張伶燕

（ 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)中心國(guó)家人類疾病動(dòng)物模型資源庫(kù) 北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，北京 100021 ）

小鼠是試驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物，易繁殖和飼養(yǎng)，可應(yīng)用于各類生理、病理、藥理以及一些行為學(xué)試驗(yàn)[1-4]，其中帶有疾病模型的小鼠在疾病相關(guān)研究中尤為重要。隨著醫(yī)學(xué)研究不斷深入、發(fā)展，學(xué)界對(duì)小鼠的繁殖質(zhì)量要求愈發(fā)重視，一些遺傳背景較復(fù)雜且應(yīng)用價(jià)值較高的品系的繁殖保種技術(shù)也越來(lái)越重要，保證小鼠質(zhì)量控制合格以及基因穩(wěn)定在小鼠應(yīng)用中起到至關(guān)重要的作用。在飼養(yǎng)繁殖過(guò)程中，近交系小鼠由于其遺傳均一性以及對(duì)各種反應(yīng)的一致性、可再觀性、敏感性等均較好的特點(diǎn)，而廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域的各項(xiàng)研究中[5-6]。但近交系因長(zhǎng)期近交導(dǎo)致的近交衰退問(wèn)題尚無(wú)很好的解決辦法，尤其一些疾病模型的品系由于其自發(fā)疾病或其他因素影響，極有可能出現(xiàn)斷種不繁殖的問(wèn)題。因此，能夠持續(xù)性傳代成為繁殖保種過(guò)程中亟須解決的重要問(wèn)題。文章主要針對(duì)疾病模型的近交系小鼠品系繁殖保種方法和采取措施進(jìn)行概述，以期為疾病模型近交系小鼠品系的穩(wěn)定遺傳和可持續(xù)繁殖以及動(dòng)物醫(yī)學(xué)臨床研究提供參考。

1 飼養(yǎng)條件

試驗(yàn)動(dòng)物的繁殖性能與動(dòng)物種系、環(huán)境條件、營(yíng)養(yǎng)水平等諸多因素有關(guān)[7]，試驗(yàn)動(dòng)物房作為繁育、飼養(yǎng)、開(kāi)展試驗(yàn)的地點(diǎn)，此處的控制不僅關(guān)系到試驗(yàn)動(dòng)物的福利及健康，更是保障試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性和可重復(fù)性的關(guān)鍵，對(duì)生命科學(xué)研究的結(jié)果和水平具有深遠(yuǎn)影響[8-11]。環(huán)境控制是試驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵因素之一[12]，也是試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)控制中最基礎(chǔ)的環(huán)節(jié)，是保證試驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的前提條件。

1.1 飼養(yǎng)環(huán)境

試驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于隔離器內(nèi)，獨(dú)立送排風(fēng)系統(tǒng)過(guò)濾空氣后[6]進(jìn)入隔離器內(nèi)（空氣為初、中、高效三級(jí)過(guò)濾）。溫度20～26 ℃，若溫度超過(guò)30 ℃會(huì)造成雄鼠睪丸萎縮，精子生成能力下降，雌鼠性周期紊亂，泌乳能力下降或拒乳[13]；濕度40%～70%；光照：定時(shí)設(shè)定小鼠光照時(shí)間，每天光照12 h、黑暗12 h。

籠具和墊料：墊料選擇刨花木屑經(jīng)132 ℃、35 min 真空蒸汽高壓滅菌。每周更換飼養(yǎng)籠具和墊料，洗刷后均經(jīng)高溫高壓滅菌[14]。

豐容玩具：選擇可進(jìn)行高壓滅菌的隧道玩具，每2個(gè)月重新清洗并進(jìn)行高壓滅菌后使用。

1.2 飼料與飲水

本試驗(yàn)選擇中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所常用飼料A 和免疫缺陷飼料B（高蛋白、高脂肪），依據(jù)GB 14924.3—2010[15]方法測(cè)定其營(yíng)養(yǎng)水平，結(jié)果見(jiàn)表1。兩種飼料分別來(lái)自北京兩家試驗(yàn)小鼠飼料生產(chǎn)廠，許可證號(hào)分別為SCXK（京）2019-0003 和SCXK（京）2019-0010。試驗(yàn)鼠飲用水為酸化水pH 值2.5～3.0，121 ℃、35 min 真空蒸汽高壓滅菌，配置方法為1 mL 36%～38%鹽酸配15 L水。

