林曉明 許琨琨 蔡振世 莊秋虹 莊慶彬

摘 要：目的：研究探討基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)曲定量方式對餐飲食品中5種生物堿定量結(jié)果的影響，建立一種高效QuEChERS-UPLC-MS/MS方法，一次性同時檢測羊湯、火鍋湯和水煮魚湯3種餐飲食品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5種生物堿的含量。方法：試樣經(jīng)高效QuEChERS前處理提取凈化，通過UPLC-MS/MS正離子MRM模式進行測定。結(jié)果：罌粟堿、那可丁、蒂巴因在羊湯、火鍋湯和水煮魚湯3種餐飲食品中表現(xiàn)為弱的基質(zhì)效應(yīng)抑制，嗎啡、可待因表現(xiàn)為中等基質(zhì)效應(yīng)抑制；高效QuEChERS前處理可以滿足罌粟堿、那可丁、蒂巴因的提取效率要求，而不能滿足嗎啡、可待因的提取效率要求，需要采用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進行校正。采用溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析罌粟堿、那可丁、蒂巴因和溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析嗎啡、可待因，罌粟堿、那可丁、蒂巴因線性范圍為0.20～5.00 ng·mL-1，嗎啡、可待因線性范圍為1.00～25.00 ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)均在0.998以上，方法檢出限位于0.02～1.35 ?g·kg-1，加標(biāo)回收率控制在69%～88%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差處于0.2%～5.5%。結(jié)論：該方法的靈敏度高，準(zhǔn)確度、重復(fù)性較好，操作簡便、快速，能較好地運用于羊湯、火鍋湯以及水煮魚湯等餐飲食品中罌粟殼生物堿殘留量的測定。

關(guān)鍵詞：QuEChERS；UPLC-MS/MS；基質(zhì)效應(yīng)；標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

Abstract： Objective： This study aimed to investigate the influences of matrix effects and standard curve quantitative method on the quantitative results of five alkaloids in catering foods， and to establish a highly efficient QuEChERS-UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of papaverine， noscapine， thebaine， morphine， and codeine in three types of catering foods （lamb soup， hot pot soup， and boiled fish soup）. Method： The samples were extracted and purified using a highly efficient QuEChERS sample preparation procedure， followed by detection through UPLC-MS/MS positive ion MRM mode. Result： Papaverine， noscapine， and thebaine showed weak matrix effects inhibition in the three types of catering foods， while morphine and codeine showed moderate matrix effects inhibition. The highly efficient QuEChERS sample preparation process could meet the extraction efficiency requirements of papaverine， noscapine， and thebaine， but not for morphine and codeine， which required correction with internal standard substances. Quantitative analysis of papaverine， noscapine， and thebaine was conducted using solvent-based external calibration curve method， while morphine and codeine were quantitatively analyzed using solvent-based internal calibration curve method. The linear ranges for papaverine， noscapine， and thebaine were 0.20～5.00 ng·mL-1， while those for morphine and codeine were 1.00～25.00 ng·mL-1. The correlation coefficients were all above 0.998. The limit of detection ranged from 0.02 μg·kg-1 to 1.35 μg·kg-1， and the recoveries were controlled within 69%～88%. The relative standard deviations were between 0.2% and 5.5%. Conclusion： The method is highly sensitive， accurate， reproducible， easy to operate， and fast. It can be well applied to the determination of residual alkaloids in poppy shell in catering foods such as lamb soup， hot pot soup， and boiled fish soup.

Keywords： QuEChERS; UPLC-MS/MS; matrix effect; standard working curve

以罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因等為主要成分[1]的罌粟殼中的多種生物堿可以讓食品增味提鮮，使顧客上癮，讓人嗜睡和性格改變，長期食用會引起精神失常，出現(xiàn)幻覺甚至慢性中毒[2-3]。盡管我國法律明令禁止在食品中添加罌粟殼，有關(guān)部門對在食品中添加罌粟殼的行為采取高壓打擊態(tài)勢，但某些不法商販，為了“回頭客”，利用罌粟殼的成癮特性，將其添加在羊肉湯、火鍋底料、麻辣燙等餐飲食品中，從而增加客流量，嚴(yán)重危害人們的身心健康[4-5]。

目前，在5種生物堿的檢測中，相比以往固相萃取法、氯仿萃取法等前處理方法，QuEChERS前處理方法更快速、便捷、有效，廣泛應(yīng)用于多數(shù)檢測領(lǐng)域，也用于罌粟殼中多種生物堿的檢驗檢測[3，6-7]。筆者發(fā)現(xiàn)不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方式會直接影響最終的定量結(jié)果，基于此對基質(zhì)效應(yīng)和標(biāo)曲定量方式對5種生物堿中的影響展開研究探討，同時建立一種高效QuEChERS-UPLC-MS/MS方法，一次性同時檢測羊湯、火鍋湯和水煮魚湯等多種餐飲食品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5種生物堿含量，以供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

