蔡國(guó)華,周明光,張 迪,戴昕燕,潘建剛,徐曉娟,何啟蓋,蔡旭旺*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430070;2.武漢科前生物有限公司,湖北 武漢 430200)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)定植于豬上呼吸道,可導(dǎo)致豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。近年來,伴隨著“限抗令”的實(shí)施,副豬嗜血桿菌病的防控變得更加困難。弱毒活疫苗相比于滅活疫苗,不僅成本相對(duì)較低,而且可以刺激機(jī)體產(chǎn)生更加全面的免疫應(yīng)答,在傳染病防控方面發(fā)揮著重要作用[3]。

冷凍干燥作為一種物質(zhì)保存技術(shù),被廣泛應(yīng)用于活疫苗的制備。然而,冷凍干燥過程存在諸多損傷應(yīng)力,均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性下降甚至死亡[4],因此,往往需要添加合適的保護(hù)成分來降低細(xì)胞活性損失[5]。相比于其他細(xì)菌,副豬嗜血桿菌十分脆弱,培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)緩慢且在外界存活時(shí)間短暫[6],因此該菌對(duì)冷凍干燥保存條件要求非常苛刻。本研究重點(diǎn)對(duì)副豬嗜血桿菌候選疫苗株HS1712的凍干保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化,提高菌株在冷凍干燥條件的存活率,進(jìn)而推動(dòng)弱毒疫苗商品化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 菌株豬嗜血桿菌分離株HS1712,血清型7型,由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.2 主要試劑及儀器胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(Tryptic soy agar,TSA)(批號(hào):0147211)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(Tryptic soy broth,TSB)(批號(hào):0079962)購(gòu)自美國(guó)BectonDickinso公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)(批號(hào):70080032)、海藻糖(批號(hào):21211045,純度≥98%)購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司;新生牛血清(批號(hào):20200725)購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司;甘油(批號(hào):20190815,分析純)、甘露醇(批號(hào):20200422,分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;脫脂奶粉(批號(hào):EZ6789B128)、牛血清白蛋白(Albumin bovine,BSA)(批號(hào):EZ6789D179)購(gòu)自德國(guó)BioFroxx公司;L-抗壞血酸鈉(批號(hào):C12371584)購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)(批號(hào):H08X025)購(gòu)自于英國(guó)Alfa Aesar公司;Christ凍干機(jī)(型號(hào):Epsilon 2-6D LSC plus)購(gòu)自德國(guó)Marin Christ公司。

1.3 試驗(yàn)菌株復(fù)蘇及擴(kuò)培將-20℃冷凍保藏的凍干菌種用TSA培養(yǎng)基(添加體積分?jǐn)?shù)為5%血清和質(zhì)量濃度為10 mg/L NAD)復(fù)蘇活化,置于37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。挑取單菌落接種于5 mL TSB液體培養(yǎng)基(添加體積分?jǐn)?shù)為5%血清和質(zhì)量濃度為10 mg/L NAD),37℃,180 r/min,振蕩培養(yǎng)7～9 h。以1∶1 000轉(zhuǎn)接比例轉(zhuǎn)接于TSB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)10～12 h。

1.4 凍干保護(hù)劑的制備本試驗(yàn)所涉及保護(hù)劑均使用超純水溶解并配制不同比例,脫脂奶粉、PVP于110℃高溫下滅菌30 min;海藻糖、L-抗壞血酸鈉、甘露醇、甘油使用孔徑0.22 μm的濾膜過濾除菌。

1.5 冷凍干燥過程將TSB液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期的菌液進(jìn)行離心,5 000×g離心10 min。使用原菌液體積1/2的磷酸鹽緩沖溶液(0.01 mol/L,pH=7.4)重懸菌體沉淀,后將菌液與凍干保護(hù)劑成品混合。充分混勻后,吸取2 mL混合液分裝于無菌的7 mL 管制玻璃瓶,置于凍干機(jī)進(jìn)行凍干。凍干結(jié)束后,制品于-20℃冰箱冷凍保存。

1.6 試驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定以副豬嗜血桿菌凍干存活率作為指標(biāo)來評(píng)估不同保護(hù)劑配方保護(hù)效果,其計(jì)算方法如下:

