李佳琪 羅昱玥 章興隆 劉義萍 周瑩冰

摘 要：目的：對一起游輪聚集性食源性疾病事件進行病原學(xué)調(diào)查，為預(yù)防食源性疾病事件的發(fā)生提供依據(jù)。方法：對采集的肛拭子、食品標(biāo)本進行病原菌分離、鑒定，對分離出的5株副溶血性弧菌進行血清型鑒定、毒力基因（tlh、tdh、trh）鑒定，脈沖場凝膠電泳分子分型，開展藥敏實驗。結(jié)果：從5例病例肛拭標(biāo)本中分離到副溶血性弧菌，菌株血清型均為O9：K44，所有菌株毒力基因為tlh+tdh+trh-；脈沖場凝膠電泳聚類分析顯示3株同源性為100%，其余2株與這3株的同源性分別為88.89%、83.78%；藥敏試驗顯示5株分離株僅對氨芐西林中度敏感，對氯霉素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、多粘菌素E、厄他培南、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢他啶/阿維巴坦、四環(huán)素、替加環(huán)素、美羅培南、頭孢西丁、環(huán)丙沙星、萘啶酸、阿奇霉素、阿米卡星和鏈霉素均敏感。結(jié)論：引起此次聚集性食源性疾病的病原菌是副溶血性弧菌O9：K44型，相關(guān)部門應(yīng)加強對旅行機構(gòu)餐飲宴席的日常監(jiān)管，預(yù)防類似事件的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：副溶血性弧菌；食源性疾??；脈沖場凝膠電泳；藥敏

Abstract： Objective： To investigate the causes of a clustered foodborne disease event which happened on a cruise ship and provide basis for the prevention and control of similar incidents. Method： Pathogens were isolated and identified from anal swabs and food samples collected， serotype identification， virulence genes （tlh， tdh， trh） identification， molecular typing by pulsed field gel electrophoresis， and drug sensitivity test were carried out for five strains of Vibrio parahaemolyticus isolated. Result： Vibrio parahaemolyticus was isolated from anal swabs of 5 cases. The serotype of all strains was O9：K44， and the virulence gene of all strains was tlh+tdh+trh-. Pulsed field gel electrophoresis cluster analysis showed that the homology of 3 strains was 100%， and the homology of the other 2 strains was 88.89% and 83.78%， respectively. Drug sensitivity tests showed that the 5 isolates were only moderate sensitive to ampicillin， and were sensitive to chloramphenicol， trimethoprim/sulfamethoxazole， polymyxin E， ertabenem， cefotaxime， ceftazidime/avibartam， tetracycline， tegacycline， meropenem， cefoxime， ciprofloxacin， nalidixic acid， azithromycin， amicacin and streptomycin. Conclusion： This incident was a clustered foodborne disease event caused by Vibrio parahaemolyticus serotype O9：K44， the relevant departments should strengthen monitoring and inspection of the food safety of cruise ship， so as to avoid the occurrence of foodborne diseases.

Keywords： Vibrio parahaemolyticus; foodborne disease; pulsed field gel electrophoresis; drug sensitivity

副溶血性弧菌是一類革蘭氏陰性無芽孢桿菌，具有嗜鹽性，可引起人類多種不同疾病，如敗血癥、急性胃腸炎、傷口感染等[1]。副溶血性弧菌最早于1950年從日本1例食物中毒的病人糞便中初次分離得到，是最常見的食源性致病菌之一，在近海岸的海水、海產(chǎn)品、海底沉積物中廣泛存在。由于海產(chǎn)品在運輸和銷售中會交叉污染，導(dǎo)致副溶血性弧菌在淡水產(chǎn)品中也被大量檢出。人們攝入被副溶血性弧菌污染的食品會引發(fā)食物中毒，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉和發(fā)燒等典型急性胃腸炎反應(yīng)。副溶血性弧菌是細菌性食物中毒事件中的重要病原體。2021年4月18日，渝中區(qū)疾病預(yù)防控制中心接到某醫(yī)院電話報告稱“某游輪出現(xiàn)10余名疑似食物中毒病人”，立即趕往醫(yī)院與游輪現(xiàn)場進行流行病學(xué)調(diào)查，采集肛拭子，留樣食品進行檢測。根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果、實驗室檢測結(jié)果綜合研判，認為本次事件是一起由副溶血性弧菌引起的食源性聚集事件。為進一步了解陽性菌株的病原學(xué)特征以及各菌株之間的相關(guān)性，本研究對分離的副溶血弧菌進行血清學(xué)鑒定、實時熒光PCR鑒定毒力基因、脈沖場凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）分子分型和藥敏試驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

