孫林慧 禚惠榮 師文君 王康琪 張東立 侯少陽(yáng)

摘 要：目的：基于腸桿菌基因間重復(fù)一致序列聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction，ERIC-PCR）），尋找并制備一對(duì)引物探針，靈敏、準(zhǔn)確地從復(fù)雜生境中鑒定副干酪乳桿菌。方法：尋找副干酪乳桿菌HP-B1145的腸桿菌基因間重復(fù)一致序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC）最佳反應(yīng)體系，對(duì)ERIC片段回收純化得到特定條帶及序列結(jié)果，據(jù)此設(shè)計(jì)引物，快速鑒定副干酪乳桿菌。結(jié)果：根據(jù)回收得到的副干酪乳桿菌HP-B1145 ERIC片段，設(shè)計(jì)出了一對(duì)引物探針（1145-S-F：5-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3；1145-S-R：5- CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3）。結(jié)論：根據(jù)引物特異性、準(zhǔn)確性、普適性、含量限度實(shí)驗(yàn)得出，設(shè)計(jì)的引物能準(zhǔn)確靈敏地從復(fù)雜生境中鑒定副干酪乳桿菌。

關(guān)鍵詞：副干酪乳桿菌；腸桿菌基因間重復(fù)一致序列聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（ERIC-PCR）；引物探針；特異性；鑒別

Abstract： Objective： To search for and prepare a pair of primer probes based on ERIC-PCR technology for sensitive and accurate identification of Lactobacillus paracasei from complex habitats. Method： To search for the optimal ERIC reaction system for Lactobacillus paracasei HP-B1145， and obtain specific bands and sequence results through the recovery and purification of ERIC fragments. Based on this， primers were designed to achieve rapid identification of Lactobacillus paracasei. Result： A pair of primer probes （1145-S-F： 5-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3; 1145-S-R： 5- CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3） were designed based on the recovered HP-B1145 ERIC Fragment. Conclusion： Based on the comprehensive experiments of primer specificity， accuracy， universality， and content limit， the designed primers can accurately and sensitively identify Lactobacillus paracasei from complex habitats.

Keywords： Lactobacillus paracasei; enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction （ERIC-PCR）; primer probes; specificity; distinguish

2002年，歐洲食品和飼料菌種協(xié)會(huì)指出，益生菌能對(duì)宿主機(jī)體產(chǎn)生功能性健康益處[1]。作為人類(lèi)腸道微生物群落的一個(gè)組成部分，益生菌有助于維持健康的腸道菌群環(huán)境，調(diào)節(jié)微生物的代謝活動(dòng)[2]。副干酪乳桿菌是益生菌的一種，具有較高的環(huán)境耐受能力，能在宿主腸道內(nèi)分泌胞外多糖，發(fā)揮降血糖作用；能促進(jìn)腸道菌群降膽固醇；能將糖苷型黃酮轉(zhuǎn)化為易被機(jī)體吸收的苷元型黃酮，發(fā)揮輔助降血糖的作用；能產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，抑制病原菌生長(zhǎng)[3-8]。副干酪乳桿菌是一種潛在的功能性益生菌，極具應(yīng)用前景。目前，副干酪乳桿菌已在食品、藥品、調(diào)味品和飼料等產(chǎn)品中發(fā)揮作用，用16S rRNA檢測(cè)副干酪乳桿菌存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、簡(jiǎn)便性差[9-11]等特點(diǎn)。為改進(jìn)傳統(tǒng)方法的劣勢(shì)，人們需要開(kāi)發(fā)一種新型的檢測(cè)技術(shù)。