表1 試驗(yàn)小鼠飼料營(yíng)養(yǎng)水平Tab.1 Feed nutrient levels of experimental mice 單位：g/kg

2 飼養(yǎng)方法

2.1 飼養(yǎng)管理

每周一至周三換窩，換窩完成后擦拭隔離器內(nèi)表面附著粉塵以及手套附著的臟墊料等，將隔離器內(nèi)物品碼放整齊。每天觀察小鼠繁殖情況，在繁殖卡片上記錄小鼠配種、新生、離乳、死亡、淘汰等數(shù)據(jù)，卡片記錄信息包括品系名稱、飼養(yǎng)編號(hào)、交配動(dòng)物編號(hào)、出生日期、配種日期、代數(shù)、胎數(shù)以及父母編號(hào)等。新生仔鼠記錄胎數(shù)、出生日期、產(chǎn)仔數(shù)、離乳雌雄數(shù)、仔鼠編號(hào)以及離乳后飼養(yǎng)籠號(hào)。此外，還應(yīng)觀察每盒小鼠狀態(tài)，包括背毛是否順滑、有無(wú)腫瘤、創(chuàng)傷、爛尾、精神狀態(tài)、活動(dòng)度等，出現(xiàn)異常狀態(tài)的小鼠及時(shí)淘汰處理。

2.2 近交系小鼠繁殖

小鼠8 周齡時(shí)達(dá)到性成熟[16]進(jìn)行配種，嚴(yán)格遵循同胞交配，繁殖鼠采用雌雄長(zhǎng)期同居方法（公母比例為1∶1）[17]，繁育困難品系同窩很難形成一對(duì)繁殖對(duì)可選擇近親。選擇健壯、毛色順滑，無(wú)創(chuàng)傷、無(wú)遺傳缺陷的小鼠，無(wú)折尾、斷尾等情況留兩條繁殖線進(jìn)行同時(shí)傳代，留種選取2～4 胎。同時(shí)考慮在對(duì)其繁殖力無(wú)影響或影響較小的情況下，盡可能選擇胎次多的仔鼠育種[18]。每條繁殖線5 對(duì)繁殖對(duì)以上，留雌雄比例好的后備種，如可形成2∶2、3∶3、4∶4的繁殖對(duì)。若出現(xiàn)一條繁殖線無(wú)法傳代的情況，可從另一條繁殖線進(jìn)行再次分化成兩條繁殖線傳代。

2.3 近交系小鼠保種

采用修飾平行線法，分為上下兩條平行繁殖線。引種品系為1對(duì)種鼠，動(dòng)物繁殖過(guò)程中原始引種第一交配對(duì)繁殖后，選留2 或4 對(duì)種鼠，上下兩條線各1 或2 對(duì)種鼠分別選種傳代。若引種品系為2對(duì)及以上種鼠繁殖過(guò)程中，原始引種隨機(jī)分成2條線分別繁殖。根據(jù)生殖能力系數(shù)=(總離乳數(shù)×7)/生產(chǎn)總天數(shù)，統(tǒng)計(jì)每條線綜合平均生殖能力系數(shù)，生產(chǎn)總數(shù)從同居配種當(dāng)日開(kāi)始計(jì)算，根據(jù)Festing 設(shè)計(jì)的6代傳代法，繁殖代數(shù)以6代計(jì)，即每代上溯6代，從上溯6 代的分支中選擇一個(gè)分支向下傳遞，選擇計(jì)算平均生殖能力系數(shù)并根據(jù)其值判斷[19]，見(jiàn)圖1。

圖1 近交系小鼠繁殖譜系Fig.1 Breeding pedigree of inbred mice

支線1 平均生殖能力系數(shù)=（0.90+0.60+1.10+…+0.76）/11=0.66；支線2 平均生殖能力系數(shù)=0.30+0.47+0.89+…+0.80=0.42。