GM200高速磨碎機，Retsch；XSE205DU電子天平，梅特勒托利多儀器有限公司；LPD2500多管旋渦混合儀，萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司；LAB DANCER S25漩渦混勻器，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；Tissuelyser-96LGM多樣品組織研磨儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；3-15離心機，曦瑪離心機（揚州）有限公司；TurboVap LV全自動氮吹儀，Biotage；Triple Quad 5500三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，美國愛博才思公司。

1.2 材料與試劑

樣品：羊湯、火鍋湯、水煮魚湯，均在泉州市區(qū)各小吃店的餐飲食品隨機采購。

試劑：乙腈（默克，色譜純）；甲醇（默克，色譜純）；甲酸（ROE，色譜純）；乙酸銨（Fisher Chemical，色譜純）。鹽酸可待因（中檢院，批號：171203-201808，100 mg）；嗎啡（中檢院，批號：171201-201825，100 mg）；蒂巴因（中檢院，批號：171216-201805，50 mg）；那可?。ㄖ袡z院，批號：171224-201605，100 mg）；鹽酸罌粟堿（中檢院，批號：171214-201906，100 mg）；甲醇中可待因-D3溶液（First Standard?，批號：S107027，100 μg·mL-1）；甲醇中嗎啡-D3溶液（First Standard?，批號：S102043，100 μg·mL-1）。

材料：高效QuEChERS樣品前處理試劑盒[青云化學(xué)科技有限公司，型號：CQ11-3（萃取管+鹽包+凈化管），批號：20230323-004]。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜和質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH HILIC（2.1 mm×150 mm，1.7 ?m）；流動相：A相為含0.1%甲酸的10 mmol·L-1乙酸銨溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫（見表1）。柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：2 ?L。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：ESI（電噴霧離子源），正離子模式采集；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；氣簾氣（CUR）：20 psi；離子化電壓（IS）：5 500 V（正離子模式）；溫度（TEM）：500 ℃；噴霧氣（GS1）：50 psi；輔助加熱氣（GS2）：50 psi；各化合物質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.3.2 對照品及樣品溶液的制備

（1）混合對照品溶液的制備。對照品儲備液：精密稱取嗎啡、鹽酸可待因（以下簡稱可待因）、蒂巴因、那可丁和鹽酸罌粟堿（以下簡稱罌粟堿）對照品適量，分別置于25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成濃度均為100 ?g·mL-1的對照品儲備液。

混合對照品溶液A：精密吸取嗎啡、可待因各1 000 ?L和那可丁、蒂巴因、罌粟堿各200 μL于20 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，得嗎啡、可待因濃度為5 μg·mL-1和那可丁、蒂巴因、罌粟堿濃度為1 ?g·mL-1的混合對照品溶液A。

混合對照品溶液B：精密吸取100 ?L混合對照品溶液A于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混勻，得嗎啡、可待因濃度為50 ng·mL-1和那可丁、蒂巴因、罌粟堿濃度為10 ng·mL-1的混合對照品溶液B。

同位素內(nèi)標(biāo)混合對照品工作溶液（5 ?g·mL-1）：精密吸取嗎啡-D3和可待因-D3（對照品濃度均為100 ?g·mL-1）各1 000 ?L置于20 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得嗎啡-D3和可待因-D3濃度均為5 ?g·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)溶液，備用。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液制備：以乙腈為溶劑，精密吸取混合對照品溶液B適量，逐級稀釋成質(zhì)量濃度為0.20 ng·mL-1、0.50 ng·mL-1、1.00 ng·mL-1、2.00 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1的那可丁、蒂巴因、罌粟堿和質(zhì)量濃度為1.00 ng·mL-1、2.50 ng·mL-1、5.00 ng·mL-1、10.00 ng·mL-1、25.00 ng·mL-1的嗎啡、可待因混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用。

（2）樣品溶液的制備。每種樣品平行稱取2 g（精確至0.01 g），分別置于50 mL CQ11-3萃取管（內(nèi)含NaCl 500 mg）中，加入5 mL水振搖混勻，再加入溶劑乙腈15 mL，渦旋振搖混勻1 min左右，加入CQ11-3鹽包（內(nèi)含MgSO4 5 g和NaAc 2 g），劇烈振蕩1 min，用5 000 r·min-1離心機離心5 min，取上清液8 mL至CQ11-3凈化管（內(nèi)含PSA 300 mg、C18 500 mg和MgSO4 1 500 mg）中，渦旋混勻1 min左右，再經(jīng)5 000 r·min-1離心機離心5 min，移取上清液適量經(jīng)0.22 ?m有機濾膜，按1.3.1方法進樣。