1990年，SHARPLES等[12]在對(duì)Escherichia coli基因組中tsl基因的3末端區(qū)進(jìn)行分析時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了腸桿菌基因間重復(fù)一致序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC）片段并命名為“基因間重復(fù)單位”（Intergenic Repetitive Unit，IRU）序列。隨后Hulton等[13]也鑒定出相同的重復(fù)序列并命名為ERIC，即腸桿菌基因間保守重復(fù)序列[14]。副干酪乳桿菌是國(guó)內(nèi)外研究熱度較高的一種益生菌，屬于乳桿菌屬的干酪乳桿菌群，具有ERIC序列。腸桿菌基因間重復(fù)一致序列聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction，ERIC-PCR）是利用ERIC序列中的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)的一對(duì)反向引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增，對(duì)微生物菌株的鑒定、分析等研究有較高的參考價(jià)值[15]。該技術(shù)用于微生物學(xué)研究，分析速度快，可供參考的信息量大，克服了純培養(yǎng)的局限，在環(huán)境監(jiān)測(cè)治理、腸道菌群生態(tài)結(jié)構(gòu)研究等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[16]。運(yùn)用ERIC-PCR技術(shù)能大大縮短副干酪乳桿菌的鑒別時(shí)間，為副干酪乳桿菌的研究提供一種新的檢測(cè)思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2K plus Ⅱ DNA Marker、6×DNA Loading Buffer、T載體（T5 Zero Cloning Kit），北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物，蘇州金唯智生物科技有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；2×Taq Master Mix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；卡那霉素，北京索萊寶科技有限公司；Tris、SDS，德國(guó)Sigma公司；溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB），美國(guó)Amresco公司；瓊脂糖，西班牙瓊脂糖；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-75G全自動(dòng)數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-ZFD雙人單面垂直凈化工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Eppendorf Research plus手動(dòng)移液槍?zhuān)聡?guó)艾本股份公司；TS100恒溫混勻儀，杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司；T100 Thermal Cycler PCR儀，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市江南儀器廠；ZF-20D型暗箱三用紫外分析儀，驥輝分析儀器上海有限公司；H1650-W型高速臺(tái)式離心機(jī)，長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA的提取、純化

將從酸菜中分離到的副干酪乳桿菌HP-B1145接種至MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)2 d，采用SDS-堿裂解法[17]提取副干酪乳桿菌HP-B1145的基因組，37 ℃烘25 min后加入50 μL 1×TE溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)

以副干酪乳桿菌HP-B1145為研究對(duì)象，進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，找到最佳ERIC-PCR反應(yīng)條件。以副干酪乳桿菌HP-B1145基因組DNA為模板，進(jìn)行ERIC-PCR，回收、純化，得到基因組目的片段，連接T5載體，送至蘇州金唯智公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，采用Primer Premier 5和Oligo 7軟件進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)。將副干酪乳桿菌HP-B1145 ERIC序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.3 探究引物的特異性

將乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、干酪乳桿菌和大腸桿菌作為引物探針特異性檢驗(yàn)的對(duì)照，分別對(duì)上述菌株及副干酪乳桿菌HP-B1145采用1145-S-F/1145-S-R引物探針進(jìn)行PCR，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.3.4 探究引物的普適性

將副干酪乳桿菌TMPC 46M17、副干酪乳桿菌CD-M-1、副干酪乳桿菌BCRC-16100、副干酪乳桿菌AK508和副干酪乳桿菌KPP3777作為引物探針普適性檢驗(yàn)的對(duì)照，以1145-S-F/1145-S-R為引物，分別對(duì)上述菌株及副干酪乳桿菌HP-B1145進(jìn)行PCR，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.3.5 探究引物能夠檢測(cè)的含量限度

將乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、干酪乳桿菌、大腸桿菌和副干酪乳桿菌HP-B1145混合制成副干酪乳桿菌HP-B1145含量分別為100%（絕對(duì)含量900 ng·mL-1）、70%（絕對(duì)含量630 ng·mL-1）、30%（絕對(duì)含量270 ng·mL-1）、0%（絕對(duì)含量0 ng·mL-1）的混合DNA溶液，以此混合DNA溶液為模板，采用1145-S-F/1145-S-R引物探針進(jìn)行PCR，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.3.6 探究引物能否檢驗(yàn)市售產(chǎn)品中的副干酪乳桿菌