顯色培養(yǎng)基，科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司；其余培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；副溶血性弧菌血清，日本生研公司；病毒核酸提取試劑盒（磁珠法），江蘇碩世生物科技有限公司；諾如病毒GⅠ/GⅡ雙重?zé)晒釶CR檢測試劑盒、食源性致病菌核酸多重實時熒光PCR檢測試劑盒、副溶血性弧菌（tdh、trh、tlh）三重核酸檢測試劑盒，北京卓誠惠生生物科技有限公司；VITEK 2 Compact GN鑒定卡，法國生物梅里埃股份有限公司；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、NotⅠ，日本TaKaRa生物工程有限公司；瓊脂糖SeaKem Gold Agarose，瑞士LONZA；蛋白酶K，北京索萊寶科技有限公司；革蘭陰性菌藥敏檢測卡（CHNENF），賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

SSNP-9600A全自動核酸提取儀，江蘇碩世生物科技有限公司；VITEK 2 Compact全自動微生物生化鑒定儀，法國生物梅里埃股份有限公司；CFX96實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；CHEF Mapper脈沖場凝膠電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品來源

采集樣品28件，其中病例肛拭標(biāo)本13件，留樣食品15份，病例肛拭標(biāo)本一式兩份，分別存放于Cary-Blair運送培養(yǎng)基和病毒采樣液中，及時送至實驗室檢測。

1.3.2 病原菌的分離鑒定

對采集樣品進行諾如病毒和食源性致病菌實時熒光PCR檢測，按照國家標(biāo)準(zhǔn)對沙門氏菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌和致瀉性大腸埃希氏菌等病原菌進行增菌分離培養(yǎng)。

1.3.3 血清學(xué)試驗

取新鮮分離培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌苔至含3%氯化鈉的5%甘油溶液中，研磨乳化均勻，121 ℃高壓1 h，4 000 r·min-1離心15 min，吸取上清液，加入等體積的生理鹽水重懸，玻片凝集檢測O抗原，生理鹽水作為自凝對照。取菌苔與含3%氯化鈉的5%甘油溶液制備濃厚的菌懸液，玻片凝集檢測K抗原，3%氯化鈉溶液作為自凝對照。

1.3.4 毒力基因鑒定

用接種環(huán)刮取新鮮培養(yǎng)的菌苔于100 μL DNA裂解液中研磨均勻，100 ℃水浴10 min后冰上放置5 min，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液進行實時熒光PCR檢測毒力基因（tdh、trh、tlh）。

1.3.5 脈沖場凝膠電泳分型

分離出的5株副溶血性弧菌以Not Ⅰ酶切，沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812用限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ酶切，作為分子量標(biāo)（marker），電泳時間18 h，脈沖時間10～35 s，以Gelred染膠后使用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.3.6 藥敏試驗

按照微量肉湯稀釋法對分離的病原菌進行藥敏試驗，采用定制的商品化MIC藥敏板CHNENF進行藥敏測試，含氨芐西林、頭孢西丁、美羅培南、環(huán)丙沙星、氯霉素等17種抗菌藥物，大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922作為本次試驗的質(zhì)量控制菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原體檢測

經(jīng)實時熒光PCR檢測，所有樣品諾如病毒檢測均為陰性；食源性致病菌核酸多重實時熒光PCR檢測出5件病例肛拭樣品弧菌陽性，其余樣品均為陰性。28件樣品進行分離培養(yǎng)，熒光PCR檢測為弧菌陽性的5件樣品均分離到副溶血性弧菌，未檢出其他致病菌，其余8件肛拭樣品和15件留樣食品均未檢出致病菌。

2.2 血清學(xué)試驗

分離到的5株副溶血性弧菌均為O9：K44血清型，結(jié)果一致。

2.3 毒力基因鑒定

對分離到的5株副溶血性弧菌采用實時熒光PCR方法檢測毒力基因，5株副溶血性弧菌均為tdh、tlh基因陽性，trh基因陰性，結(jié)果一致。

2.4 PFGE分子分型

用限制性內(nèi)切酶NotⅠ對5株副溶血性弧菌基因組核酸酶切，進行脈沖場凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，YZFX2021-004、YZFX2021-005、YZFX2021-007具有完全相同的帶型，另外2株稍有不同。如圖2所示，PFGE分子分型聚類分析發(fā)現(xiàn)YZFX2021-004、YZFX2021-005、YZFX2021-007的同源性為100%，YZFX2021-006和YZFX2021-003與這3株的同源性為88.89%、83.78%。

1、5為標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812（marker），2—4、6—7分別為分離到的5株副溶血性弧菌YZFX2021-003～YZFX2021-007。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