通過(guò)計(jì)算可知，支線1 的平均生殖能力系數(shù)高于支線2，故選擇支線1進(jìn)行傳代。若突然出現(xiàn)過(guò)高的繁殖能力且比較持續(xù)，應(yīng)懷疑品系是否出現(xiàn)污染情況，及時(shí)檢測(cè)遺傳位點(diǎn)是否一致。

2.4 小鼠淘汰（針對(duì)繁育好且穩(wěn)定的品系）

2.4.1 老種淘汰

8 月齡以上小鼠一般生6 胎左右可進(jìn)行淘汰，替換為年輕繁殖力旺盛的小鼠，以保證鼠群的健康以及保持較高生產(chǎn)率。每條線至少有2代小鼠（即父代、子代），有足夠空間可留3代再進(jìn)行更新?lián)Q代淘老種。

2.4.2 不繁育種子對(duì)淘汰

配種后1～2月未發(fā)生妊娠或無(wú)仔鼠出生，可進(jìn)行同胞間調(diào)種，若調(diào)種后1～2月仍未出現(xiàn)妊娠或生仔，表明小鼠不孕不育，需進(jìn)行淘汰。

2.4.3 根據(jù)動(dòng)物福利選擇性淘汰

當(dāng)動(dòng)物出現(xiàn)體重下降、消瘦；無(wú)法控制的疼痛；腫瘤過(guò)度增長(zhǎng)或腹水；持續(xù)性倦怠伴隨背毛粗糙雜亂，無(wú)光澤、弓背；異常中樞神經(jīng)反應(yīng)（抽搐、顫抖、歪頭、癱瘓）；影響進(jìn)食和飲水等癥狀時(shí)，根據(jù)小鼠疼痛評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)打分，判斷是否淘汰，評(píng)分累計(jì)3分及以上直接淘汰。小鼠疼痛評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2[20]。

表2 小鼠疼痛評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Pain evaluation criteria of mice

3 針對(duì)繁育中出現(xiàn)問(wèn)題的調(diào)整措施

由于疾病模型的近交系小鼠在繁育過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)多種情況導(dǎo)致繁育困難，因此，根據(jù)每個(gè)品系繁殖問(wèn)題進(jìn)行針對(duì)性的調(diào)整和總結(jié)，主要分為以下幾種情況。

3.1 雌鼠多發(fā)疾病導(dǎo)致繁殖障礙或死亡

保留6～10對(duì)繁殖對(duì)，后備種4～6對(duì)左右即可。但對(duì)于雌鼠多發(fā)疾病的品系小鼠需要保證繁殖對(duì)12對(duì)以上，后備種至少10對(duì)，保種空間足夠的情況下留3～5只雌鼠用于繁殖障礙或死亡后進(jìn)行替換。

3.2 母鼠食仔、拒絕哺乳品系

針對(duì)母鼠食仔、拒絕哺乳品系可補(bǔ)充葵花籽、繁殖果凍。孕鼠受驚也會(huì)導(dǎo)致食仔和拒絕哺乳的現(xiàn)象[21]（見(jiàn)圖2），生產(chǎn)前后2～3 d 避免人為干擾。若發(fā)現(xiàn)有食仔或啃食仔鼠現(xiàn)象，應(yīng)及時(shí)取出死亡仔鼠，以免血腥味刺激母鼠進(jìn)一步吃仔。放入豐容玩具以增加母鼠安全感，在飼養(yǎng)過(guò)程中可發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)后母鼠多將幼仔放在玩具中，可增加其安全感，提升小鼠離乳率，減少食仔現(xiàn)象。

圖2 因母鼠拒絕哺乳導(dǎo)致新生小鼠死亡Fig.2 Newborn mice died when their mothers refused to breastfeed