選取3種市售配方中含有副干酪乳桿菌的產(chǎn)品，提取產(chǎn)品基因組DNA，以此為模板，采用1145-S-F/1145-S-R引物探針進(jìn)行PCR，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，探究引物探針是否具有實(shí)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的測(cè)序及引物設(shè)計(jì)

依據(jù)多次實(shí)驗(yàn)探索到的最佳反應(yīng)條件，對(duì)副干酪乳桿菌HP-B1145的基因組DNA進(jìn)行ERIC-PCR，得到多態(tài)性的ERIC片段，膠回收、純化，得一條900 bp左右的DNA條帶。通過(guò)測(cè)序得到DNA序列，設(shè)計(jì)引物探針，該基因片段的序列已上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，接收序列號(hào)為OP681785。設(shè)計(jì)結(jié)果如下：1145-S-F：（5-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3）；1145-S-R：（5- CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3）。引物由蘇州金唯智公司合成，用所設(shè)計(jì)的引物繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。由SnapGene分析可知，所設(shè)計(jì)的引物可擴(kuò)增副干酪乳桿菌HP-B1145的片段長(zhǎng)度為489 bp。

2.2 引物探針具有準(zhǔn)確性

以HP-B1145基因組DNA為模板進(jìn)行PCR（反應(yīng)體系：92～98 ℃預(yù)變性8～12 min，92～98 ℃變性1 min，44～46℃退火35～45 s，65～78 ℃延伸210 s，執(zhí)行30～34個(gè)循環(huán)，16 ℃后延伸）并進(jìn)行瓊脂糖凝膠驗(yàn)證，由圖1可知，引物探針能擴(kuò)增基因組目的片段，表明引物探針具有準(zhǔn)確性與簡(jiǎn)便性。

2.3 特異性

分別提取副干酪乳桿菌HP-B1145、乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌桿菌、干酪乳桿菌和大腸桿菌的基因組DNA，采用1145-S-F/1145-S-R引物探針進(jìn)行PCR。如電泳圖2所示，在眾多菌株中，只有副干酪乳桿菌（1、2號(hào)泳道）擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的基因組目的片段，能被準(zhǔn)確檢出，其他菌株沒(méi)有擴(kuò)增出相應(yīng)的基因組目的片段，證明了引物探針的特異性。

M—2K plus Ⅱ DNA marker；以副干酪乳桿菌HP-B1145基因組DNA為模板，使用引物1145-S-F/1145-S-R。

M為2K plus Ⅱ DNA marker；1到9泳道模板分別為副干酪乳桿菌HP-B1145、乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌桿菌、干酪乳桿菌、大腸桿菌的基因組DNA；1到9泳道使用的引物探針是1145-S-F/1145-S-R。

2.4 普適性

分別提取副干酪乳桿菌HP-B1145、副干酪乳桿菌TMPC 46M17、副干酪乳桿菌CD-M-1、副干酪乳桿菌BCRC-16100、副干酪乳桿菌AK508和副干酪乳桿菌KPP3777的基因組DNA，以1145-S-F/1145-S-R為引物，進(jìn)行PCR，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，引物探針能將副干酪乳桿菌的近緣菌株擴(kuò)增出相應(yīng)的基因組目的片段，能將副干酪乳桿菌HP-B1145及其近緣菌株檢測(cè)出來(lái)，證明了探針的普適性。