本次試驗質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922藥敏結(jié)果在質(zhì)控范圍內(nèi)，表明試驗結(jié)果有效。結(jié)果判定參照《疾控系統(tǒng)藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)-2022修訂》，藥敏結(jié)果顯示5株菌株對氨芐西林中度敏感，對氯霉素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、多粘菌素 E、厄他培南、美羅培南、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢他啶/阿維巴坦、四環(huán)素、替加環(huán)素、頭孢西丁、環(huán)丙沙星、萘啶酸、阿奇霉素、阿米卡星、鏈霉素均敏感，無多重耐藥表型，5株菌株結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在沿海地區(qū)時有發(fā)生，在微生物性食物中毒事件中高居首位，發(fā)生頻次、人群暴露規(guī)模均表現(xiàn)出明顯的上升趨勢。海產(chǎn)品是副溶血性弧菌食源性污染的主要媒介。隨著交通運輸業(yè)的發(fā)展和內(nèi)陸居民飲食結(jié)構(gòu)的變化，我國微生物性食物中毒的致病因子逐步發(fā)生了變化。研究表明，在全國范圍內(nèi)，副溶血性弧菌導(dǎo)致的食物中毒事件數(shù)量已升至第二位，僅次于沙門氏菌[2]。實驗室在5名病例肛拭子中檢出血清型一致的副溶血性弧菌O9：K44型，雖然未在留樣食物中檢出該菌，同時由于游輪方食品留樣不全，不排除游客食用了游船之外的食品，可能存在攜帶致病菌食物漏檢的情況。盡管未確定病因食品，但根據(jù)現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查、患者的臨床表現(xiàn)、實驗室檢測結(jié)果綜合分析，判定該事件為一起由副溶血性弧菌引起的聚集性、食源性疾病事件。

實驗室通過熒光PCR快速篩查和常規(guī)分離培養(yǎng)鑒定，迅速獲得了副溶血性弧菌核酸陽性結(jié)果，這一結(jié)論在后續(xù)的分離培養(yǎng)中得到證實，對于事件的及時處理和控制起到了關(guān)鍵作用。在突發(fā)性食源性疾病事件調(diào)查中，應(yīng)用快速檢測方法對于及時確定病原體、開展后續(xù)事件處置工作具有重要的意義。

副溶血性弧菌的致病性主要由毒力因子造成，毒力因子包括溶血素類、侵襲因子、尿素酶等。溶血素類包括耐熱直接溶血素（Thermostable Direct Hemolysin，TDH）和耐熱相關(guān)溶血素（Tdh-elated Hemolysin，TRH），二者作用于宿主細胞表面，可破壞細胞的完整性[3]。副溶血性弧菌還可產(chǎn)生不耐熱溶血素（Thermolabile Hemolysin，TLH），現(xiàn)普遍認為tlh基因是副溶血性弧菌的特異性基因，在所有分離株中均可檢測到。本實驗室對分離培養(yǎng)出來的5株副溶血性弧菌進行tdh、trh、tlh基因檢測，發(fā)現(xiàn)5株菌株均為tdh和tlh基因陽性，trh基因陰性。

PFGE是目前廣泛應(yīng)用于食源性致病菌分子溯源的重要方法[4-5]。根據(jù)公認的判定標(biāo)準(zhǔn)[6]，具有85%以上相同條帶的菌株可認為是相同菌株。在本次事件中，分離到的5株副溶血性弧菌有4株菌株經(jīng)PFGE聚類分析發(fā)現(xiàn)具有85%以上的相似性，另一菌株帶型與這4株稍有不同，提示本次事件中可能存在不同的污染源，但未從食品中分離出相關(guān)菌株，不能判斷本次事件的病因食品。

分離的5株菌株對氨芐西林為中度敏感，對頭孢他啶、頭孢噻肟等其他16種藥物均敏感，與重慶市萬州區(qū)報道[7]的藥敏結(jié)果相同，與廣州市、浙江省等地報道[8-12]的分離菌株對氨芐西林耐藥情況不同，與北京市、遼寧省等地[13-14]副溶血性弧菌的耐藥情況有顯著不同，表明耐藥性除了受血清型、來源背景的影響，還具有地域差異。水產(chǎn)品養(yǎng)殖應(yīng)規(guī)范、合理使用抗生素，避免副溶血性弧菌的耐藥性變異，降低多重耐藥的風(fēng)險。對腹瀉病人進行抗生素治療時，應(yīng)結(jié)合藥敏試驗結(jié)果，確保臨床合理用藥，降低耐藥菌株的產(chǎn)生。

游輪旅游具有旅程時間較長、人員聚集程度較高等特點，相關(guān)部門應(yīng)加強對旅行機構(gòu)餐飲宴席等重點領(lǐng)域的日常監(jiān)管，強化食品安全知識的宣傳培訓(xùn)，提高食品相關(guān)從業(yè)人員的食品安全意識和個人衛(wèi)生意識，規(guī)范食品制作流程，注意生熟分開，并按要求做好食品的留樣，減少食源性疾病的發(fā)生。

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作者簡介：李佳琪（1990—），女，土家族，重慶人，本科，主管技師。研究方向：微生物檢驗。

通信作者：周瑩冰（1975—），女，四川瀘州人，博士，副主任技師。研究方向：微生物檢驗。E-mail： 377616489@qq.com。