梁慧

（梧州職業(yè)學(xué)院，廣西 梧州 543000）

我國(guó)柿葉資源豐富，柿葉入藥自我國(guó)明代至今均有記載。同時(shí)，柿葉也是我國(guó)民間保健品之一，古人以柿樹葉為原料，參照茶葉制作工藝制成保健飲品。本研究選用恭城地區(qū)不同時(shí)期采收的水柿、月柿，并對(duì)其脫澀前后總黃酮、槲皮素、山奈素成分含量進(jìn)行研究。并對(duì)柿葉與其他藥物進(jìn)行復(fù)方配伍，研究最佳配伍比例，并通過(guò)檢測(cè)小鼠使用復(fù)方柿葉茶后體重、體脂數(shù)據(jù)，分析復(fù)方柿葉茶保健功效。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器。SB25-12 DTDN型超聲清洗機(jī)、萬(wàn)分之一電子分析天平、RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHB-3型循環(huán)多用真空泵、DZ-1BC型真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、電磁爐、紫外分光光度計(jì)（Agilent CARY 6）Waters1525高效液相色譜儀（Waters2428紫外檢測(cè)器），安捷倫extend-C18柱，微量注射器。

1.1.2 試劑。蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院 Z08YJ4K8/10080-202012）山奈酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院 Z08YJ4K9/10081-202102）。

1.1.3 試驗(yàn)樣品。柿葉采集于廣西壯族自治區(qū)恭城縣，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)黃勇教授鑒定為柿樹科柿樹屬植物柿的干燥葉。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)動(dòng)物由梧州市食品藥品檢驗(yàn)所提供SPF級(jí)KM雄性小鼠，并飼喂于梧州市食品藥品檢驗(yàn)所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 柿葉采集與處理。2021年5月-9月，每15日采收一次，共采集10次。采摘的柿葉為從枝條頂端數(shù)進(jìn)去第4-6片葉子（從上往下數(shù)），挑選質(zhì)厚、無(wú)病蟲害、無(wú)機(jī)械損傷的柿葉。冷水沖洗柿葉上的泥沙、雜質(zhì)，剪去葉柄。在通風(fēng)處風(fēng)干，密封保存。另取鮮柿葉攤放4小時(shí)后用100℃開水殺青1分鐘，攤涼后按加壓“輕——重——輕”的原則揉捻約10min，每張柿葉搓揉成直徑約2cm的茶粒，放至真空干燥箱干燥4h，檢查剔除不合格品。

1.2.2 柿葉品質(zhì)試驗(yàn)。

①測(cè)定柿葉樣品總黃酮含量（三氯化鋁比色法）[1]

精密稱取AlCl3·6H2O2.42g，60%乙醇定容至100mL，配成0.1mol/mL的溶液。精密稱取CH3COONa·3 H2O 2.72g，蒸餾水溶解至100mL，配成0.2mol/mL的溶液。精密量取1.15mL冰醋酸，蒸餾水溶解至100mL，配成0.2mol/mL的醋酸溶液。

精密稱取于105℃下烘至恒重的蘆丁對(duì)照品10mg，用60%（V/V）乙醇溶解，用60%乙醇定容至50mL容量瓶中，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL于25mL容量瓶中，各加入5.0mL 0.1mol/L AlCl3溶液及2.5mL 0.2mol/L的HAc－NaAc緩沖溶液（pH3.6），60%乙醇溶液定容，搖勻，40℃水浴中加熱15min，冷卻至室溫，以0.1mol/mL AlCl3溶液為空白對(duì)照，420nm處測(cè)定吸光度值。以蘆丁對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。

稱取1.0g（準(zhǔn)確至0.0001g）柿葉樣品，倒入250mL三角瓶中，加入60%乙醇50mL，超聲30min（超聲溫度 60℃）。過(guò)濾，60%乙醇定容至100mL，搖勻?yàn)闃悠芬骸Ｎ悠芬?mL于25mL容量瓶中，加0.1mol/L AlCl3溶液5mL及2.5mL 0.2mol/L的HAc－NaAc緩沖溶液（pH3.6），60%乙醇溶液定容，搖勻，40℃水浴中加熱15min，冷卻至室溫，以0.1mol/mL AlCl3溶液為空白對(duì)照，420nm處測(cè)定吸光度值。

類黃酮含量（mg/g）=查得黃酮含量（mg/g）×100×稀釋倍數(shù)/樣品干重（g）

②測(cè)定柿葉樣品山奈素、槲皮素含量（HPLC法）[2,3]

色譜條件：C 18柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇－0.4%磷酸溶液（50∶50），流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360nm。

對(duì)照品、供試品和陰性溶液制備：精密稱取槲皮素對(duì)照品、山柰素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成各含20μg/ml 的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

取總黃酮含量最高批次的柿葉粉末1.0g（過(guò)60目篩），精密稱定，精密加甲醇－25%鹽酸（4∶1）50ml，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用甲醇－25%鹽酸（4∶1）補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。以甲醇溶液作為陰性對(duì)照溶液。

分別精密吸取槲皮素對(duì)照品溶液0.1mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL置10mL容量瓶中，各加甲醇至刻度，搖勻。分別進(jìn)樣20μL。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行直線回歸，得槲皮素回歸方程。分別精密吸取山柰素對(duì)照品溶液（201.6μg/mL）0.1mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL置10mL容量瓶中，各加甲醇至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣20μl。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行直線回歸，得山柰素回歸方程。

