孫雨昕,溫 冉,宮新城,2,史萬玉,2,王曉丹,2*

(1河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000;2河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 保定 071000)

代森錳鋅(mancozeb,MCZ)是一種代森錳和鋅離子結(jié)合的用于控制真菌植物病原體的殺菌劑,廣泛用于保護(hù)蔬菜、水果以及觀賞植物和高爾夫球場等,MCZ可通過抑制丙酮酸的氧化起到殺菌作用[1],因其低毒性、廣譜抑菌性[2]、還能為植物補(bǔ)充微量元素鋅在農(nóng)作物種植中被廣泛使用,但是MCZ在土壤中持久存在,在水中迅速分解導(dǎo)致其易殘留的特性。2021年1月歐盟終止了MCZ的許可證,原因是其具有一些典型的人類致癌物質(zhì)特性[3]。MCZ作為內(nèi)分泌干擾物[4],誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,導(dǎo)致人類和動物的精子發(fā)生和生殖器官出現(xiàn)異常[5],改變腎臟中的總谷胱甘肽酶活性,導(dǎo)致銅在腎臟中積累,改變機(jī)體內(nèi)的金屬穩(wěn)態(tài)[6]。重金屬積累可以在懷孕期間轉(zhuǎn)移到胎兒和哺乳期間轉(zhuǎn)移到子代身上,對人體有致癌、影響胚胎著床[7]等從而影響本代及子代生長發(fā)育的危害潛力。甘草自古以來就是我國應(yīng)用廣泛的一種中草藥,又名“國老”,具有良好的藥用和食用價值,有補(bǔ)中益氣、解毒止痛等的效用。甘草多糖(glycyrrhiza polysaccharide,GP)是從甘草中提取的水溶性多糖,作為甘草主要的活性成分之一,具有增強(qiáng)免疫活性[8]、抗氧化[9]、抗凋亡、抗腫瘤[10]等多種生物活性,對于MCZ的毒性有一定的緩解作用[11]。為此,本試驗(yàn)初步探索GP對妊娠期暴露MCZ誘導(dǎo)子代小鼠腎臟損傷的緩解作用,為更多中藥的開發(fā)與應(yīng)用提供一定的科學(xué)解釋。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器MCZ(商品級Dithane-M45,80%)、GP(GP,30%)購自西安圣青生物科技有限公司;EastepTMSuper 總RNA 提取試劑盒(LS1040,promega,北京);HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(R323-01,維諾贊生物,南京);TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(RR820A,TaKaRa,China);引物(大連寶生物有限公司);總蛋白定量、T-AOC、MDA、SOD、GSH-Px試劑盒(南京建成生物工程研究所,南京);GPX4、FSP1、TGF-β1試劑盒(酶聯(lián)生物,上海)。

1.2 動物分組及處理方法選用SPF級未經(jīng)產(chǎn)的7周齡雌性和雄性昆明小鼠分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,下午8:00合籠飼養(yǎng),早上8:00檢查有無陰栓,檢出陰栓者定為孕0 d,并將孕鼠換籠飼養(yǎng)。將孕鼠隨機(jī)分為空白對照組、MCZ組、GP低劑量組、GP中劑量組、GP高劑量組,共5組,每組10只?？瞻讓φ战M早晚各灌服1次0.1 mL生理鹽水;MCZ對照組早上灌服150 mg/kg的MCZ,晚上灌服0.1 mL 生理鹽水;GP低劑量組早上灌服150 mg/kg 的MCZ,晚上灌服50 mg/kgGP;GP中劑量組早上灌服150 mg/kg的MCZ,晚上灌服100 mg/kg GP;GP高劑量組每天早上灌服150 mg/kg 的MCZ,晚上灌服200 mg/kg GP,仔鼠產(chǎn)后與母鼠同窩喂養(yǎng),泌乳期不飼喂母鼠MCZ,在仔鼠21 d 時將其處死。本研究中動物處理過程通過河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的動物倫理學(xué)審查。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.121 d仔鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)測定 稱取21 d 仔鼠體質(zhì)量,斷頸處死后剖開腹腔取出腎臟,記錄不同組仔鼠腎臟質(zhì)量。腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.3.221 d仔鼠腎臟組織形態(tài)觀察 將新鮮21 d仔鼠腎臟置于4%多聚甲醛溶液中固定備用,常規(guī)制備5 μm厚石蠟切片, HE染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察21 d仔鼠腎臟組織形態(tài)變化情況。