凍干前活菌計(jì)數(shù):將菌液與凍干保護(hù)劑按照1∶1比例混合,充分渦旋后吸取0.1 mL混合液至0.9 mL TSB液體培養(yǎng)基(未添加NAD和新生牛血清)中進(jìn)行10倍稀釋,即為10-1稀釋倍數(shù)。取100 μL 10-1稀釋液加入第2個(gè)離心管進(jìn)行10倍稀釋,即為10-2稀釋倍數(shù),依此類推,倍比稀釋至合適的稀釋倍數(shù)10-n。取100 μL 10-n稀釋液接種于TSA培養(yǎng)基,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱,靜置培養(yǎng)24 h,進(jìn)行計(jì)數(shù)。

凍干后活菌計(jì)數(shù):在凍干制品中加入2 mL磷酸鹽緩沖溶液,使其恢復(fù)至凍干前體積,靜置3 min使其充分復(fù)水后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)方法參照凍干前。

1.7 配方成分組成優(yōu)化以5.0%脫脂奶粉、1.5%甘油、4.0%海藻糖、2.0%甘露醇、1.0% BSA、1.0%L-抗壞血酸、0.5% PVP為基礎(chǔ)配方,分別對(duì)配方中的甘油、海藻糖、甘露醇、BSA、L-抗壞血酸鈉、PVP進(jìn)行缺失來探究其對(duì)副豬嗜血桿菌HS1712凍干存活率的影響,由于配方中的脫脂奶粉具有填充作用,故不對(duì)此成分進(jìn)行缺失(表1)。冷凍干燥具體過程按1.5方法進(jìn)行,并按1.6方法測(cè)定、計(jì)算其凍干存活率。

表1 單因素缺失試驗(yàn)

1.8 配方成分添加比例優(yōu)化

1.8.1單因素變量試驗(yàn) 脫脂奶粉對(duì)凍干存活率的影響:固定甘油的添加比例為1.5%,海藻糖的添加比例為4.0%,考察不同的脫脂奶粉添加比例3.0%,5.0%,7.0%,9.0%,11.0%對(duì)副豬嗜血桿菌HS1712凍干存活率的影響。冷凍干燥過程按1.5方法進(jìn)行,并按1.6方法測(cè)定、計(jì)算其凍干存活率。

甘油對(duì)凍干存活率的影響:固定脫脂奶粉的添加比例為5.0%,海藻糖的添加比例為4.0%,考察不同的甘油添加比例0.5%,1.5%,2.5%,3.5%,4.5%對(duì)副豬嗜血桿菌HS1712凍干存活率的影響。冷凍干燥過程按1.5方法進(jìn)行,并按1.6方法測(cè)定、計(jì)算其凍干存活率。

海藻糖對(duì)凍干存活率的影響:固定脫脂奶粉的添加比例為5.0%,甘油的添加比例為1.5%,考察不同的海藻糖添加比例0.5%,1.0%,2.0%,3.0%,4.0%對(duì)副豬嗜血桿菌凍干存活率的影響。冷凍干燥過程按1.5方法進(jìn)行,并按1.6方法測(cè)定、計(jì)算其凍干存活率。

1.8.2Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于單因素變量試驗(yàn)結(jié)果,以脫脂奶粉、甘油、海藻糖為自變量,副豬嗜血桿菌凍干存活率為響應(yīng)值,應(yīng)用Design-Expert 11軟件設(shè)計(jì)了3因素3水平共17次的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)。其中中心點(diǎn)設(shè)置為5組重復(fù)試驗(yàn),用以估計(jì)試驗(yàn)誤差,Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)中各因素選取水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)中所選取因素的水平 %

2 結(jié)果

2.1 配方成分組成優(yōu)化由圖1可知,配方中甘油、海藻糖的缺失顯著降低了副豬嗜血桿菌HS1712凍干存活率(P<0.05),缺失后菌株凍干存活率分別從55.14%降至37.83%,41.45%,說明甘油、海藻糖為不可缺少成分。甘露醇、BSA、L-抗壞血酸缺失后,菌株凍干存活率無顯著變化(P>0.05),從經(jīng)濟(jì)角度和保護(hù)效果綜合考慮,配方中不添加這3種成分;PVP的缺失對(duì)菌株凍干存活率無顯著作用(P>0.05),但是PVP的添加可以改善凍干制品的形態(tài),故將其作為添加成分。因此,最終配方為脫脂奶粉5.0%、甘油1.5%、海藻糖2.0%、PVP 0.5%。