（3）溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制備。取5支10 mL玻璃試管，均加入同位素內(nèi)標(biāo)混合對照品工作溶液（5 ?g·mL-1）20 ?L，再依次加入1 mL相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，復(fù)溶混勻（見表3），過0.22 μm有機濾膜，按1.3.1方法進樣。

（4）基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備。稱取3種空白基質(zhì)樣品各2 g（精確至0.01 g），每種平行6份。同樣品溶液的制備方法進行提取和凈化，得空白基質(zhì)溶液，合并于50 mL塑料離心管，再分別精確移取1 mL置于5支10 mL玻璃試管中，40 ℃水浴中氮氣吹干，均加入同位素內(nèi)標(biāo)混合對照品工作溶液（5 ?g·mL-1）20 ?L，再依次加入1 mL相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，復(fù)溶混勻（見表3），過0.22 μm有機濾膜，按1.3.1方法進樣。

（5）加標(biāo)回收及精密度測試。稱取3種空白基質(zhì)樣品各2 g（精確至0.01 g），每種平行6份。設(shè)置一個濃度水平加標(biāo)回收，分別加入20 ?L混合對照品溶液A和300 ?L同位素內(nèi)標(biāo)混合對照品工作溶液（5 ?g·mL-1），同樣品溶液的制備方法進行提取和凈化，按1.3.1方法進樣。

（6）檢出限、定量限的確定。利用空白基質(zhì)添加5種生物堿目標(biāo)化合物，以3倍信噪比對應(yīng)檢測濃度確定方法檢出限，以10倍信噪比對應(yīng)的檢測濃度確定方法定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍

本實驗方法得出的各目標(biāo)化合物的線性范圍如表4所示，其中罌粟堿、那可丁、蒂巴因線性濃度范圍為0.20～5.00 ng·mL-1，嗎啡、可待因的線性濃度范圍為1.00～25.00 ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)均在0.998以上，說明各目標(biāo)化合物的峰面積與進樣濃度在線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。

2.2 不同基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)分析

按公式（1）分析基質(zhì)效應(yīng)影響，結(jié)果如表5所示。由表5可知，用高效QuEChERS方法處理空白基質(zhì)，5種生物堿均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。其中，罌粟堿、那可丁、蒂巴因在外標(biāo)法定量分析中，3種基質(zhì)中的|ME|≤0.22，基本呈現(xiàn)弱的基質(zhì)效應(yīng)；嗎啡、可待因在外標(biāo)定量和內(nèi)標(biāo)法定量中，3種基質(zhì)中的|ME|均在0.2～0.5，呈現(xiàn)中等基質(zhì)效應(yīng)，同時可以發(fā)現(xiàn)內(nèi)標(biāo)法定量分析加大了這種效應(yīng)趨勢。

式中：ME為基質(zhì)效應(yīng)；A為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；B為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。當(dāng)ME＞0，表明基質(zhì)效應(yīng)增強；ME＜0，表明基質(zhì)效應(yīng)抑制；|ME|=0表示不存在基質(zhì)效應(yīng)；|ME|＜0.2為弱基質(zhì)效應(yīng)；0.2≤|ME|≤0.5為中等基質(zhì)效應(yīng)；|ME|＞0.5為強基質(zhì)效應(yīng)[6]。

2.3 不同標(biāo)曲定量分析加標(biāo)回收率

從表6可知，用溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法和基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析罌粟堿、那可丁、蒂巴因在羊湯、火鍋湯、水煮魚湯中的加標(biāo)回收率情況，回收率均能滿足實驗室質(zhì)量控制規(guī)范，表明該高效QuEChERS前處理方法對罌粟堿、那可丁、蒂巴因3種生物堿的提取效率較好。但可以發(fā)現(xiàn)基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量相較于溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法定量而言，回收率均有所上升，除了罌粟堿和那可丁在水煮魚湯基質(zhì)加標(biāo)中的上升幅度比較大，達到21%和27%，其余上升幅度均不超10%，影響相對有限。其中蒂巴因在火鍋湯基質(zhì)加標(biāo)中的上升幅度最低，僅有1%左右。這與2.2分析的基質(zhì)效應(yīng)抑制相對應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)越弱，兩種標(biāo)曲定量出來的回收率結(jié)果越接近，反之相差越大。由此可見，使用基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量罌粟堿、那可丁、蒂巴因相對準(zhǔn)確，但為了方便快捷，減少基質(zhì)空白前處理過程，參考實驗室質(zhì)量控制規(guī)范要求，由于罌粟堿、那可丁和蒂巴因基質(zhì)效應(yīng)偏弱，可以采取溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析。

用溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法和基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析嗎啡、可待因在羊湯、火鍋湯、水煮魚湯中的加標(biāo)回收率情況，基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量能讓回收率上升幅度在25%～55%，但回收率結(jié)果均不足50%，未能有效滿足實驗室質(zhì)量控制規(guī)范?？梢?，即使嗎啡、可待因在3種基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)影響較大，呈現(xiàn)中等基質(zhì)效應(yīng)，用基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量仍未能滿足要求。而用溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析，嗎啡的回收率在82%～85%，可待因的回收率在85%～87%，均能滿足實驗室質(zhì)量控制規(guī)范。這與嗎啡、可待因在高效QuEChERS前處理過程中損失有著密切聯(lián)系。據(jù)此，筆者提出該前處理方法是影響嗎啡、可待因提取效率的第一影響因素，而基質(zhì)效應(yīng)為次影響因素。為此，采取了用基質(zhì)標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析了加標(biāo)回收情況，結(jié)果是嗎啡回收率范圍在123%～149%，可待因的回收率范圍在140%～149%，這可能是嗎啡-D3、可待因-D3內(nèi)標(biāo)物校正了QuEChERS前處理過程中目標(biāo)化合物的損失（含基質(zhì)效應(yīng)影響的部分）和基質(zhì)標(biāo)曲校正了基質(zhì)效應(yīng)影響的雙重疊加的結(jié)果，偏離了實驗室質(zhì)量控制規(guī)范范圍。由此可以得出，QuEChERS前處理方法是影響嗎啡、可待因提取效率的第一影響因素，基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量對其改善不足，用溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析較為可靠，也相對方便快捷。

2.4 方法學(xué)驗證的結(jié)果分析

按2.3分析，本文針對罌粟堿、那可丁和蒂巴因選取溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析，嗎啡、可待因選取溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析，確定該方法的方法學(xué)參數(shù)的可靠性。從表4可知，罌粟堿、那可丁、蒂巴因線性濃度范圍為0.20～5.00 ng·mL-1，嗎啡、可待因的線性濃度范圍為1.00～25.00 ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)均在0.998以上。從表6可知，5種生物堿在3種基質(zhì)中的定量限和檢出限均較低，在羊湯、火鍋湯、水煮魚湯中的定量限位于0.08～4.50 μg·kg-1，檢出限位于0.02～1.35 μg·kg-1。從表7可知，5種生物堿在羊湯、火鍋湯、水煮魚湯中加標(biāo)回收率在69%～88%，RSD在0.2%～5.5%。由此可見，此方法具有較低的定量限、檢出限，在線性范圍內(nèi)各目標(biāo)化合物的相關(guān)性良好，同時具有較好準(zhǔn)確度和精密度。

3 結(jié)論

本文對比分析了5種生物堿在羊湯、火鍋湯以及水煮魚湯基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)強弱，同時用溶劑外標(biāo)法、基質(zhì)外標(biāo)法、溶劑內(nèi)標(biāo)法、基質(zhì)內(nèi)標(biāo)法4種不同標(biāo)準(zhǔn)工作曲線定量分析加標(biāo)樣品，指出罌粟堿、那可丁和蒂巴因3種生物堿在羊湯、火鍋湯以及水煮魚湯基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)抑制較弱，溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法和基質(zhì)標(biāo)曲外標(biāo)法定量結(jié)果均能滿足實驗室質(zhì)量控制規(guī)范；而嗎啡和可待因2種生物堿在羊湯、火鍋湯以及水煮魚湯基質(zhì)中受到的基質(zhì)效應(yīng)抑制為中等強度，考慮高效QuEChERS前處理是影響嗎啡、可待因提取效率的第一影響因素，而基質(zhì)效應(yīng)為次影響因素，經(jīng)過對比分析只有溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法的定量結(jié)果能滿足實驗室質(zhì)量控制規(guī)范。通過方法學(xué)驗證，結(jié)果表明，可以不考慮不同基質(zhì)對5種生物堿的影響，采用溶劑標(biāo)曲外標(biāo)法定量分析罌粟堿、那可丁、蒂巴因，采用溶劑標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法定量分析嗎啡、可待因，建立一種高效QuEChERS-UPLC-MS/MS方法，一次性同時檢測羊湯、火鍋湯和水煮魚湯3種餐飲食品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5種生物堿的含量。該方法的靈敏度高，準(zhǔn)確度、重復(fù)性較好，操作簡便、快速，可為市場監(jiān)管相關(guān)餐飲食品中罌粟殼生物堿殘留量提供思路。

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基金項目：泉州市科技計劃項目（2021N184S）。

作者簡介：林曉明（1989—），男，福建泉州人，本科，主管藥師。研究方向：食品藥品檢驗。