1.2.3 組方試驗(yàn)。柿葉及西洋參、山楂葉、生地黃、生黃精、茯苓、野葛、五指毛桃、羅漢果分別粉碎，過(guò)5目篩，25目以下粉末篩去。柿葉及其他藥物等比例混合，取以混合粉末5g，裝入袋泡茶袋。把佛手含量、桔紅含量、沖泡水量、沖泡時(shí)間作為影響柿葉茶滋味的因素，參照正交表L9（34）（表3）進(jìn)行正交試驗(yàn)。組織5人評(píng)審小組，參照茶葉評(píng)審程序，從滋味、香氣、湯色三方面對(duì)柿葉茶湯進(jìn)行評(píng)價(jià)。選出最優(yōu)配伍比例及沖泡方法。

1.2.4 動(dòng)物試驗(yàn)。對(duì)完成組方配伍的柿葉茶，按組方和沖泡時(shí)間進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，以檢驗(yàn)其保健作用。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼喂及高血脂模型的建立：體重15g雄性KM小鼠70只，飼喂基礎(chǔ)飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后記錄體質(zhì)量，剔除體質(zhì)量異常小鼠。其余小鼠隨機(jī)分為2組：空白對(duì)照組（n＝10），飼喂基礎(chǔ)飼料；肥胖模型組，飼喂高脂飼料，期間小鼠自由攝食與飲水。

小鼠分組及給藥灌胃：28天后測(cè)定各組小鼠體重和血糖值，剔除異常鼠后，將高血脂模型組小鼠隨機(jī)分為肥胖模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、單方柿葉組以及復(fù)方柿葉保健茶高、中、低劑量組，每組10只。

肥胖模型建成后對(duì)受試小鼠進(jìn)行灌胃處理，其中陽(yáng)性對(duì)照組辛伐他汀的劑量為人體推薦量的20倍 即3.33mg/（kg·d mb），復(fù)方柿葉保健茶高、中、低劑量組（下文簡(jiǎn)稱高劑量組、中劑量組、低劑量組）分別為人體推薦量的5、10、20倍，單方柿葉組劑量與復(fù)方柿葉保健茶組中劑量組相同。開始給藥灌胃后每7天稱一次小鼠體質(zhì)量并記錄；在實(shí)驗(yàn)第30天末次給藥后，用頸椎脫臼法處死小鼠，測(cè)量各組小鼠體重、體長(zhǎng)后，取肝臟測(cè)量肝臟質(zhì)量，取腹腔脂肪及睪丸旁脂肪計(jì)算體脂率。

2 結(jié)果與分析討論

2.1 不同時(shí)期、品種柿葉主要成分含量（見表1）

表1 不同時(shí)期、品種柿葉主要成分含量（mg/g）

2.2 組方配伍

由表2結(jié)果顯示復(fù)方柿葉茶綜合評(píng)價(jià)的主要影響因素依次為桔紅含量、佛手含量、沖泡時(shí)間、沖泡水量。其中優(yōu)水平組合為A2B3C3D1，即當(dāng)柿葉茶采用柿葉及其他藥物5g，沖泡水量750ml，沖泡時(shí)間5分鐘時(shí)為較優(yōu)水平。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3 動(dòng)物試驗(yàn)

由表3可知，小鼠平均體質(zhì)量從大到小依次為中劑量組、高劑量組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、柿葉組、空白組。其中模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、低、中、高劑量組均與空白組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；小鼠lee's指數(shù)從高到低依次為中劑量組、空白組、模型組、高劑量組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、柿葉組。其中柿葉組小鼠lee's指數(shù)與空白組有明顯差異（P＜0.05）；小鼠平均肝質(zhì)量從大到小依次為模型組、中劑量組、劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、柿葉組、空白組；小鼠肝臟指數(shù)從高到低依次為模型組、空白組、低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、中劑量組、高劑量組；小鼠腹腔脂肪濕重從大到小依次為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、柿葉組、空白組。其中陽(yáng)性對(duì)照組、柿葉組、中劑量組、高劑量組之間無(wú)明顯差異。空白組、模型組、與其余各組間有明顯差異；小鼠體脂率從高到低依次為模型組、低劑量組、柿葉組、中劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量組、空白組。其中陽(yáng)性對(duì)照組、柿葉組、中劑量組、高劑量組之間無(wú)明顯差異?？瞻捉M、模型組、與其余各組間有明顯差異。

表3 不同飼養(yǎng)方案對(duì)小鼠的影響

3 結(jié)論

水柿總黃酮含量高的采收時(shí)間為9月，槲皮素與山奈酚含量高的采收時(shí)間為7月；月柿總黃酮含量高的采收時(shí)間為8月，槲皮素與山奈酚含量高的采收時(shí)間為9月。

復(fù)方柿葉保健茶組方確定為柿葉、西洋參、山楂葉、生地黃、生黃精、茯苓、野葛、五指毛桃、羅漢果、佛手等量，加工工藝為以上各味粉碎過(guò)5目篩，25目以下粉末篩去，以5g以上粉末為度置茶葉袋中封口。飲用時(shí)以750ml開水沖泡5分鐘，提出茶包，放至約45攝氏度或人體覺(jué)得溫度適宜時(shí)飲用風(fēng)味最佳。

復(fù)方柿葉保健茶能降低小鼠lee's指數(shù)、體脂率，對(duì)抑制肥胖進(jìn)展和脂肪肝發(fā)展有一定保健作用。

4 推廣與應(yīng)用

此復(fù)方柿葉保健茶已于2021年廣西職業(yè)教育成果展示周、2021年梧州地區(qū)職業(yè)教育成果展上進(jìn)行展示和推廣，得到了廣大師生的好評(píng)。