3.3 攻擊性強(qiáng)小鼠

由于小鼠品系野性較強(qiáng)、好斗，配種后甚至出現(xiàn)小鼠打斗撕咬致死的情況。打斗情況不能緩解時(shí)，挑出最強(qiáng)者采取單籠飼養(yǎng)。但單籠飼養(yǎng)不符合3R 原則，可放置坐窩紙或豐容玩具[22]。此外，針對(duì)打斗嚴(yán)重的品系采取離乳后雌雄即開(kāi)始共同飼養(yǎng)至配種。據(jù)觀察，個(gè)別品系由于攻擊性過(guò)強(qiáng)，至配種年齡再進(jìn)行合籠時(shí)極易出現(xiàn)追逐打斗情況，采用離乳后雌雄仔鼠同窩的方法可有效減少配種后打斗現(xiàn)象，提升雌鼠受孕率。每天觀察小鼠情況，一旦發(fā)現(xiàn)鼠籠中有撕咬打斗現(xiàn)象，除了單獨(dú)隔離最強(qiáng)者外，輕微受傷個(gè)體每天用碘伏消毒，一般5～7 d可痊愈；若撕咬傷口嚴(yán)重?zé)o法痊愈，應(yīng)予以剔除。此外，應(yīng)避免頻繁更換試驗(yàn)人員，以降低不確定因素對(duì)小鼠的刺激[23]。

3.4 妊娠母鼠

妊娠母鼠腹部明顯膨大或見(jiàn)陰道口濕潤(rùn)張開(kāi)，表明即將生產(chǎn)（見(jiàn)圖3），此時(shí)進(jìn)行適當(dāng)遮光處理，減少打擾。若有必要可提前將母鼠單獨(dú)飼養(yǎng)并放置豐容玩具，并適量補(bǔ)充雞蛋等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

圖3 妊娠母鼠及豐容玩具Fig.3 Pregnant female rats and toys

3.5 新生仔鼠

仔鼠出生第1 d 勤觀察仔鼠狀態(tài)，觀察胃部是否出現(xiàn)奶斑，見(jiàn)圖4。有奶斑即為帶仔，并減少打擾；仔鼠無(wú)奶斑且身上附著墊料、黏污，四處散落分布，沒(méi)有活力，表明母鼠不帶仔，此時(shí)應(yīng)及時(shí)采取代乳。

圖4 新生仔鼠狀態(tài)觀察Fig.4 Observation of neonatal rat status

3.6 配種后不繁殖的小鼠

在設(shè)繁育對(duì)的同時(shí)檢查雄鼠的生殖能力。選擇1只其他品系的雌鼠作為測(cè)試鼠（不同毛色，如C57、ICR等品系）放入繁育對(duì)的籠具內(nèi)，若3周后2只雌鼠均未受孕，則認(rèn)為該雄鼠不育，需更換雄鼠。若本品系雄鼠數(shù)量不足，可將雌鼠與其父本交配。若繁育對(duì)的雄鼠可育，配種后3周未見(jiàn)雌鼠妊娠，對(duì)雌鼠進(jìn)行超數(shù)排卵。首先將雌鼠取出單獨(dú)飼養(yǎng)1 周，觀察是否出現(xiàn)妊娠，若未發(fā)生妊娠則腹腔注射5 U 孕馬血清促性腺激素，46～48 h 后注射5 U 人絨毛膜促性腺激素，之后與雄鼠合籠。若超數(shù)排卵的雌鼠合籠3周后仍未妊娠，則認(rèn)為該雌鼠不育，需更換雌鼠。

3.7 對(duì)營(yíng)養(yǎng)具有特殊需求的小鼠

3.7.1 肥胖小鼠

有研究表明，高脂肪日糧對(duì)血糖的影響呈劑量相關(guān)，并可能增加體內(nèi)對(duì)胰島素的需求[24]。胰島素不受控制的產(chǎn)生可能促進(jìn)脂肪合成，因此控制小鼠脂肪及糖分?jǐn)z入是控制小鼠體重的關(guān)鍵。糖尿病導(dǎo)致的肥胖小鼠體長(zhǎng)、體重明顯大于一般小鼠，且多繁殖1～2胎便不再繁殖。針對(duì)肥胖小鼠，應(yīng)將其調(diào)整到6周齡配種；日常飼喂維持飼料保證其基本生長(zhǎng)維持所需即可，維持飼料增加了纖維含量并降低了能量，減少肥胖小鼠能量攝入以控制體重；還可飼喂二甲雙胍緩釋片300～400 mg/L溶于飲水，控制其因2型糖尿病導(dǎo)致的過(guò)度肥胖，還可明顯提升經(jīng)產(chǎn)母鼠的胎次，從而提升整體小鼠品系的繁殖性能。

