張 珣, 武 軼, 黎馨月, 王百羽, 安 婧, 王 瑩

(1. 沈陽大學(xué) 環(huán)境學(xué)院, 遼寧 沈陽 110044;2. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 東北粳稻遺傳改良與優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心, 遼寧 沈陽 110866;3. 中國科學(xué)院 沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所, 遼寧 沈陽 110016)

抗生素主要是由細(xì)菌、霉菌或其他微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物或人工合成的類似物。近年來,獸用抗生素在過度醫(yī)療和畜牧業(yè)領(lǐng)域的濫用,導(dǎo)致環(huán)境中抗生素殘留激增、耐藥細(xì)菌出現(xiàn)。越來越多的抗生素和抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的出現(xiàn)和擴(kuò)散對抗生素的治療效果和生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定造成了嚴(yán)重危害。

ARGs作為1種新環(huán)境污染物于2006年被正式定義[1],近年來受到大眾的關(guān)注度愈來愈高。土壤中ARGs主要來源于土壤微生物及人或動物的糞便等,其中動物糞便為ARGs進(jìn)入土壤的主要途徑[2-3]。研究表明,錢勛[4]在雞糞中檢出134種ARGs,在豬糞中檢出120種ARGs,在牛糞檢出80種ARGs;Qian等[5]在豬、雞、牛等3種畜禽糞便中檢測到100余種ARGs;張丹等[6]在雞糞和牛糞中檢測到ARGs和可移動遺傳元件(mobile genetic elements, MGEs)。在長期施用畜禽糞便的土壤中ARGs的豐度和多樣性會顯著增加[7]。Zhou等[8]研究表明,施用雞糞商業(yè)有機(jī)肥可顯著增加土壤中ARGs的相對豐度;程建華等[9]在養(yǎng)牛場、養(yǎng)雞場和養(yǎng)豬場的土壤樣品中分別檢測到27、44和36種ARGs。而土壤中的ARGs可以向水體和農(nóng)作物中遷移,并隨食物鏈向動物及人類傳播[10]。

ARGs通常位于質(zhì)粒(plasmid)、轉(zhuǎn)座子(transposon)及整合子(integron)等可移動遺傳元件MGEs上,可以通過基因水平轉(zhuǎn)移發(fā)生遷移,引起抗生素耐藥菌的擴(kuò)散[11]。MGEs主要為整合子、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等,其中整合子位于質(zhì)粒和染色體上,是ARGs轉(zhuǎn)移的重要分子元件[12]。程建華等[9]研究表明,養(yǎng)殖場土壤中較高的MGEs豐度及ARGs豐度呈顯著的相關(guān)性(p<0.05);張俊華等[13]研究表明,磺胺類、氯霉素類、氨基糖苷類ARGs和ARGs總和與MGEs均呈極顯著正相關(guān)。說明MGEs可能促進(jìn)了ARGs在土壤環(huán)境中的遷移擴(kuò)散。

本文利用超高通量熒光定量PCR儀對遼寧省主要設(shè)施農(nóng)業(yè)集散地大棚土壤的ARGs與MGEs進(jìn)行研究,分析設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤中ARGs和MGEs的分布特征及相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

選取遼寧省內(nèi)的主要設(shè)施農(nóng)業(yè)集散地溫室大棚作為采樣點(diǎn),每個采樣點(diǎn)采集3份重復(fù)樣品(采樣深度為5～10 cm),土壤過2 mm篩并保存于超低溫冰箱中,用于后續(xù)DNA提取和ARGs的測定。樣品的基本信息如表1所示。

1.2 DNA的提取

使用新鮮土壤樣品(0.5 g)用于DNA提取,使用土壤DNA基因組提取試劑盒E.Z.N.A.? Soil DNA Kit(美國歐米茄公司生產(chǎn))從土壤樣品中提取DNA,按照說明書的要求進(jìn)行提取。DNA提取完畢后,使用超微量光度分析儀NanoPhotometerTMP-Class(德國Implen公司生產(chǎn))測定其DNA的純度和質(zhì)量濃度,A260/A280在1.8～2.0之間,表明DNA純度可進(jìn)行后續(xù)的分析。

1.3 高通量熒光定量PCR(HT-qPCR)定量檢測

抗生素抗性基因檢測采用超高通量熒光定量PCR系統(tǒng)完成,該系統(tǒng)每次能夠并行5 184個納升級qPCR反應(yīng)。其中共設(shè)置了72對引物,其中包括1對16s rRNA內(nèi)參引物,8個轉(zhuǎn)座酶(transposon),2個整合子和61個靶向ARGs,實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確地檢測各類環(huán)境介質(zhì)中ARGs的多樣性和豐度信息。PCR反應(yīng)混合液先使用納升級多樣品點(diǎn)樣儀加入到微孔芯片中,隨后進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性10 min,然后進(jìn)行40個循環(huán)的擴(kuò)增階段({95 ℃,30 s;60 ℃,30 s} 40次循環(huán))。qPCR結(jié)果使用儀器的qPCR軟件進(jìn)行自動分析。Ct=31設(shè)為檢出域,3個重復(fù)中有2個及以上檢出,偏差< 20%,且滿足曲線擬合分析的則判為檢出。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用 Excel分析ARGs和MGEs的組成特征。采用SPSS對ARGs在土壤中遷移傳播擴(kuò)散與MGEs的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤ARGs與MGEs的種類和數(shù)目