2.2 配方成分添加比例優(yōu)化

2.2.1單因素變量試驗(yàn) 由圖2可知,副豬嗜血桿菌HS1712對(duì)不同添加比例的保護(hù)劑成分表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。脫脂奶粉、甘油、海藻糖的最佳添加比例分別為5.0%,1.5%,2.0%,凍干存活率分別為64.20%,63.79%,74.44%;從經(jīng)濟(jì)成本和保護(hù)效果2個(gè)方面綜合考慮,最終確定脫脂奶粉的最佳添加比例區(qū)間為3.0%～7.0%、甘油的最佳添加比例區(qū)間為0.5%～2.5%、海藻糖的最佳添加比例區(qū)間為1.0%～3.0%。

1.甘油缺失;2.海藻糖缺失;3.甘露醇缺失;4.BSA缺失;5.L-抗壞血酸鈉缺失;6.PVP缺失;同組數(shù)據(jù)含相同字母表示差異性不顯著(P>0.05),不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

圖2 單因素變量試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2Box-Behnken響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)副豬嗜血桿菌HS1712凍干保護(hù)劑成分的添加比例進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。表3為響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值。使用Design-Expert 11軟件對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行模型擬合,擬合得到的回歸方程為:Y=74.48+4.59×A+3.19×B+5.38×C-4.25×AB+2.47×AC+3.45×BC+0.60×A2-2.10×B2-7.70×C2,其中A、B、C 分別表示脫脂奶粉的添加比例、甘油的添加比例、海藻糖的添加比例,Y為副豬嗜血桿菌HS1712的凍干存活率。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)表及其響應(yīng)值

通過對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析可知(表4),該模型的P值=0.000 2<0.010 0,表明該模型呈現(xiàn)出極顯著水平;失擬項(xiàng)P值=0.865 0>0.050 0,失擬項(xiàng)不顯著,即試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型擬合度較好;模型決定系數(shù)R2=0.966 7,有96.67%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以用該模型來解釋,即表示相關(guān)性好。模型變異系數(shù)(CV)值為3.00%,說明模型的精確度和可信度較高;信噪比(adeq precision)為12.865 3,大于下限值4.000 0,說明模型的平均預(yù)測(cè)誤差小,擬合度好。

在回歸方程中,一次項(xiàng)P值均小于0.010 0,表明在試驗(yàn)范圍內(nèi)3個(gè)因素對(duì)副豬嗜血桿菌HS1712凍干存活均有極顯著影響,交叉項(xiàng)中AB、BC的P值小于0.050 0,說明因素A和因素B、因素B和因素C之間的相互作用對(duì)副豬嗜血桿菌HS1712凍干存活影響顯著;二次項(xiàng)中C2對(duì)副豬嗜血桿菌HS1712凍干存活有極顯著影響。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)的方差分析

應(yīng)用Design Expert 11軟件繪制不同考察因素對(duì)于副豬嗜血桿菌HS1712凍干存活率影響的3D響應(yīng)面圖,用來確定各因素的最佳范圍以及評(píng)價(jià)各考察因素之間的相互作用。由圖3結(jié)果顯示,各3D響應(yīng)面圖峰開口均朝下,說明擬合的回歸方程有最大值,脫脂奶粉、甘油、海藻糖的最佳添加比例區(qū)間分別是6.0%～7.0%,2.0%～2.5%,2.5%～3.0%。圖3A和圖3B響應(yīng)面圖坡度陡峭,且對(duì)應(yīng)的等高線致密,說明脫脂奶粉與甘油、甘油與海藻糖之間交互作用對(duì)副豬嗜血桿菌HS1712凍干存活率影響顯著,與表4方差分析結(jié)果一致。