3.7.2 高蛋白、脂肪需求小鼠

在飼養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，一些小鼠飼喂免疫缺陷飼料（高蛋白、高脂肪）后產(chǎn)仔數(shù)明顯增加，且毛發(fā)更順滑。針對(duì)這些小鼠可飼喂前文中的飼料B（高蛋白、高脂肪），增加小鼠產(chǎn)仔數(shù)量從而提升其繁殖性能。

4 討論

與其他近交系小鼠相比，疾病模型近交系小鼠繁殖更為困難，難點(diǎn)主要在于需要克服其因長(zhǎng)期近交導(dǎo)致的近交衰退和自身疾病原因?qū)е碌姆敝沉Σ钌踔敛环敝车葐?wèn)題。試驗(yàn)小鼠均為人工飼養(yǎng)，可通過(guò)人為方法控制其繁殖[25]。因此，掌握品系繁殖性能，再根據(jù)品系繁殖需要制定合理的繁育措施，方可更具有針對(duì)性地提升小鼠的繁殖能力。

通過(guò)本文中提出的措施調(diào)整，可觀察到一些繁殖困難的疾病模型小鼠出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，可以繼續(xù)傳代。試驗(yàn)動(dòng)物飼料中蛋白質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量偏低，易導(dǎo)致試驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體偏小、體重偏輕，影響試驗(yàn)動(dòng)物的生理生化指標(biāo)，進(jìn)而對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物造成不利影響[26]。有研究表明，在飼養(yǎng)過(guò)程中，飼料是保證試驗(yàn)小鼠正常生長(zhǎng)繁殖的前提，特別是蛋白質(zhì)和脂肪的含量對(duì)于小鼠的生長(zhǎng)繁殖具有極其重要的影響[27]，合理選擇試驗(yàn)動(dòng)物飼料關(guān)系到試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)的質(zhì)量以及研究的科學(xué)性[28]。

有些小鼠品系通過(guò)調(diào)整飼喂飼料B（高蛋白、高脂肪）可提升小鼠產(chǎn)仔數(shù)量，提升小鼠繁育性能，表明一些品系對(duì)蛋白和脂肪需求更高。通過(guò)對(duì)妊娠母鼠的特殊關(guān)照以及適當(dāng)增加一些豐容玩具以供其躲藏，發(fā)現(xiàn)母鼠的受孕率、仔鼠離乳率和孕鼠帶仔能力均有所提升。肥胖小鼠通過(guò)飼喂維持飼料和二甲雙胍緩釋片等措施，可有效控制體重，并通過(guò)提升其產(chǎn)仔量和經(jīng)產(chǎn)胎次提升小鼠繁殖性能，使小鼠穩(wěn)定傳代。但也不可過(guò)度限制營(yíng)養(yǎng)，尤其是妊娠期、哺乳期母鼠，否則容易因營(yíng)養(yǎng)不足而出現(xiàn)食仔現(xiàn)象。

5 結(jié)論

綜上所述，疾病模型近交系小鼠在繁殖保種過(guò)程中會(huì)遇到很多問(wèn)題，也需要飼養(yǎng)人員更加細(xì)心的照料和觀察，結(jié)合科學(xué)規(guī)范的管理與飼養(yǎng)實(shí)踐中不斷完善的繁殖措施方可更好地維持和挽救小鼠品系，使其穩(wěn)定繁殖。

但隨著時(shí)間延續(xù)，常規(guī)活體保種方法的劣勢(shì)逐漸顯現(xiàn)，而建立胚胎冷凍保存技術(shù)體系可防止遺傳變異和斷種、斷線，并有效解決近交系小鼠生殖力低下等問(wèn)題。今后可進(jìn)行疾病模型近交系小鼠活體保種并結(jié)合冷凍胚胎保種的相關(guān)研究與實(shí)踐，以期為疾病模型近交系小鼠品系的穩(wěn)定遺傳和可持續(xù)繁殖以及進(jìn)一步開(kāi)展動(dòng)物醫(yī)學(xué)臨床研究奠定基礎(chǔ)。