土壤樣品中檢測到50種ARGs和10種MGEs。50種ARGs為1個氨基糖苷類(aminoglycoside)、2個多重耐藥類(multidrug)、4個β-內(nèi)酰胺酶類(β-lactamase)、4個氯霉素類(chloramphenicol)、13個大環(huán)內(nèi)酯類(MLSB)、6個磺胺類(sulfonamide)、13個四環(huán)素類(tetracycline)、7個喹諾酮類(ouinolone)。其中β-內(nèi)酰胺酶抗生素抗性基因blaTEM、fox5,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗性基因ermX、ermB、ermF、ermT-02,磺胺類抗生素抗性基因sul2、dfrA1、folA,四環(huán)素類抗生素抗性基因tetG-01、tetG-02、tetM-01、tetM-02、tetPA、tetPB-03、tetT和喹諾酮類抗生素抗性基因oprJ、acrA-04的檢出率是100%。檢測到的10種MGEs可移動基因元件為2種類型整合子和8種類型轉(zhuǎn)座酶,其中整合子intI-1和轉(zhuǎn)座酶tnpA-01、tnpA-05的檢出率為100%。

土壤ARGs與MGEs數(shù)目分析如圖1所示,新民土壤樣品X的ARGs和MGEs檢測到的數(shù)目是最高的,43個ARGs和8個MGEs。遼中土壤樣品L檢測到的數(shù)目是最低的,為33個ARGs和7個MGEs。

圖1 不同采樣點(diǎn)土壤中ARGs與MGEs的數(shù)目Fig.1 Numbers of ARGs and MGEs in soil at different sampling points

2.2 ARGs和MGEs相對豐度分析

不同采樣點(diǎn)的土壤中微生物總量不同,為了減少偏差,將ARGs的濃度與內(nèi)參基因16S rRNA的濃度進(jìn)行歸一化處理,得到土壤中各個ARGs及MGEs的相對豐度,如表2所示。分析可知,不同的設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤的ARGs及MGEs的分布特征存在一定差異。ARGs總和相對豐度從大到小為: D、L、C、X、P、S;MGEs總和相對豐度從大到小為:S、C、X、L、D、P。其中莊河土壤樣品D的ARGs總和相對豐度為1.75,沈北土壤樣品S的ARGs總和相對豐度為1.05×10-1。在6個土壤樣品中,喹諾酮類ARGs的相對豐度占比較大,其相對豐度為4.04×10-2～1.68。在土壤樣品檢測到的MGEs中,整合子的相對豐度為7.85×10-3～1.31×10-2,轉(zhuǎn)座酶的相對豐度為2.83×10-3～1.65×10-1。

表2 不同采樣點(diǎn)土壤中ARGs及MGEs相對豐度Table 2 Relative abundance of ARGs and MGEs in soil at different sampling points

2.3 ARGs和MGEs的抗性機(jī)制

通過比較分析不同設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤ARGs的抗性機(jī)制,可以清晰顯示出細(xì)胞保護(hù)(cellular protection)、細(xì)胞外排泵(efflux pump)、抗生素失活(antibiotic deactivation)和轉(zhuǎn)座酶移動元件(transposon)、整合酶移動元件(integron)等抗性機(jī)制在各采樣點(diǎn)的數(shù)目,如圖2所示。設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤采樣點(diǎn)主要以細(xì)胞保護(hù)為主要抗性機(jī)制,且不同采樣點(diǎn)的抗性機(jī)制存在不同。新民土壤樣品X的抗性機(jī)制數(shù)量最高,且與其他土壤采樣點(diǎn)相比,該地細(xì)胞保護(hù)、細(xì)胞外排泵的數(shù)量最高,其數(shù)值分別為18、12;遼中土壤樣品L的抗性機(jī)制數(shù)量最少,與其他土壤采樣點(diǎn)相比,該地細(xì)胞外排泵、整合酶移動元件抗性機(jī)制的數(shù)量較少,其數(shù)值分別為9、1。不同設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤采樣點(diǎn)的抗性機(jī)制表現(xiàn)出不同特性,從而反映出不同設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤中抗生素抗性基因的差異。

圖2 不同采樣點(diǎn)土壤中抗性機(jī)制數(shù)目Fig.2 Number analysis of soil resistance in soils at different sampling points