2.5 含量限度

將乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、干酪乳桿菌、大腸桿菌和副干酪乳桿菌HP-B1145混合制成副干酪乳桿菌HP-B1145含量分別為100%（絕對(duì)含量900 ng·mL-1）、70%（絕對(duì)含量630 ng·mL-1）、30%（絕對(duì)含量270 ng·mL-1）、3%（絕對(duì)含量27 ng·mL-1）、0%（絕對(duì)含量0 ng·mL-1）的混合DNA溶液，采用1145-S-F/1145-S-R引物探針進(jìn)行PCR，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。結(jié)果如圖4所示，副干酪乳桿菌絕對(duì)含量為27 ng·mL-1時(shí)，運(yùn)用該引物探針可檢測(cè)出，證明該引物探針能在微量DNA存在時(shí)檢出副干酪乳桿菌，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高的特點(diǎn)。

M為2K Plus Ⅱ DNA marker；1、2、3、4、5、6泳道分別以副干酪乳桿菌HP-B1145、TMPC 46M17、CD-M-1、BCRC-16100、AK508、KPP3777 6株副干酪乳桿菌的基因組DNA為模板。1、2、3、4、5、6泳道使用的引物探針是1145-S-F/1145-S-R。

M為2K Plus Ⅱ DNA marker；1泳道為副干酪乳桿菌含量100%（絕對(duì)含量900 ng·mL）的驗(yàn)證、2泳道為副干酪乳桿菌含量70%（絕對(duì)含量630 ng·mL-1）、3泳道為副干酪乳桿菌含量30%（絕對(duì)含量270 ng·mL-1）、4泳道為副干酪乳桿菌含量3%（絕對(duì)含量27 ng·mL-1）、5泳道為副干酪乳桿菌含量0%（絕對(duì)含量0 ng·mL-1）的溶液。1、2、3、4泳道使用的引物探針是1145-S-F/1145-S-R。

2.6 市售產(chǎn)品驗(yàn)證引物的實(shí)用性

選取3種市售配方中含有副干酪乳桿菌的產(chǎn)品，提取產(chǎn)品基因組DNA為模板，采用1145-S-F/1145-S-R引物探針進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。如圖5所示，以選取的3種產(chǎn)品為模板進(jìn)行PCR均能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段。

M為2K Plus Ⅱ DNA marker；1、2、3分別以市售混合益生菌產(chǎn)品一，市售混合益生菌產(chǎn)品二及市售益生菌產(chǎn)品三的基因組DNA為模板；1、2、3泳道使用的引物探針是1145-S-F/1145-S-R。

3 結(jié)論

基于ERIC-PCR技術(shù)獲得副干酪乳桿菌HP-B1145特異性序列，序列信息已上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，接收序列號(hào)為OP681785。設(shè)計(jì)了一對(duì)引物探針，即1145-S-F：（5-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3）和1145-S-R：（5-CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3），比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)該序列在副干酪乳桿菌中具有較高保守性，能通過(guò)簡(jiǎn)單PCR快速、準(zhǔn)確、特異性地從復(fù)雜樣品中檢出副干酪乳桿菌，解決了現(xiàn)有檢測(cè)方法操作復(fù)雜、誤差大、耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題，該引物的設(shè)計(jì)為食品、制藥、生物技術(shù)等領(lǐng)域提供了一種新的檢測(cè)方法。16S rRNA序列測(cè)定結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)鑒別副干酪乳桿菌需3 d才能獲知檢測(cè)結(jié)果，但是運(yùn)用該研究設(shè)計(jì)的引物探針對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，僅在4 h內(nèi)即可完成對(duì)未知菌株中副干酪乳桿菌的鑒定，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可最大程度減小操作過(guò)程的誤差，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

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基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（ZR2022QB146）；菏澤學(xué)院博士基金（XY21BS35）。

作者簡(jiǎn)介：孫林慧（2002—），女，山東聊城人，本科。研究方向：藥食兩用微生物資源的開(kāi)發(fā)和利用。

通信作者：張東立（1983—），男，山東菏澤人，本科，工程師。研究方向：藥品、保健食品研發(fā)及生產(chǎn)質(zhì)量管理。E-mail： donglifl@163.com。