1.3.321 d仔鼠血清中肌酐、尿素氮含量測定 將21 d仔鼠血液以3 000 r/min離心,取上清并分裝保存于-20℃待用。按照南京建成生物工程研究所尿素氮試劑盒及肌酐試劑盒說明書要求測定21 d仔鼠血清中肌酐和尿素氮含量。

1.3.421 d仔鼠腎臟組織勻漿中T-AOC、SOD、GSH-Px、MDA含量測定 取21 d仔鼠腎臟,按說明書制備10%組織勻漿,提取其上清液,分裝保存于-20℃待測。取組織勻漿上清液,按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書分別測定腎臟組織中T-AOC、SOD、GSH-Px、MDA含量。

1.3.521 d仔鼠腎臟組織勻漿中FSP1、TGF-β1、GPX4含量測定 取21 d仔鼠腎臟按說明書制備10%組織勻漿,提取其上清液,分裝保存于-20℃待測。取10%組織勻漿上清液,按照ELISA試劑盒說明書分別測定腎臟組織勻漿中FSP1、TGF-β1、GPX4含量。

1.3.621 d仔鼠腎臟組織中NOX4、NF-κB p65 mRNA、GPX4轉(zhuǎn)錄水平測定 用EastepTMSuper 總RNA 提取試劑盒提取21 d仔鼠腎臟中總RNA,再用HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,分裝保存于-20℃,待用。用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)等試劑采用實(shí)時熒光定量PCR法對目的基因NOX4、NF-κB p65 mRNA、GPX4表達(dá)水平進(jìn)行檢測,PCR過程引物由大連寶生物有限公司設(shè)計(jì)合成,引物設(shè)計(jì)如表1,循環(huán):采用95℃ 30 s 預(yù)變形;95℃ 5 s 變性,60℃ 30 s退火,39個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,用2-△△Ct表示目的基因的相對表達(dá)量。

1.3.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 應(yīng)用Excel軟件整合數(shù)據(jù),SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析,Graphpad Prism 9.0軟件繪制圖形,差異比較通過One-way ANOVA進(jìn)行評估。

表1 引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 GP對妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠腎臟組織形態(tài)的影響HE染色結(jié)果,如圖1所示,空白對照組,腎小球大小正常,邊緣界限清晰,腎小管上皮細(xì)胞排列整齊,管腔大小正常;與MCZ組相比,GP中劑量組腎小囊囊腔變大,腎小管結(jié)構(gòu)較清晰,無大量腎小管上皮細(xì)胞脫落;GP高劑量組腎小球形狀較正常,腎小囊囊腔結(jié)構(gòu)較清晰,管腔大小較正常,無大量腎小管上皮細(xì)胞脫落。

2.2 GP對妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠體質(zhì)量及腎臟指數(shù)的影響如圖2A所示,在體質(zhì)量方面,體質(zhì)量與MCZ的劑量呈“U”型關(guān)系,MCZ組與空白對照組相比下降,且差異極顯著(P<0.01),用GP與MCZ聯(lián)合處理后,GP低劑量組差異顯著(P<0.05);如圖2B所示,在腎臟指數(shù)方面,MCZ組與空白對照組相比上升,但差異不顯著(P>0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后GP中、高劑量組均低于MCZ組,且差異均極顯著(P<0.01)。

2.3 GP對妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠血清中肌酐、尿素氮的影響如圖3A所示,在肌酐方面,MCZ組與空白對照組相比上升,且差異均極顯著(P<0.01),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組,且GP中、高劑量組差異均極顯著(P<0.01);如圖3B所示,在尿素氮方面,MCZ組與空白對照組相比上升,且差異顯著(P<0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組,且GP高劑量組差異極顯著(P<0.01)。

K.空白對照組;M.MCZ組;D.GP低劑量組;Z.GP中劑量組;G.GP高劑量組;*.MCZ組與空白對照組相比差異顯著(P<0.05);**.MCZ組與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01);#.GP低、中、高劑量組與MCZ組相比差異顯著(P<0.05);##.GP低、中、高劑量組與MCZ組相比差異極顯著(P<0.01)。下同

