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)黏附、浸潤及中性粒細(xì)胞脫顆粒、抗纖溶等,增加內(nèi)皮損傷及動(dòng)脈粥樣硬化[11]。相關(guān)研究顯示,他克莫司通過抑制機(jī)體內(nèi)腺嘌呤核苷三磷酸發(fā)揮抗氧化作用,增加動(dòng)脈血流量,增強(qiáng)心肌收縮功能,改善TNF-α、IL-6等表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)[12]。他克莫司通過下調(diào)近端小管上皮細(xì)胞VEGF表達(dá),降低單核細(xì)胞的趨化作用,減輕平滑肌細(xì)胞增生及血管壁厚度、管腔狹窄、閉塞等引起的心臟供血功能不足,改善川崎病所致的炎細(xì)胞浸潤及心肌細(xì)胞凋亡[13]。

川崎病引起的心肌細(xì)胞凋亡是受多種基因調(diào)控,其中凋亡加速基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2認(rèn)為與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[14]。本研究結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高;與模型組比較,他克莫司組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率下降;與他克莫司組比較,阿司匹林組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率升高,提示他克莫司可減輕川崎病小鼠心肌細(xì)胞凋亡。川崎病中Bcl-2基因家族成員可能通過相互競(jìng)爭形成同型或異型的二聚體調(diào)控線粒體變化,間接調(diào)節(jié)蛋白酶和核酸酶活性,雙向調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡[15]。Bax與相關(guān)凋亡基因結(jié)合形成異型二聚體使Bax失活,同時(shí)Bcl-2被磷酸化并從二聚體中釋放出來,游離的Bax可形成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同型二聚體,破壞線粒體膜功能,進(jìn)而啟動(dòng)Caspase酶系級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。有研究顯示,他克莫司具有抗低氧再給氧心肌細(xì)胞凋亡作用,其機(jī)制可能與清除氧自由基和一氧化氮有關(guān),通過增強(qiáng)細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl-2水平,可改善心臟收縮和舒張功能,增加冠狀動(dòng)脈血流量,進(jìn)而發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用[17]。

JAKs/STATs信號(hào)通路是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑,參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞活性、腫瘤發(fā)展等[18]。以往研究表明,JAK2、STAT3表達(dá)異常引起心肌營養(yǎng)因子和信號(hào)轉(zhuǎn)錄激活因子及內(nèi)皮功能改變,提示JAKs/STATs信號(hào)通路對(duì)川崎病引起的心肌功能發(fā)揮一定的干預(yù)作用[19]。本研究結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)降低;與模型組比較,他克莫司組小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)升高;與他克莫司組比較,阿司匹林組小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)降低,提示他克莫司可提高川崎病小鼠心肌組織JAK2、STAT3蛋白表達(dá)。相關(guān)研究顯示,STAT通過與酪氨酸相關(guān)受體結(jié)合,與JAK及受體上酪氨酸殘基發(fā)生反應(yīng),將吸引STAT結(jié)合到受體上,使磷酸化的JAK2、STAT3轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi),抑制川崎病發(fā)生發(fā)展[20]。有研究顯示,他克莫司可能通過多途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞因子釋放和蛋白表達(dá),減輕川崎病引起的機(jī)體不良反應(yīng),并介導(dǎo)JAKs/STATs使JAKs磷酸化下游的蛋白轉(zhuǎn)錄合成效應(yīng)底物,抑制心肌細(xì)胞凋亡和促壞死因子[21]。

綜上所述,他克莫司可改善川崎病小鼠心臟功能及內(nèi)皮功能,降低心肌細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。本研究存在一定的局限,今后應(yīng)不斷完善,以期為臨床相關(guān)疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。