通過解析回歸方程,得出海藻糖、甘油、甘露醇的最佳添加比例分別為:脫脂奶粉6.8%、甘油2.2%、海藻糖2.7%,副豬嗜血桿菌HS1712凍干存活率預(yù)測(cè)值為80.87%。

2.2.3回歸方程的驗(yàn)證 使用該配方:脫脂奶粉6.8%、甘油2.2%、海藻糖2.7%、PVP 0.5%進(jìn)行凍干驗(yàn)證,副豬嗜血桿菌的凍干存活率分別為80.32%,78.40%,78.89%,平均凍干存活率為79.20%,與預(yù)測(cè)值相差1.67%,無顯著性差異(P>0.05),說明該回歸模型具有一定的使用價(jià)值。

3 討論

在本研究中,基于凍干保護(hù)劑的性質(zhì)組建了多種配方,通過凍干試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以脫脂奶粉、海藻糖、甘油、PVP為主要成分組成的配方能夠顯著提高副豬嗜血桿菌HS1712對(duì)凍干環(huán)境的耐受能力,這可能是由于不同保護(hù)機(jī)制成分共同協(xié)同促進(jìn)的結(jié)果。脫脂奶粉作為一種傳統(tǒng)保護(hù)劑,其中的蛋白質(zhì)成分可以在細(xì)胞表面形成一層具有黏性的膜層,防止冰晶對(duì)細(xì)胞造成損傷[7]。CHEN等[8]使用25%脫脂奶粉為基礎(chǔ)的配方使得雙歧桿菌在冷凍干燥后的存活率顯著提高至90.37%。海藻糖作為一種非還原性二糖,在干燥階段可通過氫鍵與脂質(zhì)相互作用來維持酰基鏈之間正常的范德華力,使得細(xì)胞膜維持類似于水存在時(shí)的物理狀態(tài)[9-10]。甘油作為小分子物質(zhì),可減緩低溫以及冰晶對(duì)細(xì)胞所造成的損傷,從而降低了預(yù)凍階段對(duì)細(xì)胞所造成的損傷[11]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的添加通過強(qiáng)化玻璃狀基質(zhì)來進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[12]。

響應(yīng)面法(response surface methodology,RSM)作為一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的方法,多用于配方及工藝的優(yōu)化[13-14]。本研究通過Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)配方優(yōu)化的過程中發(fā)現(xiàn),脫脂奶粉、甘油、海藻糖的添加可顯著影響副豬嗜血桿菌HS1712在冷凍干燥后的存活率,這與楊曉菲等[15]的結(jié)果相似,其也發(fā)現(xiàn)海藻糖為影響副豬嗜血桿菌凍干存活的顯著成分。通過對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸模型擬合,得到最佳添加比例為脫脂奶粉6.8%、甘油2.2%、海藻糖2.7%,具體配方成分及添加比例為脫脂奶粉6.8%、甘油2.2%、海藻糖2.7%、PVP 0.5%。使用優(yōu)化后配方制得副豬嗜血桿菌凍干菌粉,理論凍干存活率為80.87%,試驗(yàn)驗(yàn)證其實(shí)際凍干存活率為79.20%,擬合模型與實(shí)際驗(yàn)證無顯著差異性,證明了模型的可靠性。

另外,本研究還發(fā)現(xiàn),BSA、甘露醇、L-抗壞血酸鈉的添加并不能顯著增強(qiáng)副豬嗜血桿菌HS1712在冷凍干燥后的存活率,其原因可能是:BSA作為大分子蛋白質(zhì)類保護(hù)劑,由于其體積較大,通過空間位阻來抑制了海藻糖、甘油等小分子物質(zhì)與細(xì)胞膜表面的相互作用[16-17];甘露醇作為一種結(jié)晶類物質(zhì),其在預(yù)凍階段所形成的結(jié)晶會(huì)降低配方的玻璃態(tài)黏度,從而影響配方的保護(hù)效果[18-19]。L-抗壞血酸鈉作為一種抗氧化劑,其作用可能重點(diǎn)體現(xiàn)在制品儲(chǔ)存階段,通過消耗凍干制品內(nèi)部的氧或抑制氧化活性物的產(chǎn)生增加凍干制品的儲(chǔ)存穩(wěn)定性,而對(duì)冷凍干燥過程影響較小[20]。