圖3 GP對妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠肌酐和尿素氮的影響

2.4 GP對妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠腎臟組織中T-AOC、SOD、GSH-Px、MDA水平的影響如圖4A所示,在T-AOC方面,MCZ組與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后,GP中、高劑量組與MCZ組相比差異顯著(P<0.05);如圖4B所示,在SOD活力方面,SOD活力與GP的劑量呈 “U”型關(guān)系,MCZ組與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后,差異也不顯著(P>0.05);如圖4C所示,在GSH-Px方面,GSH-Px與GP的劑量呈倒“U”型關(guān)系,MCZ組與空白對照組相比差異極顯著下降(P<0.01),用GP與MCZ聯(lián)合處理后,GP中劑量組與MCZ組差異顯著(P<0.05);如圖4D所示,在MDA方面,MDA與GP的劑量呈倒“U”型關(guān)系,MCZ組與空白對照組相比上升,且差異極顯著(P<0.01),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組,且GP中劑量組差異顯著(P<0.05),GP低、高劑量組差異極顯著(P<0.01)。

圖4 GP對妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠T-AOC、SOD、GSH-Px 、MDA水平的影響

2.5 GP對妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠腎臟組織中FSP1、TGF-β1、GPX4蛋白相對含量的影響如圖5A所示,在FSP1蛋白方面, FSP1蛋白與GP的劑量呈倒“U”型關(guān)系,MCZ組與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后,GP中劑量組與MCZ組相比差異顯著(P<0.05);如圖5B所示,在TGF-β1蛋白方面,MCZ組與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后,GP中劑量與MCZ組相比差異顯著(P<0.05),GP高劑量組與MCZ組相比差異極顯著(P<0.01);如圖5C所示,在GPX4蛋白方面,GPX4蛋白與GP的劑量呈倒“U”型關(guān)系,MCZ組與空白對照組相比差異不顯著(P>0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后,GP低、中劑量組與MCZ組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.6 GP對妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠腎臟組織中GPX4、NF-κB p65、NOX4 mRNA相對表達(dá)量的影響如圖6A所示,在GPX4 mRNA相對表達(dá)量方面,MCZ組與空白對照組相比下降,但差異不顯著(P>0.05),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均高于MCZ組,且GP高劑量組差異極顯著(P<0.01);如圖6B所示,在NOX4 mRNA相對表達(dá)量方面,NOX4 mRNA相對表達(dá)量與GP的劑量呈 “U”型關(guān)系,MCZ組與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組,且GP低、中、高劑量組與MCZ組相比差異均極顯著(P<0.01);如圖6C所示,在NF-κB p65 mRNA相對表達(dá)量方面,NF-κB p65 mRNA相對表達(dá)量與GP的劑量呈 “U”型關(guān)系,MCZ組與空白對照組相比上升,且差異極顯著(P<0.01),用GP與MCZ聯(lián)合處理后均低于MCZ組,且GP低、中、高劑量組與MCZ組相比差異均極顯著(P<0.01)。

圖5 GP對妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠FSP1、TGF-β1、GPX4蛋白質(zhì)量濃度的影響

圖6 GP對妊娠期暴露MCZ的21 d仔鼠GPX4、NOX4 、NF-κB p65 mRNA相對表達(dá)量的影響

3 討論

MCZ對腎臟的特異性作用機(jī)制尚未完全清楚,但已有中度至高度的可信度[12]的體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明MCZ會通過細(xì)胞水平影響小鼠胚胎生殖發(fā)育[13]應(yīng)被視為生殖毒物,長期暴露在MCZ環(huán)境下,可能引起帕金森等神經(jīng)退行性疾病[14],引起機(jī)體脂質(zhì)過氧化和活性氧的形成,從而誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激狀態(tài)[15]。體外試驗(yàn)表明MCZ能通過ERK信號通路引起PC-12細(xì)胞神經(jīng)元凋亡[16],調(diào)控各種氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的變化,引起細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA損傷[17]。MCZ暴露除影響本代接觸者的健康外,MCZ還能通過血-胎盤和血-乳屏障[18]影響到子代的健康。本試驗(yàn)通過建立孕鼠妊娠期MCZ暴露模型,探究GP對MCZ暴露導(dǎo)致的子代斷乳雌鼠的腎臟損傷的緩解機(jī)制。

氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡被打破的一種機(jī)能障礙狀態(tài),機(jī)體本身會維持自身氧化還原狀態(tài)的平衡,但受到一定的有害刺激時會表現(xiàn)出活性氧自由基的積累,刺激機(jī)體,使機(jī)體氧化應(yīng)激失衡。腎臟對氧化應(yīng)激高度敏感[19],肌酐[20]、尿素氮水平作為腎功能生物標(biāo)志物,被廣泛用于判斷腎損傷程度的指標(biāo),試驗(yàn)表明,與MCZ組相比,GP高劑量組(200 mg/kg)極顯著緩解了21 d仔鼠的腎損傷程度(P<0.01),且呈劑量依賴關(guān)系。GSH-Px和SOD作為自由基清除劑,其含量與機(jī)體抗氧化能力呈正比;MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物,反應(yīng)機(jī)體的過氧化程度;GP對活性氧中的自由基具有較強(qiáng)的清除還原能力[21],從而提高機(jī)體的抗氧化能力。研究發(fā)現(xiàn),GP能顯著提高注射新城疫疫苗的雞血清中的T-AOC、GSH-Px和SOD含量,降低脂質(zhì)過氧化物MDA含量,從而提高機(jī)體的抗氧化能力[22]。本試驗(yàn)表明,與MCZ組相比,GP中劑量組(100 mg/kg)顯著提高了21 d仔鼠血清中T-AOC和GSH-Px活力(P<0.05),顯著降低了MDA含量(P<0.05),但對SOD含量的影響并不顯著(P>0.05),且并不完全呈劑量依賴關(guān)系,這可能是因?yàn)?1 d仔鼠受到母乳的影響而對于部分有害刺激的變化水平影響較小有關(guān)。

鐵死亡是一種非凋亡形式的細(xì)胞死亡,具有鐵依賴性、脂質(zhì)過氧化物及活性氧積累的特征,在腎臟疾病中起著重要影響[23]。研究表明,鐵死亡與許多炎癥疾病[24]、神經(jīng)退行性疾病[25]、腫瘤[26]等有關(guān)。NOX4是NADPH氧化酶,主要在腎臟組織中表達(dá),且對活性氧含量敏感[27];核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是炎癥過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子,炎癥反應(yīng)在腎臟纖維化中起著關(guān)鍵作用[28]; FSP1和GPX4是調(diào)控細(xì)胞死亡的關(guān)鍵靶點(diǎn), GPX4能引起過氧化物的積累,減輕腎小管上皮細(xì)胞死亡,從而抑制小鼠死亡[29]; TGF-β1是轉(zhuǎn)化生長因子超家族的多肽成員,包括調(diào)控細(xì)胞生長、分化和凋亡等多種過程[30]的雙向調(diào)節(jié)因子,在炎性環(huán)境中發(fā)揮抗炎作用,而TGF-β1的過度生產(chǎn)又反而會導(dǎo)致細(xì)胞損傷,進(jìn)而導(dǎo)致組織纖維化的產(chǎn)生,研究表明,鐵死亡可以抑制慢性腎損傷的進(jìn)展[31]。本試驗(yàn)表明,與MCZ組相比,GP組(50,100,200 mg/kg)均極顯著抑制MCZ帶來的NOX4 mRNA、NF-κB p65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的升高(P<0.01),GP中劑量組(100 mg/kg)顯著抑制MCZ帶來的FSP1、GPX4及TGF-β1蛋白水平的降低(P<0.05),GP高劑量組(200 mg/kg)極顯著抑制MCZ帶來的GPX4 mRNA水平的降低(P<0.01),從而降低21 d仔鼠腎臟炎癥程度、活性氧積累、纖維化程度,從而增強(qiáng)機(jī)體對鐵死亡的耐受性。

綜上所述,GP通過提高21 d仔鼠的抗氧化應(yīng)激能力和對鐵死亡的耐受力而減輕腎損傷對機(jī)體帶來的影響,但并不完全呈劑量依賴性,其中以中劑量的GP組(100 mg/kg)對21 d仔鼠的腎臟保護(hù)作用最明顯。