2.4 ARGs與MGEs的相關(guān)性分析

對設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤ARGs和MGEs的相關(guān)性進(jìn)行分析, 如表3所示。土壤中ARGs的相對豐度與MGEs轉(zhuǎn)座酶的相對豐度存在相關(guān)性,其中β-內(nèi)酰胺酶類抗生素抗性基因blaSFO、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗性基因ermB與轉(zhuǎn)座酶IS613,喹諾酮類抗生素抗性基因oprJ、acrA-04與轉(zhuǎn)座酶tnpA-02,氯霉素類抗生素抗性基因cmlA1-01、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗性基因ermC、ermX、磺胺類抗生素抗性基因dfrA1、sul1與轉(zhuǎn)座酶tnpA-03,β-內(nèi)酰胺酶類抗生素抗性基因blaSFO、氯霉素類抗生素抗性基因cfr與轉(zhuǎn)座酶tnpA-04,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素抗性基因ermT-01、ermT-02、ermY、四環(huán)素類抗生素抗性基因tetL-02與轉(zhuǎn)座酶tnpA-07的相對豐度均呈顯著正相關(guān)(p<0.05)。此外,四環(huán)素類抗生素抗性基因tetO-01與轉(zhuǎn)座酶tnpA-02,四環(huán)素類抗生素抗性基因tetX、氯霉素類抗生素抗性基因cmx(A)與轉(zhuǎn)座酶tnpA-03,四環(huán)素類抗生素抗性基因tet(34)、喹諾酮類抗生素抗性基因qnrS與轉(zhuǎn)座酶tnpA-04的相對豐度均呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)。說明MGEs可能會促進(jìn)ARGs在設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤中的遷移和擴(kuò)散。

表3 ARGs與MGEs相對豐度的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of relative abundance of ARGs and MGEs

3 討 論

環(huán)境中抗生素的激增、抗生素抗性基因的擴(kuò)散對人類和牲畜健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。長期施用畜禽糞便有機(jī)肥會增加土壤中抗生素耐藥菌和ARGs的豐度,并提高ARGs的檢出率[14]。研究發(fā)現(xiàn),在施用糞肥的土壤中能檢測到ARGs[15-16]和MGEs[17],一畜禽養(yǎng)殖場中檢測到10種四環(huán)素類ARGs、2種磺胺類ARGs和整合子intl1;Tang等[18]在施用糞肥的土壤中也檢測到tetA、tetG、sulI等ARGs。

本研究在6個土壤樣品中檢測到tetG-02、ermX、ermB、tnpA-05、tnpA-01、intI-1等,且在不同土壤中檢測到的ARGs和MGEs數(shù)目及相對豐度存在不同。研究發(fā)現(xiàn),沈陽蔬菜土壤中能檢測到21種ARGs和6種MGEs,包括14種四環(huán)素類、3種磺胺類、3種氯霉素類、1種氨基糖苷類和4種轉(zhuǎn)座子、2種整合子[19];黃福義等[20]在土壤中檢測到tetD、mexF、tnpA、tp614等ARGs;曾慶濤[21]在農(nóng)田土壤中檢測到tetG、qnrX、sulI等ARGs。韓婉雪等[22]在土壤中檢測到tetW、tetG、sulI等ARGs和intI1,四環(huán)素類及磺胺類ARGs的相對豐度為8.10×10-5～1.55×10-1、1.18×10-6～2.94×10-2;Zhou等[23]在農(nóng)田土壤中檢測到四環(huán)素類和磺胺類ARGs,相對豐度為10-8～10-2、10-2。

本研究中6個土壤樣品中的ARGs與MGEs呈一定的正相關(guān),表明MGEs可能促進(jìn)ARGs在設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤中的遷移擴(kuò)散。何燕等[24]發(fā)現(xiàn)稻田土中ARGs和MGEs的豐度呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),7個稻田土中的tetG、acrA-01、mexE等ARGs與intI1(clinic)、intI-1LC等整合子基因呈顯著正相關(guān);Yao等[25]研究發(fā)現(xiàn)intI與sul1,tnpA03與qnrS、ermA、ermB呈極顯著正相關(guān);張俊華等[13]發(fā)現(xiàn)MGEs與氨基糖苷類、氯霉素類ARGs呈顯著正相關(guān);韓婉雪等[22]研究表明,intI1與tetW、tetG、sulI、sulII呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

4 結(jié) 論

1) 從遼寧省主要設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤集散地的6個采樣點(diǎn)中檢測到50種ARGs和10種MGEs,并且其主要抗性機(jī)制為細(xì)胞保護(hù)。

2) 部分ARGs的相對豐度與MGEs轉(zhuǎn)座酶的相對豐度呈顯著正相關(guān)(p<0.05)和呈極顯著正相關(guān)(p<0.01),說明MGEs可能會促進(jìn)ARGs在設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤中的遷移和擴(kuò)散。